Download Génmanipuláció

The Human Genome Project
A humán gén projekt
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml
Február 2001: Humán genom jelentős része kész
Június, 2004
Január, 2005
Public HGP
Celera Genomics
Kiket szekvenáltak meg?


Celera: 21 kevert etnikumú donor (kor, nem
önmeghatározott etnikum); 130-130 ml vér; a
férfiaktól 5 adag sperma 6 hét alatt. 2 férfit és
3 nőt választottak ki: 1 afrikai, 1 kínai, 1 spanyolmexikói, 2 kaukázusi (szempontok: diverzitás,
minőség).
HGP 2 centrum gyűjtötte a donorokat, hasonló
elvek alapján
Milyen információkat nyújt a
humán genom szekevenciája?
A számok alapján
• Három milliárd bázist tartalmaz(A, C, T, and G).
• Egy átlagos gén 3000 bazisból áll, a méret változó, a leghosszabb humán gén a
dystrophin 2.4 millió bázissal.
• Az összes gének száma 30,000—sokkal kevesebb mint az előzetes becslés
80,000 -140,000.
• 99.9%-a az összes nukleotidnak pontosan ugyanaz minden emberben.
• A gének 50%-nak ismeretlen a funkciója.
http://doegenomes.org
U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003
A humán genom tulajdonságai







Legnagyobb gén: Dystrophin (DMD): 2,2Mb
(2.221.182 bp)
Leghosszabb kódoló szekvencia: titin: 104.076bp, <
34.500 aminosav), leghosszabb exon: titin: 17.106bp
Géngazdag kromoszómák: 17,19,22
Leggazdagabb: 19-es: 63,8Mb = 1468 gén
(Ensembl): 23 gén/Mb
Génszegény kromoszómák: 4,13,18,X, Y (összesen
104 gén; 1,8 gén/Mb)
Intronok 98,12% GT 5’ végén és AG 3’ végén;
35-40% alternative splicing (egy génből több
fehérje)
Milyen információkat nyújt a humán genom
szekevenciája?
A gének elrendeződése
• A humán genom géngazdag régióiban G-C tartalom dominál.
• A gén szegény régiók gazdagok A-T építő kövekben.
• A gének random oszlanak el a kromoszómákon és közöttük sok nem kódoló DNS
található.
• A géngazdag régiók határán akár 30,000 C és G bázis tartalmu ismétlődő szigetek
választják el a géneket az un. Junk DNS-től, feltehető szabályozó szereppel.
http://doegenomes.org
U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003
Milyen információkat nyújt a humán genom szekevenciája?
The Wheat from the Chaff
• A genom keveebb mint 1%-a kódol fehérjéket.
• Fehérjéket nem kódoló ismétlődő szekvenciák teszik ki ("junk DNA") a humán
genom legkevesebb 50%-t.
• A repetitiv szekvenciáknak nincs direkt funkciója, de befolyásolják a kromatin
strukturáját és dinamikáját. Átrendezik a genomot, új gének keletkezésében
vesznek részt. .
• A humán genomban több az ismétlődő szekvencia (50%), mint az utilapu füben
(11%), a gilisztában (7%), vagy a légyben (3%).
http://doegenomes.org
U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003
Milyen információkat nyújt a humán genom
szekevenciája?
A humán és más genomok összehasonlítása
• Az emberi genomhoz képest más genomok sokkal egyenletesebb gén eloszlást
mutatnak.
• Az emberben háromszor több féle fehérje van mint pl. a légyben. Ez alternatív splicing
és poszt-transzlációs módosítások eredménye. Egy génről több fehérje termék is
keletkezhet.
• A fehérje családok száma hasonló a giliszta, légy, vagy növényekben találhatókhoz.
De egy családban több egyed van, különösen a fejlődésban és az immunitásban
szereplő fehérjék között.
.
http://doegenomes.org
U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003
Milyen információkat nyújt a humán genom szekevenciája?
Variációk és eltérések
• A genomban kb. három millió egy-bázis mutáció van (SNP)
• A csírasejtekben található SNP-k aránya 2:1 a spermiumok és
petesejtek közt.
http://doegenomes.org
U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003
A jövő kérdései:
• Gének száma, funkciói
• Genek regulációja
• DNS szekvencia szervezettsége
Kromoszómák felépítése, organizációja
• Nem kódoló DNS szerkezete, típusai, felépítése, szerepe
• Génexpresszió, transzláció, módosítások koordinálása
• Fehérje kölcsönhatások
• Gén funkciók jóslása és kisérletes bizonyítása
• Az evolúció
• Fehérjék evolúciója (structure and function)
• Proteomes (total protein content and function) in organisms
• Az SNP-k(single-base DNA variations among individuals) szerepe betegségekben
• Disease-susceptibility prediction based on gene sequence variation
• Multigenes betegségekben szerepet játszó gének vizsgálata
• A genetika, genomika fejlesztése
U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003
Genome Sequencing Approaches
A HUGO Project hierarchikus rendszere
Alacsony
felbontás
Citogenetikai térképek
(kromoszómasáv)
Átfedő fragmentumok
klónozása
Restrikciós térképezés
Szekvenálás
Nagy
felbontás
Minden kezdet nehéz
J. Watson, a HGP első elnöke
Első cél: minél több marker kifejlesztése
(átlagos távolság: 150000 bp legyen)
Marker:
Egyszer előfordul ó
(‘unique’) szekvencia
(100-200 bp)
Eredmény:
30000 db marker
A hierarchikus rendszer felépítése
Izolált kromoszómák
feldarabolása
ritkán vágó
restrikciós
endonukleázokkal
150000 bp darabok
A keletkezett darabok klónozása

BAC (Bacterial Arteficial Chromosome) könyvtár létrehozása
A hierarchikus rendszer felépítése
BAC könyvtár:
átfedő darabok
Következő lépések:
1. restrikciós térképezés
2. Sorba-rendezés
3. A minimális számú BAC klón kiszelektálása
BAC könyvtárból fág könyvtár
kb. 150 000 bp (BAC)
kb. 1500 bp darabok
(átfednek)
A végek szekvenálása
CCAGTCTGACCCCGCAAACGGGTTT
GCCGAATCCAATTAGAAAAT
TAGAAAATCACATTTACCAGTCTGA
A szekvenciák sorba rakása
GCCGAATCCAATTAGAAAAT
TAGAAAATCACATTTACCAGTCTGA
CCAGTCTGACCCCGCAAACGGGTTT
Összerakás
http://www.dnaftb.org/dnaftb/39/concept/index.html
Celera: A “géppisztoly” módszer
2000 bp
és 10000 bp
darabok
Craig Venter
A végek szekvenálása, összerakás:
AAGGACTTATG____________________GGACACAGGTTATGG
GACTTA_____CGTTGGA
GAGAGGACACA________________CGTTATATTG
Dideoxynucleoside Sequencing
DNA Sequencing (old method)
5’-AAACCAGGCCGATAAGGTACTACACGAAAAAAA-3’
TTTTTTT
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
+
ddATP32
ddCTP32
ddTTP32
ddGTP32
Step 1. Extend complementary
sequence using “free” nucleotides
with limiting amounts of radioactive
“terminating” nucleotides.
Step 2. Run product out on a
electrophoresis gel.
Step 3. Place gel against
radiographic film, develop.
A G C T
AAACCAGGCCGATAAGGTACTACACGAAAAA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTTGGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
TTGGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
TGGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
GGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
GTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
TCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
CCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
CGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
GGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
GCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
CTATTCCATGATGTGCTTTTTTT
TATTCCATGATGTGCTTTTTTT
ATTCCATGATGTGCTTTTTTT
Dideoxynucleoside
Sequencing(new)
Dideoxynucleoside Sequencing
Oligonucleotide Array Synthesis



Photolithograp
hy
In situ
synthesis
Photolabile
protective
groups
(photomaskin
g(
High-Density Oligonucleotide
Arrays
Chee M. Assessing genetic information with high-density oligonucleotide arrays. Science 1996
FISH: Chromosomal
Translocations
DNA Microarray
Technology:
A Technical Perspective
Microarray-Based Assays (The Basics)
Each feature or “spot”
represents a specific
expressed gene
(mRNA).
The fluorescent
intensity of each
feature correlates with
the expression level of
the gene (mRNA) in
the samples under
investigation.
From: Duggan et.al. Nature Genetics 21:10-14, 1999
Microarray-Based Assays (The Basics)
The Key to Nucleic Acid Detection is “Sequence-Specific Affinity”
5’ 3’
G
T
C
A
T
T
G
C
C
A
A
C
A
G
T
A
A
C
G
G
T
T
3’ 5’
Microarray-Based Assays (The Basics)
“TARGET” is the fluorescence labeled
cDNA representation of the mRNA and
is hybridized to the probe.
“PROBE” is DNA spotted (attached) to the solid
substrate (non-fluorescent glass slide).
How does a DNA microarray detects gene activity?
Reverse Transcription makes cDNA from gene sequence…
mRNA
AAAAAAAAAAAAAAAA
...GCUACGAUUGCAACGCCCGAAUGGUUACCAAAAAAAAAAA...
CGATG CTAACGTTGCG GGCTTACCA ATGGTTTTTTTTTTT
cDNA
dTTP
dCTP
CGATG
CTAACGTTGCG GGCTTACCA ATGGTTTTTTTTTTT
dGTP dATP
2-Color System...
RNA from Normal Tissue
RNA from Cancer or Drug Treated Tissue
dCTP
dCTP
Reverse Transcription
2-Color System... Detection
2-Color Laser Scanner
P450 Induction Study
Adult Male Sprague-Dawley rats (175-200g) were dosed daily with the
following compounds (or vehicle control), and sacrificed at 1-day and
4-days of treatment. Livers were resected and flash-frozen for subsequent
microsomal preparation and RNA isolation.
DRUG (dose)
1) b-naphthoflavone (40mg/kg IP)
Expected P450 Induced
1A1, 1A2
2) Dexamethasone (50mg/kg IP)
3A
3) Isoniazid (100 mg/kg IP)
2E1
4) Phenobarbital (20 mg/kg IP)
2B1
RNA was analyzed using the Rat P450 microarray, microsomes were assayed
for the anticipated P450 activity.
b-naphthoflavone (40mg/kg IP)
1A1
30
Rat P450-1A1 mRNA
Fold Change above Control
25
Rat P450-1A1 Enzyme
Activity
20
1A1
15
10
5
0
1-Day
4-Day
1A1 enzyme activity is expressed as ratio of drug treated over control
(ethoxyresorufin to hydroxyresorufin, nmol/min/mg protein).
Day 1: 11.4 (= 2.73 / 0.24)
Day 4: 13.5 (= 2.30 / 0.17)
1-Day
b-naphthoflavone (40mg/kg IP)
Rat P450-1A2 mRNA
Fold Change above Control
1A2
25
Rat P450-1A2 Enzyme
Activity
20
15
4-Day
1A2
10
5
0
1-Day
4-Day
1A2 enzyme activity is expressed as ratio of drug treated over control
(methoxyresorufin to hydroxyresorufin, nmol/min/mg protein).
Day 1: 4.0 (= 0.12 / 0.03)
Day 4: 8.5 (= 0.17 / 0.02)
Methylcholanthrene-inducible P450d
Transzgenikus állatok
Transzgenikus egér
készítése
Lehet egy teljesen új gént is bevinni
GFP transzgén
A transzgénikus állat legyen
• Nagyobb
• Rezisztensebb
• Szebb, finomabb, vagy amit akartok
A "knockout mouse"
A knockout egérben az adott gén mindkét allélja helyettesített
inaktivált allélal. Ezt általában
homolog rekombinációval érik el
Ezt több lépéses szelektív tenyésztés követi, míg a célgén
mindkét példánya inaktivált ill. ki van ütve
When an investigator wants to replace one allele with an engineered
construct but not affect any other locus in the genome, then the method of
choice is homologous recombination. To perform homolgous recombination, you
must know the DNA sequence of the gene you want to replace. With
this information, it is possible to replace any gene with a DNA construct of
your choosing.
The next step is to design and fabricate the DNA construct you want to
insert into the chromosome in place of the wild-type allele. This construct
may contain any DNA sequence of your choosing which means you can insert
different alleles (both functional and non-functional ones), different genes
or reporter genes (e.g. antibiotic resistance or green fluorescent protein).
Regardless of what you want to insert, you must include some flanking DNA
that is identical in sequence to the targeted locus
In addition to the positive selection marker (e.g. antibiotic resistance) often a
negative selection marker (e.g. thymidine kinase, tk) is added to the
replacement vector. The negative marker is outside the region of sequence
similarity between the vector and the targeted locus.
The engineered construct is added to cells which contain the targeted gene
of interest. By mechanisms that are poorly understood but are similar to
what occurrs during meiosis and mitosis when homolgous chromosomes align
along the metaphase plane, the engineered construct finds the targeted gene
and recombination takes place within the homolgous (meaning identical in
this case) sequences.
Once the cells have performed their part of the procedure, the end result is
a new piece of DNA inserted into the chromosome. The rest of the genome is
unaltered but the single targeted locus has been replaced with the
engineered construct and some of its flanking DNA .
If the targeting vector aligns in a non-homologous region of the genome,
then recombination is random and the negative selection marker may become
incorporated into the genome.
The final product of non-homologous recombination can survive
positive (antibiotic) selection. However, there is a drug called gancyclovir
that will kill any cell that contains the tk gene. So cells undergoing
homologous recombination are grown in antibiotic to select for recombination
and gancyclovir to kill any cells that successfully conducted non-homologous
recombination.
The positive and negative selection markers are incorporated into chromosome
so gancyclovir will kill cells with modified chromosomes.
A knockout mouse has had both alleles of a particular gene replaced with an
inactive allele..
1.
Isolate developing embryo at
blastocyst stage. This embryo is from
a strain of mice with gray fur.
Remove embryonic stem cells from
gray-fur blastocyst. Grow stem
cells in tissue culture.
2.
Transfect stem cells with homologous
recombination construct. Select
for homologous recombination by
growing stem cells in neomycin and
gancyclvir.
Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white fur
mouse.
Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white
fur mice but others will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their
cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be
derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells
produce gray patches which are easily detected.
Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads
of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the
offspring will have gray fur. Every cell in gray mice are heterozygous for
the homologous recombination.
Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring.
Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a strain
of mice with both alleles knocked out. The pure breeding mouse strain is a
"knockout mouse".
Figure 21.8. Gene targeting using the Cre-loxP recombination system can
to inactivate a gene in a desired cell type. (A) Illustration of a standard homo
recombination method using mouse ES cells, in which three loxP sites are intro
along with a marker M at a target locus A (typically a small gene or an internal e
which if deleted would cause a frameshift mutation). Subsequent transfection o
recombinase gene and transient expression of this gene results in recombinatio
between the introduced loxP sites to give different products. Type I recombinan
Leptin deficiens kövér egér