Survey
* Your assessment is very important for improving the workof artificial intelligence, which forms the content of this project
Download immunoassy .Dr moaednia
Document related concepts
Transcript
روش های شناسایی آزمایشگاهی دکتر سعید مویدنیا عناوین: • از چه روشهایی برای بررسی آزمایشگاهی تستهای روماتولوژی استفاده می شود؟ • تفاوت روشهای مذکور در چیست و کدام ارجحند؟ • رعایت کدام عوامل پیش آزمونی مهمند؟ چه عواملی در آزمونهای مذکور تداخل دارند؟ • چکونه به وجود تداخالت پی ببریم؟ • رفع تداخالت چگونه امکان پذیر هستند؟ از چه روشهایی برای بررسی آزمایشگاهی تستهای روماتولوژی استفاده می شود؟ عمدتا از روشهای سنجش ایمنی immunoassayمی باشد. Ab (Label) I…MA Ag (Label) …IA تفاوت روشهای مذکور در چیست و کدام ارجحند؟ .1نوع لیبل به کار رفته متفاوت است. رادیواکتیو آنزیم فلورسانس IRMA IEMA IFMA RIA EIA FIA لومینسانس ICMA CIA جایگاه نشاندار سازی متفاوت است . آنتی ژن ( رقابتی ) آنتی بادی ( ساندویچی ) کدام روش بهتر است؟ 1. Imprecision 2. Gole dependency 3. Work of renge 4. robatsness 5. sensivity رعایت کدام عوامل پیش آزمونی مهمند؟ .1نوع نمونه؟ .2زمان نمونه گیری؟ .3نگهدارنده؟ .4نگهداری؟ .5مصرف دارو؟ .6ایکتر ،لیپمیک ،همولیز؟ کسب نتایج منفی کاذب در غلظت باالی انالیت را پدیده هوک یا قالب گویند Y Y YY YY Y YY YYY Y YY YYY Y YY YYY Y YY Hook Effect Hetrophil antibody effect آنتی ژن نشاندار Competitive Binding Reaction آنتی ژن بیما ر آنتی بادی نشاندار آنتی بادی بیمار آنتی ژن آنتی – آنتی بادی نشاندار آنتی بادی بیمار Non-competitive Binding Reaction آنتی ژن بیمار آنتی بادی اختصاصی نشاندار منوکلونال آنتی بادی ضد آنتی ژن آنتی بادی بیمار Antibody capture Method آنتی ژن منوکلونال آنتی بادی نشاندار آنتی -آنتی بادی نکات عملی که باید در آزمایش االیزا رعایت نمود: انجام کلیه مراحل آزمایش طبق دستور کیت رساندن کیت به دمای اتاق قبل از شروع کار تنظیم دمای انکوباسیون برگرداندن استریپهای اضافی به داخل کیسه حاوی رطوبت گیرو بستن درب آن استفاده از نوک سمپلرجدید برای هر نمونه یا محلول برای جلوگیری از آلودگی نوک سمپلر بر سرسمپلرمحکم شده باشد. اجتناب ازایجاد کف وحباب در هنگام افزودن مواد ازپاشیدن نمونه یا محلولها به دیواره چاهک وسایرچاهکها اجتناب شود. تنظیم تایمروثبت زمان شروع انکوباسیون کاردستگاه شستشوراچک کنید(ازنظرانسدادکانالهای شستشوواسپیراسون ناکامل) محلول شستشوبه چاهکهای مجاورسرازیرنشود. تکرارشستشوبه دفعات توصیه شده گرفتن ذرات باقیمانده با کاغذ نم گیردرانتهای شستشو کف چاهکها خشک نشود. تهیه و استفاده ازسوبسترا طبق دستورسازنده اجتناب ازآلوده شدن محلول سوبسترا با نوک سمپلرآلوده Common enzymes 1. Horseradish Peroxidase 2. Alkaline Phosphatase Immunochemical tests for infectious disease can be : 1. Qualitative 2. Semi Quantitative 3. Quantitative. Microplate Reader 1. wavelength range to that used in ELISA, generally between 2. 400 to 750 nm (nanometres) 3. Some readers (ultraviolet range between 340 to 700 nm. Microplate Reader INSTALLATION REQUIREMENTS 1. A clean, dust free environment. 2. A stable work table away from equipment that vibrates (centrifuges, agitators). 3. An electrical supply source, which complies with the country’s norms and standards. Pipettes and Best pipetting practice Manual single channel Manual multi channel Electronic single channel Electronic multi channel GUIDE TO PIPETTING • ONLY USE FIRST STOP ! • DO NOT DRIP • DO NOT PRESS HARD INTO WELL • DO NOT USE TOO ACUTE AN ANGLE • MAKE SURE TIP TOUCHES SIDE OF WELL AND LIQUID PIPETTING Pipetting tips • Forward Pipetting technique Pipetting tips • Reverse Pipetting technique • Highly viscous fluid • Avoid foaming • مقادير ناهماهنگ يا نتايج غیر منتظره وغیر طبیعي در آزمايشات ایمنواسی ممكنست نشاندهنده تداخل تكنیكي و يا يك وضعیت بالیني نادر باشد • از آنجایی که شدت تداخل در روشهای مختلف متفاوت است ،گاهي سنجش نمونه با روشی ديگر ,موجب تشخیص تداخل ميشود. ELISA VIDEO فلورسنت میکروسکوپی Fluorescence immunoassays • FIA based on labeling immunoreactants with fluorescent probes. • Detection and quantitation of Drugs, Hormones, Proteins,etc, Ultra Violet spectrum By convention, the ultraviolet spectrum is broken into arbitrary divisions: 1. Long wave or "UVA“ (~400—350 nm) 2. Mid wave or "UVB" (~350—300 nm) or "UVC" (~300—200 nm) 3. Short wave 4. Far ultraviolet (<200 nm) • Since ultraviolet light is invisible, the visible (fluorescent) result may appear as if by "magic" when viewed in a darkened room . Fluorescence Stokes Shift • is the energy difference between the lowest energy peak of absorbence and the highest energy of emission Fluorescnece Intensity Stokes Shift is 25 nm Fluorescein molecule 495 nm Wavelength 520 nm 350 300 nm 457 488 514 400 nm 500 nm Common Laser Lines 610 632 600 nm 700 nm PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid Characteristics of IFA OR FIA 1- Specificity 2- Sensitivity 3- Rapidity 4- Cost effectiveness 5.- Subjectivity Fluorescent Microscopy Specification of microscopes Slides and cover glasses Immersion oil Mounting media Fluorescent Microscope : • Early fluorescence microscope utilized transmitted light with oil darkfield sub stage condensers • Epifluorescence microscope Advantages : 1. The objectives serve as condenser 2. The area of illumination is restricted to the area being observed 3. Bright illumination Fluorescence Microscope with Color Video (CCD) 35 mm Camera Fluorescent Microscope Arc Lamp EPI-Illumination ic Excitation Diaphragm Excitation Filter Ocular ObjDichroic Filter ective Emission Filter Excitation Sources Lamps Xenon Xenon/Mercury Lasers Argon Ion (Ar) Krypton (Kr) Helium Neon (He-Ne) Helium Cadmium (He-Cd) Krypton-Argon (Kr-Ar) The various aspects of the microscope that affect the specificity and sensitivity a. Light source : powerful light sources are needed • The most common sources are 100-200W high pressure mercury short arc lamp • The 100 W bulb is brightest , offering a life of 200hrs • Frequent on-off switching reduces lamp life • Do not touch the bulb to avoid etching The various aspects of the microscope that affect the specificity and sensitivity b. Optics : • The role of objectives is crucial intensity varies proportionally to the 4X power of numerical apertures The various aspects of the microscope that affect the specificity and sensitivity c. Filters : 1. Exciter 2. Barrier 3. Dichroic beam splitter The various aspects of the microscope that affect the specificity and sensitivity d. Calibration Optical standard (OS) slide 1. Monitor the emission light 2. Assure optical alignment 3. Improve lab proficiency The various aspects of the microscope that affect the specificity and sensitivity e. Controls Serum controls : negative , low positive, high positive tissue control Monting medium : a. Buffered glycerin : undergo rapid photo bleaching (fading), the slides can not be stored for prolonged period. b. Semipermanent, polyvinyl-alcohol medium • One of the limitation of fluorescent microscopy is fading upon excitation due to irreversible decomposition of the fluorochromes • The fading can be reduced if mounting media contain antioxidants such as DTT(ditiotetrol) βME(betametaethanol) , P-phenylene diamine Elements of FIA 1- Antigens, Antibodies (analyte) 2- Labeled antibodies a) b) c) Essential requirement Checker – board titration flurecent protein reitio(FPR) 3- Control specimen 4- Observation (lam ,lamel ,emer oil) 5- Staining procedures Inherent Problems of Fluorescent assays: 1) Auto Fluorescent a) Serum Protein emit at 320 to 350 nm b) Bilirubin emit at 430 to 470 nm c) Sample treatment with proeolytic, oxidaizing agents 2) Quenching by Bilirubin and Hb 3) Photodestruction due to repeated excitation ( repeated measurement within short period) The cell during interphase Structure of the nuclear membranes HEp-2 cells allow recognition of over 30 different nuclear and cytoplasmic patterns which are given by upwards of 100 different autoantibodies. HEp-2 cells have many advantages over rodent tissues 1. They are a more sensitive substrate that allows identification of many patterns. 2. Human origin ensures better specificity than animal tissues. 3. The nuclei are much larger so that complex nuclear details can be seen. HEp-2 cells have many advantages over rodent tissues 4. The cell monolayer ensures that all nuclei are visible. 5. Cell division rates are higher so that antigens produced only in cell division are easily located eg., centromere and mitotic spindle patterns. 6. There is no obscuring intercellular matrix 7. Antigen distribution is uniform
