* Your assessment is very important for improving the workof artificial intelligence, which forms the content of this project
Download Génmanipuláció
Epitranscriptome wikipedia , lookup
Copy-number variation wikipedia , lookup
Cancer epigenetics wikipedia , lookup
Nucleic acid analogue wikipedia , lookup
Gene expression programming wikipedia , lookup
Epigenetics in stem-cell differentiation wikipedia , lookup
Metagenomics wikipedia , lookup
DNA damage theory of aging wikipedia , lookup
Polycomb Group Proteins and Cancer wikipedia , lookup
X-inactivation wikipedia , lookup
Extrachromosomal DNA wikipedia , lookup
Transposable element wikipedia , lookup
Nutriepigenomics wikipedia , lookup
Pathogenomics wikipedia , lookup
Gene therapy of the human retina wikipedia , lookup
Cell-free fetal DNA wikipedia , lookup
Molecular cloning wikipedia , lookup
Genome (book) wikipedia , lookup
Epigenomics wikipedia , lookup
Public health genomics wikipedia , lookup
Oncogenomics wikipedia , lookup
DNA vaccination wikipedia , lookup
Zinc finger nuclease wikipedia , lookup
Gene therapy wikipedia , lookup
Point mutation wikipedia , lookup
Whole genome sequencing wikipedia , lookup
Deoxyribozyme wikipedia , lookup
Human genome wikipedia , lookup
Homologous recombination wikipedia , lookup
Non-coding DNA wikipedia , lookup
Genetic engineering wikipedia , lookup
Primary transcript wikipedia , lookup
Human Genome Project wikipedia , lookup
Designer baby wikipedia , lookup
Vectors in gene therapy wikipedia , lookup
Microevolution wikipedia , lookup
Genome evolution wikipedia , lookup
Therapeutic gene modulation wikipedia , lookup
Helitron (biology) wikipedia , lookup
Genomic library wikipedia , lookup
No-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) Genome Editing wikipedia , lookup
Cre-Lox recombination wikipedia , lookup
History of genetic engineering wikipedia , lookup
Artificial gene synthesis wikipedia , lookup
The Human Genome Project A humán gén projekt http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml Február 2001: Humán genom jelentős része kész Június, 2004 Január, 2005 Public HGP Celera Genomics Kiket szekvenáltak meg? Celera: 21 kevert etnikumú donor (kor, nem önmeghatározott etnikum); 130-130 ml vér; a férfiaktól 5 adag sperma 6 hét alatt. 2 férfit és 3 nőt választottak ki: 1 afrikai, 1 kínai, 1 spanyolmexikói, 2 kaukázusi (szempontok: diverzitás, minőség). HGP 2 centrum gyűjtötte a donorokat, hasonló elvek alapján Milyen információkat nyújt a humán genom szekevenciája? A számok alapján • Három milliárd bázist tartalmaz(A, C, T, and G). • Egy átlagos gén 3000 bazisból áll, a méret változó, a leghosszabb humán gén a dystrophin 2.4 millió bázissal. • Az összes gének száma 30,000—sokkal kevesebb mint az előzetes becslés 80,000 -140,000. • 99.9%-a az összes nukleotidnak pontosan ugyanaz minden emberben. • A gének 50%-nak ismeretlen a funkciója. http://doegenomes.org U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003 A humán genom tulajdonságai Legnagyobb gén: Dystrophin (DMD): 2,2Mb (2.221.182 bp) Leghosszabb kódoló szekvencia: titin: 104.076bp, < 34.500 aminosav), leghosszabb exon: titin: 17.106bp Géngazdag kromoszómák: 17,19,22 Leggazdagabb: 19-es: 63,8Mb = 1468 gén (Ensembl): 23 gén/Mb Génszegény kromoszómák: 4,13,18,X, Y (összesen 104 gén; 1,8 gén/Mb) Intronok 98,12% GT 5’ végén és AG 3’ végén; 35-40% alternative splicing (egy génből több fehérje) Milyen információkat nyújt a humán genom szekevenciája? A gének elrendeződése • A humán genom géngazdag régióiban G-C tartalom dominál. • A gén szegény régiók gazdagok A-T építő kövekben. • A gének random oszlanak el a kromoszómákon és közöttük sok nem kódoló DNS található. • A géngazdag régiók határán akár 30,000 C és G bázis tartalmu ismétlődő szigetek választják el a géneket az un. Junk DNS-től, feltehető szabályozó szereppel. http://doegenomes.org U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003 Milyen információkat nyújt a humán genom szekevenciája? The Wheat from the Chaff • A genom keveebb mint 1%-a kódol fehérjéket. • Fehérjéket nem kódoló ismétlődő szekvenciák teszik ki ("junk DNA") a humán genom legkevesebb 50%-t. • A repetitiv szekvenciáknak nincs direkt funkciója, de befolyásolják a kromatin strukturáját és dinamikáját. Átrendezik a genomot, új gének keletkezésében vesznek részt. . • A humán genomban több az ismétlődő szekvencia (50%), mint az utilapu füben (11%), a gilisztában (7%), vagy a légyben (3%). http://doegenomes.org U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003 Milyen információkat nyújt a humán genom szekevenciája? A humán és más genomok összehasonlítása • Az emberi genomhoz képest más genomok sokkal egyenletesebb gén eloszlást mutatnak. • Az emberben háromszor több féle fehérje van mint pl. a légyben. Ez alternatív splicing és poszt-transzlációs módosítások eredménye. Egy génről több fehérje termék is keletkezhet. • A fehérje családok száma hasonló a giliszta, légy, vagy növényekben találhatókhoz. De egy családban több egyed van, különösen a fejlődésban és az immunitásban szereplő fehérjék között. . http://doegenomes.org U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003 Milyen információkat nyújt a humán genom szekevenciája? Variációk és eltérések • A genomban kb. három millió egy-bázis mutáció van (SNP) • A csírasejtekben található SNP-k aránya 2:1 a spermiumok és petesejtek közt. http://doegenomes.org U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003 A jövő kérdései: • Gének száma, funkciói • Genek regulációja • DNS szekvencia szervezettsége Kromoszómák felépítése, organizációja • Nem kódoló DNS szerkezete, típusai, felépítése, szerepe • Génexpresszió, transzláció, módosítások koordinálása • Fehérje kölcsönhatások • Gén funkciók jóslása és kisérletes bizonyítása • Az evolúció • Fehérjék evolúciója (structure and function) • Proteomes (total protein content and function) in organisms • Az SNP-k(single-base DNA variations among individuals) szerepe betegségekben • Disease-susceptibility prediction based on gene sequence variation • Multigenes betegségekben szerepet játszó gének vizsgálata • A genetika, genomika fejlesztése U.S. Department of Energy Genome Programs, Genomics and Its Impact on Science and Society, 2003 Genome Sequencing Approaches A HUGO Project hierarchikus rendszere Alacsony felbontás Citogenetikai térképek (kromoszómasáv) Átfedő fragmentumok klónozása Restrikciós térképezés Szekvenálás Nagy felbontás Minden kezdet nehéz J. Watson, a HGP első elnöke Első cél: minél több marker kifejlesztése (átlagos távolság: 150000 bp legyen) Marker: Egyszer előfordul ó (‘unique’) szekvencia (100-200 bp) Eredmény: 30000 db marker A hierarchikus rendszer felépítése Izolált kromoszómák feldarabolása ritkán vágó restrikciós endonukleázokkal 150000 bp darabok A keletkezett darabok klónozása BAC (Bacterial Arteficial Chromosome) könyvtár létrehozása A hierarchikus rendszer felépítése BAC könyvtár: átfedő darabok Következő lépések: 1. restrikciós térképezés 2. Sorba-rendezés 3. A minimális számú BAC klón kiszelektálása BAC könyvtárból fág könyvtár kb. 150 000 bp (BAC) kb. 1500 bp darabok (átfednek) A végek szekvenálása CCAGTCTGACCCCGCAAACGGGTTT GCCGAATCCAATTAGAAAAT TAGAAAATCACATTTACCAGTCTGA A szekvenciák sorba rakása GCCGAATCCAATTAGAAAAT TAGAAAATCACATTTACCAGTCTGA CCAGTCTGACCCCGCAAACGGGTTT Összerakás http://www.dnaftb.org/dnaftb/39/concept/index.html Celera: A “géppisztoly” módszer 2000 bp és 10000 bp darabok Craig Venter A végek szekvenálása, összerakás: AAGGACTTATG____________________GGACACAGGTTATGG GACTTA_____CGTTGGA GAGAGGACACA________________CGTTATATTG Dideoxynucleoside Sequencing DNA Sequencing (old method) 5’-AAACCAGGCCGATAAGGTACTACACGAAAAAAA-3’ TTTTTTT dATP dCTP dTTP dGTP + ddATP32 ddCTP32 ddTTP32 ddGTP32 Step 1. Extend complementary sequence using “free” nucleotides with limiting amounts of radioactive “terminating” nucleotides. Step 2. Run product out on a electrophoresis gel. Step 3. Place gel against radiographic film, develop. A G C T AAACCAGGCCGATAAGGTACTACACGAAAAA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTGGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT TTGGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT TGGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT GGTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT GTCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT TCCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT CCGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT CGGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT GGCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT GCTATTCCATGATGTGCTTTTTTT CTATTCCATGATGTGCTTTTTTT TATTCCATGATGTGCTTTTTTT ATTCCATGATGTGCTTTTTTT Dideoxynucleoside Sequencing(new) Dideoxynucleoside Sequencing Oligonucleotide Array Synthesis Photolithograp hy In situ synthesis Photolabile protective groups (photomaskin g( High-Density Oligonucleotide Arrays Chee M. Assessing genetic information with high-density oligonucleotide arrays. Science 1996 FISH: Chromosomal Translocations DNA Microarray Technology: A Technical Perspective Microarray-Based Assays (The Basics) Each feature or “spot” represents a specific expressed gene (mRNA). The fluorescent intensity of each feature correlates with the expression level of the gene (mRNA) in the samples under investigation. From: Duggan et.al. Nature Genetics 21:10-14, 1999 Microarray-Based Assays (The Basics) The Key to Nucleic Acid Detection is “Sequence-Specific Affinity” 5’ 3’ G T C A T T G C C A A C A G T A A C G G T T 3’ 5’ Microarray-Based Assays (The Basics) “TARGET” is the fluorescence labeled cDNA representation of the mRNA and is hybridized to the probe. “PROBE” is DNA spotted (attached) to the solid substrate (non-fluorescent glass slide). How does a DNA microarray detects gene activity? Reverse Transcription makes cDNA from gene sequence… mRNA AAAAAAAAAAAAAAAA ...GCUACGAUUGCAACGCCCGAAUGGUUACCAAAAAAAAAAA... CGATG CTAACGTTGCG GGCTTACCA ATGGTTTTTTTTTTT cDNA dTTP dCTP CGATG CTAACGTTGCG GGCTTACCA ATGGTTTTTTTTTTT dGTP dATP 2-Color System... RNA from Normal Tissue RNA from Cancer or Drug Treated Tissue dCTP dCTP Reverse Transcription 2-Color System... Detection 2-Color Laser Scanner P450 Induction Study Adult Male Sprague-Dawley rats (175-200g) were dosed daily with the following compounds (or vehicle control), and sacrificed at 1-day and 4-days of treatment. Livers were resected and flash-frozen for subsequent microsomal preparation and RNA isolation. DRUG (dose) 1) b-naphthoflavone (40mg/kg IP) Expected P450 Induced 1A1, 1A2 2) Dexamethasone (50mg/kg IP) 3A 3) Isoniazid (100 mg/kg IP) 2E1 4) Phenobarbital (20 mg/kg IP) 2B1 RNA was analyzed using the Rat P450 microarray, microsomes were assayed for the anticipated P450 activity. b-naphthoflavone (40mg/kg IP) 1A1 30 Rat P450-1A1 mRNA Fold Change above Control 25 Rat P450-1A1 Enzyme Activity 20 1A1 15 10 5 0 1-Day 4-Day 1A1 enzyme activity is expressed as ratio of drug treated over control (ethoxyresorufin to hydroxyresorufin, nmol/min/mg protein). Day 1: 11.4 (= 2.73 / 0.24) Day 4: 13.5 (= 2.30 / 0.17) 1-Day b-naphthoflavone (40mg/kg IP) Rat P450-1A2 mRNA Fold Change above Control 1A2 25 Rat P450-1A2 Enzyme Activity 20 15 4-Day 1A2 10 5 0 1-Day 4-Day 1A2 enzyme activity is expressed as ratio of drug treated over control (methoxyresorufin to hydroxyresorufin, nmol/min/mg protein). Day 1: 4.0 (= 0.12 / 0.03) Day 4: 8.5 (= 0.17 / 0.02) Methylcholanthrene-inducible P450d Transzgenikus állatok Transzgenikus egér készítése Lehet egy teljesen új gént is bevinni GFP transzgén A transzgénikus állat legyen • Nagyobb • Rezisztensebb • Szebb, finomabb, vagy amit akartok A "knockout mouse" A knockout egérben az adott gén mindkét allélja helyettesített inaktivált allélal. Ezt általában homolog rekombinációval érik el Ezt több lépéses szelektív tenyésztés követi, míg a célgén mindkét példánya inaktivált ill. ki van ütve When an investigator wants to replace one allele with an engineered construct but not affect any other locus in the genome, then the method of choice is homologous recombination. To perform homolgous recombination, you must know the DNA sequence of the gene you want to replace. With this information, it is possible to replace any gene with a DNA construct of your choosing. The next step is to design and fabricate the DNA construct you want to insert into the chromosome in place of the wild-type allele. This construct may contain any DNA sequence of your choosing which means you can insert different alleles (both functional and non-functional ones), different genes or reporter genes (e.g. antibiotic resistance or green fluorescent protein). Regardless of what you want to insert, you must include some flanking DNA that is identical in sequence to the targeted locus In addition to the positive selection marker (e.g. antibiotic resistance) often a negative selection marker (e.g. thymidine kinase, tk) is added to the replacement vector. The negative marker is outside the region of sequence similarity between the vector and the targeted locus. The engineered construct is added to cells which contain the targeted gene of interest. By mechanisms that are poorly understood but are similar to what occurrs during meiosis and mitosis when homolgous chromosomes align along the metaphase plane, the engineered construct finds the targeted gene and recombination takes place within the homolgous (meaning identical in this case) sequences. Once the cells have performed their part of the procedure, the end result is a new piece of DNA inserted into the chromosome. The rest of the genome is unaltered but the single targeted locus has been replaced with the engineered construct and some of its flanking DNA . If the targeting vector aligns in a non-homologous region of the genome, then recombination is random and the negative selection marker may become incorporated into the genome. The final product of non-homologous recombination can survive positive (antibiotic) selection. However, there is a drug called gancyclovir that will kill any cell that contains the tk gene. So cells undergoing homologous recombination are grown in antibiotic to select for recombination and gancyclovir to kill any cells that successfully conducted non-homologous recombination. The positive and negative selection markers are incorporated into chromosome so gancyclovir will kill cells with modified chromosomes. A knockout mouse has had both alleles of a particular gene replaced with an inactive allele.. 1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of mice with gray fur. Remove embryonic stem cells from gray-fur blastocyst. Grow stem cells in tissue culture. 2. Transfect stem cells with homologous recombination construct. Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and gancyclvir. Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white fur mouse. Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white fur mice but others will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells produce gray patches which are easily detected. Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the offspring will have gray fur. Every cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination. Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring. Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a strain of mice with both alleles knocked out. The pure breeding mouse strain is a "knockout mouse". Figure 21.8. Gene targeting using the Cre-loxP recombination system can to inactivate a gene in a desired cell type. (A) Illustration of a standard homo recombination method using mouse ES cells, in which three loxP sites are intro along with a marker M at a target locus A (typically a small gene or an internal e which if deleted would cause a frameshift mutation). Subsequent transfection o recombinase gene and transient expression of this gene results in recombinatio between the introduced loxP sites to give different products. Type I recombinan Leptin deficiens kövér egér