Download Reverse transcriptase

Reverse transcription
1970 Temin ค้ นพบเอนไซม์จากไวรัส (viral enzyme) ที่เปลี่ยน RNA เป็ น DNA
เรี ยกว่า RNA-directed DNA polymerase หรื อ reverse transcriptase
mRNA
Reverse transcriptase
หรือ RNA-directed DNA polymerase
cDNA
(complementary DNA
Reverse transcriptase
- สังเคราะห์สาย DNA จากปลาย 5’  3’
- ต้ องใช้ primer (tRNA) เป็ นจุดเริ่มต้ นของการสังเคราะห์ cDNA
Reverse transcriptase มี 3 activities ที่ใช้ ในการทางานของไวรัส
1. RNA-directed DNA polymerase activity:
เติม nucleotides เพื่อใช้ ในการสังเคราะห์ cDNA
2. RNase H: exonuclease สาหรับย่อย tRNA primer เมื่อมีการสังเคราะห์ cDNA แล้ ว
3. DNA-directed DNA polymerase:
สังเคราะห์ ssDNA (single-stranded DNA)หลังจากที่ tRNA primer ถูกย่อยแล้ วด้ วย
Rnase H แล้ ว
Transcription
mRNA capping
polyadenylation
nucleus
Cap
poly(A)
Splicing
Cap
poly(A)
cytoplasm
mRNA transport
Cap
poly(A)
Translation
mRNA decay
Translation
RNA
(mature mRNA)
Protein
•
5’ cap structure - 7-methyl guanosine residue
•
3’ poly(A) tail - ~200 adenosine residues in mammals
~60 in yeast
•
Start codon - this defines the end of the
5’ untranslated region (5’UTR)
•
Stop codon - this defines the start of the
3’untranslated region (3’UTR)
stop
start
Cap
5’UTR
ORF
3’UTR
poly(A)
Prokaryotic ribosome
Eukaryotic ribosome
แบ่งได้ 3 stages:-
•
Initiation -
การนา (Recruitment) ribosome ลงบน mRNA
และจดจา (Recognition) จุดเริ่มต้ น(start codon)ของการ
translation
•
Elongation - การเคลื่อนที่ของ ribosome ไปบน mRNA
และแปรรหัส (Decoding) ของ mRNA และสังเคราะห์
สายโปรตีน (polypeptide chain)
•
Termination - การจดจารหัสหยุด (Recognition of the stop codon)
และปลดปล่อย ribosome และสาย protein ออกจาก
mRNA
Translation initiation คือขบวนการที่ ribosome
(และ initiator methionyl tRNA) ถูกนา (recruited) ลงไปที่ start
codon.
เป็ นขบวนการที่ซบั ซ้ อน แบ่งได้ 4 ขั ้นตอนคือ
1.
การเตรี ยม 40S ribosomal subunit/ methionyl tRNAi
2. การเตรี ยมและการคัดเลือก mRNA
(mRNA selection and preparation)
3. การจับกันของ 40S ribosome และ mRNA, การสแกนและการจดจา AUG
(40S/ mRNA binding, scanning and AUG recognition)
4.
การจับกันของ 40S และ 60S subunit
(60S ribosomal subunit joining)
f-Met-tRNAfMet
: tRNA ที่จดจา AUG
(GUG, UUG, prokaryotic)
COOH
3’-OH
5’-P
60S
60S
3
3
40S
40S 1A
1A
1
Ternary
complex
M
2
5
GTP
M
GTP
2
GDP
3 M GTP
5 2
1
1A
GDP
2B
2
GTP
•
The mRNA is bound by eIF4F (eIF4E, eIF4G, eIF4A)
•
Pab1 binds the poly(A) tail and may recruit eIF4F
•
eIF4B and eIF4H facilitate the helicase activity of 4A
eIF3 in the 40S complex and eIF4G in the mRNA
complex interact
4G
4E
4B 4A
Cap 4H
3 5 M GTP
1 2
1A
AUG
• The 40S complex scans each codon in a 5’ to 3’ direction
looking for an AUG.
• The eIF4A helicase activity irons out RNA hairpins
allowing the 40S complex to move.
• ATP hydrolysis is required
4G
4E
4B 4A
Cap 4H
3 5 M GTP
1 2
1A
AUG
3 5 M GTP
1 2
1A
Cap
AUG
• eIF5 stimulates the GTPase activity of eIF2 leading to
loss of most of the initiation factors
M
1A
Cap
AUG
GDP
3
1
5
2
60S
5B
M
1A
Cap
AUG
GTP
5B 1A
GDP
M
Cap
AUG
3
50S
1
3
30S
30S
fM
1
2
50S
fM
GTP
GTP
2 1
16SrRNA 3
SHINE
AUG
DELGARNO
fM
GTP
2 1
16SrRNA 3
SHINE
AUG
DELGARNO
3
50S
1
GDP
fM
2
16SrRNA
SHINE
DELGARNO
AUG
• Smaller ribosomal subunits (30S and 50S)
• Prokaryotic translation occurs co-transcriptionally and often there are
several open reading frames in a single mRNA i.e. polycistronic mRNAs
• During initiation the ribosome directly interacts with the mRNA via the
Shine Delgarno sequence (directly upstream of each ORF).
• Initiation is much less complicated than eukaryotes (Just three
initiation factors IF1, IF2 and IF3)
• Elongation and termination similar to eukaryotes
Defined as the sequential addition of amino acids to the carboxyterminal end of the nascent peptide.
Relies on three tRNA binding sites in the ribosome:1. The A site amino-acyl tRNA binding site
2. The P site peptidyl tRNA binding site
3. The E site where the empty tRNA is ejected from the ribosome
naa
aa
aa
aa aa
5’
E P A
3’
mRNA
Four major steps:-
1. Amino acyl tRNA binding in the A site
2. GTP hydrolysis and guanine nucleotide exchange on eEF1A
3. Peptide bond formation
4. Translocation of mRNA and peptidyl-tRNA on the
ribosomal surface
eEF1B
aa
GDP
eEF1A
Amino-acyl
tRNA binding
naa
aa
aa
aa aa
E P A
5’
GTP
eEF1A
3’
naa
aa
aa
aa
E P A
5’
mRNA
3’
mRNA
Peptidyl
transfer
n+1aa
n+1aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
5’
E P A
3’
5’
E P A
mRNA
mRNA
translocation
eEF= eukaryotic elongation factor
GTP
eEF2
3’
GDP
eEF2
• Catalysed by eRF1 (eukaryotic release factor).
• eRF1 recognises all three stop codons and its crystal
resembles a tRNA even though it is a protein.
structure
• Hence the molecular mimicry model predicts that eRF1 gives
termination by binding the ribosome in a similar way to tRNA.
• eRF3 stimulates eRF1 activity in a GTP-dependent manner