Download Mycobacteria, Mycoplasma

ดร. อมรรัตน อินทรสูต
ภาควิชาจุลชีววิทยา
คณะแพทยศาสตร
มหาวิทยาลัยเชียงใหม
• ทราบชนิดของเชื้อกอโรคที่สาํ คัญ ตลอดจนโรคที่เกีย่ วของ
จากเชื้อกลุม Mycobacteria และMycoplasmas
• ทราบปจจัยการกอโรคของเชื้อที่มีความสําคัญ
• รูจักวิธีการรักษาและปองกันโรค
• The genus Mycobacterium is the only genus in
the Mycobacteriaceae family, Actinomycetales
order, and Actinomycetes class.
• Over 71 species found in this genus
• Aerobic, non-spore forming, non-motile, slightly
curved or straight rods (0.2-0.6 x 1.0-10 µm)
• Grow more slowly than most other human
pathogenic bacteria because of their
hydrophobic cell surface (organisms tend to
clump, nutrients are not easily allowed into cell)
• Extremely slow dividing rate (16-20 hr)
• Gram’s stain: Gram positive bacillus (poor stained,
beaded rod or ghost cell)
• Acid-fastness (20% acid alcohol, modified acid fast : ≤
5% acid)
• Resist to disinfectants and antibiotics
• Protein coated on peptidoglycan acts as antigen to
induce antibody production and delayed type
hypersensitivity (purified protein derivatives; PPD is
species-specific; skin test for exposure to TB)
Mycobacteria
Cellular structure
• Gram positive bacteria
• Complex cell wall (hydrophobic)
♥ long chain mycolic acid
♥ arabinogalactan
♥ cord factor (trehalose-6,6’dimycolate; granuloma
formation, cord formation or
serpentine cord)
• Lipoarabinomannan : ligand for
receptor on
mφ
• Mycobacteria can be divided into two major
groups:
1. Mycobacterium tuberculosis complex
2. Nontuberculous mycobacteria (NTMs)
• Smooth to rough colony
cauliflower-shaped
Mycobacterium smegmatis
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis complex:
- including M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum,
M. canetti and M. microti
- these species are capable cause of tuberculosis
- the main public health problem is M. tuberculosis
- M.africanum, M. canetti (rare): significantly cause of
tuberculosis in Africa
- M. bovis : pasteurized milk has largely reduced
infection
- M. microti : mostly seen in immunodeficient people
M. tuberculosis
• discovered by Robert Koch
• causes of pulmonary tuberculosis
• human is natural reservoir (especially lung)
• transmit through the droplets of infected
patients (cough, sneeze and speak)
• one small droplet nuclei carry 1-3 cells
of Mycobacterium
• The infectious dose of tuberculosis is very
low and inhaling less than 10 bacteria may
cause an infection
• infect alveolar macrophage in alveoli (intracellular
infection) → multinucleated giant cell (Langhans’
cell) → spread to lymph nodes or blood circulation →
organs
• HMI : induce antibody response (not play the role in
protection)
• CMI : play a role in killing intracellular pathogen
activated mφ (kill microorganism living inside)
cytotoxic T-cell (kill infected mφ)
Lesion at the upper lobe of lung (Gohn focus)
spread over the lung (miliary tuberculosis)
Granuloma formation around the inflammatory tissue
Careous necrosis
(Tissue necrosis caused by immune response)
Tubercle in lung
(fibrous formation around necrotic tissue)
Scar formation
cavity
(Fibrosis or calcification)
(The organisms are
released after breaking of tubercle)
Signs and symptoms:
range from asymptomatic (predominant) to acute
infection
1. Pulmonary tuberculosis: 75% of the cases
- chest pain, coughing up blood (prolonged cough >
3 weeks)
2. Extrapulmonary tuberculosis: Systemic symptoms
- fever, chills, night sweats, appetite loss, weight
loss, fatigue, etc.
- Ex. meningitis in central nervous system
urogenital tuberculosis in genitourinary system
3. Co-exist tuberculosis: Pulmonary & extrapulmonary
tuberculosis
Laboratory diagnosis
1. Specimens: expectorated sputum, urine, CSF,
blood, feces, etc.
adequate sputum : PMN>25 cells/LPF,
squamous epithelial cell < 10 cell/LPF
2. Chest x-ray: granuloma formation
3. Tuberculin skin test or Mantoux test:
- A primary means to identify individuals infected
with M. tuberculosis (MTB)
- After 48-72 hr intracutaneously injected with
culture extract of MTB, a person who has been
infected will exhibit a delay type hypersensitivity
(erythema or redness on the skin)
4. Direct stain: Acid-fast stain (Kinyoun, Ziehl-Neelsen)
(stain with carbolfuchin and counter stain with
methylene blue)
5. Culture: contain malachite green or antibiotics to
inhibit the contaminants
Lowenstein-Jensen medium (egg-based medium)
Middlebrooks medium (agar-based medium)
conditions: 35 oC, 5-10% CO2 incubate 6-8 wks
(antibiotics : polymixin B, amphotericin B, nalidixic
acid, trimethoprim, azlocilin; PANTA)
6. Nucleic acid analysis : PCR, DNA probe etc.
7. Biochemical test
: many enzyme production etc.
8. Antigen detection
: ELISA, agglutination test etc.
Acid-fast staining
(Kinyoun’s method)
A drop of distill water
Smear the organism on glass slide
flaming
stained with Kinyoun carbon fuchsin
(phenol) for 3-5 min
washing
Decolorized with acid alcohol
washing
counter stained with Methylene blue
for 1 min
washing
The genus Mycobacterium and the genus
Nocardia are acid-fast (stain red).
Other bacteria will be decolorized and stain blue.
Acid-fast stain:
positive
Acid-fast smear reporting (WHO)
Examination
No. of fields
examined
Result
Grading
>10 AFB/oil field
20
positive
3+
1-10 AFB/oil field
50
positive
2+
10-99 AFB in 100
oil fields
100
positive
1+
1-9 AFB in 100
oil fields
100
scanty
record actual
number
No AFB in 100
oil fields
100
negative
0
Chest x-ray:
granuloma formation
Tuberculin skin test
(injection with PPD)
The test is designed to measure delayed-type hypersensitivity
reactions. An infected individuals, the body will recognize the
antigens in the Tuberculin and cause a local reaction at the
site of injection. (also found in person with BCG vaccination
or TB exposure in history)
False negative : immunocompromise patient, AIDS
Treatment: combined drugs
isoniazid, rifampin, ethambutol, pyrazinamide,
streptomycin
Prevention: vaccine
- usually uses Bacille Calmette-Guérin (BCG) live
attenuated vaccine (from M. bovis BCG) for infants
(up to 80% protection)
Nontuberculous mycobacteria (NTMs):
NTMs was classified into 3 groups
1.1 Rapidly growing NTM
(gr. 4)
1.2 Slow-growth NTM
(divided into 3 groups bases on
phenotypic characteristics)
1.2.1 Photochromogens (gr. 1; colonies become
pigmented when exposed to light)
1.2.2 Scotochromogens (gr. 2; colonies are pigmented
when grown in the dark)
1.2.3 Nonphotochromogens (gr.3; produce no pigment)
1.3 Nonculturable NTM
(Leprosy caused by M. leprae)
( Runyon’s classification of NTM : group 1- 4 )
1.1 Rapidly growing NTM
- culture colonies appear in ≤ 7 days
- Gram’s stain: GPB resembling diphtheroids
- ubiquitous in the environment (soil, river, etc.)
- may be commensals on the skin
- mostly potential pathogenic in
immunocompromised patients
- Pathogens: M. fortuitum, M. chelonae,
M. abscessus
1.2 Slow growth NTM
- culture over 7 days
- ubiquitous in the environment (soil, river, etc.) and
animal (pigs, chickens, cats, dogs)
- Natural waters served as the major reservoir for most
human infections
- route of infection : eating contaminated food or water,
inhalation of infectious droplet
- mostly potential pathogenic in AIDS patients (30-50%)
- Pathogens: M. avium, M. intracellulare,
M. paratuberculosis (called M. avium complex or MAC)
1.3 Nonculturable NTM
- caused of Leprosy or Hansen’s disease (chronic
disease of skin, mucous membranes, and nerve
tissue)
-M. leprae is the only one species that has not yet
cultivated in vitro
- Incubation time : 2-10 years (doubling time ~14 days)
- Natural habitat: human, armadillo
- it could be cultivated in armadillo
and footpads of mice
- most prevalent in tropical countries
- Infection is acquired from infected patients (human
to human) through close contact, nasal secretion
• Intracellular infection (WBC, nerve cell)
• Pathogen → upper respiratory tract → blood
circulation → skin & nerve (temperature < 37 oC)
• Skin : hypopigmentation, papule, nodule, skin
infiltration
• Nerve : peripheral neuropathy
• clinical manifestation :
1. Tuberculoid leprosy : mild symptoms
(low HMI, low rate of transmission)
2. Lepromatous leprosy : severe symptoms
(low CMI, high rate of transmission)
Diagnosis
- Direct stain: acid-fast stain
- Culture: Similar to MTB (except M. leprae)
Treatment
- Many infections caused by NTMs are resistant
to primary regimen of antituberculous agents.
(at least four agents).
• Mycoplasmas หมายถึงเชื้อที่เปนสมาชิกใน
genus Mycoplasma และ genus Ureaplasma
Family : Mycoplasmataceae
Class : Mollicutes (soft skin, สิ่งมีชีวิตเซลลเดียวขนาด
เล็กที่สุด ไมมีผนังเซลล และสามารถดํารงชีวิต
อยางอิสระ)
• การจําแนก species นิยมใชโครงสรางแอนติเจน และโครงสราง
ทางพันธุกรรม
• Mycoplasmas พบเปน normal flora ในสัตวเลี้ยงลูกดวยนม, สัตว
มีกระดูกสันหลัง แมลง และพืช
• เปน normal flora ในคนบริเวณเยื่อเมือกบุผิว
• ไมมีผนังเซลล เซลลถูกลอมดวยเยื่อหุม เซลลเทานั้น ( จึงไมสามารถยอมติดสี
แกรม )
• มีสาร sterol เปนสวนประกอบของเยื่อหุม เซลล ( ไมมใี นแบคทีเรียทั่วไป )
• มีขนาดและรูปรางไมแนนอน
M. pneumoniae มีรูปแทง ปลายเรียว หรือเปนสาย
U. urealyticum, U. hominis มีรูปกลม
• มีขนาดเล็กมากคลายไวรัส (แยกดวยการแบงตัว, DNA+RNA,
เพาะเลี้ยงไดดวยอาหารเลี้ยงเชื้อ)
• สวนใหญเปน facultative anaerobe (M. pneumoniae เปน strict
aerobe)
• อาศัยอยูภายนอกเซลล (extracellular bacteria) แตสามารถพบ
เชื้อภายในเซลลได
• พบการกอโรคไดทั้งในคน สัตว และพืช
• Protein และ glycolipid ในชั้น cell membrane มีคุณสมบัติเปน
antigen แตสามารถเกิด x-reaction กับ เชื้อแบคทีเรียชนิดอื่นและ
เซลลคนได
• ดื้อตอยากลุม ที่ออกฤทธิ์กับผนังเซลล
• ขนาดสารพันธุกรรมเล็กกวาแบคทีเรียอื่น
• ตองการสารอาหารพิเศษจากภายนอก เชน sterol ซึ่งเปน
สวนประกอบของ cell membrane
• มีอัตราการเจริญชา ระยะเวลาแบงตัวนาน ตางกันไปตาม species
• เชื้อตายงายในสภาวะแวดลอมไมเหมาะสม เชน ในที่แหง อุณหภูมิ
สูง
• M. pneumoniae ( โรคติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจ )
• M. hominis ( เปน normal flora ในระบบสืบพันธุ, กอโรคในระบบ
ทางเดินปสสาวะและอวัยวะสืบพันธุ )
• U. urealyticum ( พบอาศัยอยูไดบริเวณอวัยวะสืบพันธุ กอโรคใน
ระบบทางเดินปสสาวะและอวัยวะสืบพันธุ )
• กอใหเกิดการติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจเปนสําคัญ
• Route of infection : ทางการหายใจ (ละอองอากาศที่ปนเปอน)
• ระยะฟกตัว : 2-3 สัปดาห
• การกอโรค : อาศัยโปรตีน P1 adhesin รวมกับโปรตีนชนิดอื่นที่
cell membrane ในการเกาะติดกับ receptor ที่สวนฐานของ cilia
ของเซลลเยื่อบุทางเดินหายใจ และทําใหเกิดภาวะ cilliostasis
(ยับยั้งการทํางานของ cilia) และทําลายเซลลเยื่อบุผิว จนเชื้อ
สามารถเขาสูทางเดินหายใจสวนลางและกอใหเกิดการติดเชื้อ
• ปจจัยการกอโรค : ยังไมทราบแนชัด ( hemolysin, inflammation,
autoantibody)
• อาการทางคลินิก : อาการไมรุนแรง – อาการรุนแรง
• อาการในระยะแรกมักคลายไขหวัดใหญจากเชื้อไวรัส ในระยะ
หลังมีการไอพรอมเสมหะเปนมูกเปนเลือด
• เด็กเล็กและผูสูงอายุอาจมีอาการรุนแรง
• โรคติดเชื้อทางเดินหายใจที่พบบอยสุด คือ หลอดลมอักเสบ
• การติดเชื้อในเด็กเล็ก : โรคติดเชื้อในทางเดินหายใจสวนบน
• การติดเชื้อในเด็กโตและผูใหญ : โรคติดเชื้อในทางเดินหายใจ
สวนลางและโรคปอดบวม (atypical pneumonia อาการไมคอย
รุนแรงเมื่อเทียบกับโรคปอดบวมที่เกิดจากแบคทีเรียชนิดอื่น,
community-acquired pneumonia)
• โรคสามารถหายไดเองใน 1-2 สัปดาห
( ยาปฏิชีวนะจะลดระยะเวลาดําเนินโรค )
• ผูปวยโรคเอดสมักพบการติดเชื้อแบบลุกลามเขาสูอวัยวะตางๆ
และรักษาไดยาก
• การวินิจฉัยโรคโดยพิจารณาจากการตรวจพบเชื้อจากสิ่งสง
ตรวจอาจเกิดความผิดพลาด เพราะเชื้อสามารถอยูใน
ทางเดินหายใจไดหลังจากหายจากโรคแลว ดังนั้นควรอาศัย
ลักษณะอาการทางคลินิกควบคูดวยเสมอ
• สิ่งสงตรวจ : เก็บจากตําแหนงที่ติดเชื้อ เชน เสมหะ น้ําจาก
เยื่อหุมปอด
การตรวจพิสูจนเชื้อ
• การตรวจโดยตรง : เชื้อเล็กมากและไมติดสียอมแกรม (จึงไม
มีประโยชน) แตสามารถตรวจหา antigen หรือสารพันธุกรรม
ของเชื้อได
• การเพาะเชื้อ : M. pneumoniae มีอัตราการเจริญชาตอง
เพาะเลี้ยงในอาหารที่มี sterol เปนสวนผสม เปนเวลานาน
กวา 21 วัน จึงมีความยุง ยาก ไมเหมาะสมกับหอง Lab ทั่วไป
• การทดสอบทางชีวเคมี : ไมนิยมทํา เพราะเชื้อหลาย species
ใหผลการทดสอบคลายกัน
• การทดสอบทาง serology : คนทั่วไปอาจมี antibody ตอเชื้อ
Mycoplasma ที่เปน normal flora บริเวณทางเดินปสสาวะ
และระบบสืบพันธุได จึงไมนิยมทํา การตรวจหา antigen มี
ขั้นตอนยุงยากไมนิยมทําในหองปฏิบัติการทั่วไป
• การตรวจหาสารพันธุกรรม : มีบทบาทมากขึ้น แตมักทําใน
หองปฏิบัติการอางอิง
• ยากลุม tetracyclines และ macrolides เปน drug of choice
ของ M. pneumoniae
(แตถา เชื้อสัมผัสยาแลว มีโอกาสดือ้ ยาได ; acquired resistance)
• ระวังการแพรกระจายเชื้อจากผูปวย
• วัคซีนปองกันโรคติดเชื้อ M. pneumoniae มีประสิทธิภาพต่ําและไม
เปนที่นิยม
• Murray PR et al. Medical Microbiology. 2005
• Nancy AK. Tuberculosis: Pathophysiology, Clinical
Features, and Diagnosis. Clinical journal of the
American association of Critical-Care Nurses. 2009.
• ภัทรชัย กีรติสิน. วิทยาแบคทีเรียการแพทย พิมพครั้งที่ 2. กรุงเทพฯ:
หจก. วี. เจ. พริ้นติง้ , 2551