Download lietuvos sveikatos mokslų universitetas

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES
LITHUANIAN VETERINARY ACADEMY
Eugenijus Jacevičius
EPIDEMIOLOGY, DIAGNOSIS AND
PREVENTION OF INFECTIOUS BOVINE
RHINOTRACHEITIS IN LITHUANIA
Summary of the Doctoral Dissertation
Agricultural Sciences, Veterinary Medicine (02A)
Kaunas, 2012
The work has carried out at the Department of Infectious Diseases of
Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences in
2005–2011.
Scientific supervisor – Prof. Dr. Algirdas Šalomskas (Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary Medicine – 02 A).
The thesis is defended at the Council of Science of Veterinary
Medicine of the Veterinary Academy of the Lithuanian University of
Health Sciences:
Chairman – Prof. Dr. Ingrida Monkevičienė (Veterinary Academy of
the Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences,
Veterinary Medicine – 02 A).
Members:
Dr. Irena Klimienė (Veterinary Institute of the Veterinary Academy of
the Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences,
Veterinary Medicine – 02 A);
Dr. Mykolas Mauricas (State Research Institute Center for Innovative
Medicine, Biomedical Sciences, Biology – 01 B);
Prof. Dr. Algimantas Paulauskas (Vytautas Magnus University,
Biomedical Sciences, Biology – 01 B);
Dr. Dainius Zienius (Veterinary Institute of the Veterinary Academy of
the Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences,
Veterinary Medicine – 02 A).
Opponents:
Prof. Dr. Rasa Želvytė (Veterinary Academy of the Lithuanian
University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary Medicine –
02 A);
Prof. Habil. Dr. Aniolas Sruoga (Vytautas Magnus University,
Biomedical Sciences, Biology – 01 B).
Public defence of doctoral dissertation in Veterinary Science Council
will take place at the Veterinary Academy of Lithuanian University of
Health Sciences auditorium of Dr. S. Jankauskas 1 p. m. on 18 May 2012.
Address: Tilžės str. 18, LT-47181 Kaunas, Lithuania.
The summary of the doctoral dissertation was sent on 18 April 2012
according to the confirmed address list. The doctoral dissertation is available
at the library of Veterinary Academy of Lithuanian Uninersity of Health
Science.
Address: Tilžės str. 18, LT-47181 Kaunas, Lithuania.
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Eugenijus Jacevičius
GALVIJŲ INFEKCINIO RINOTRACHEITO
EPIDEMIOLOGINĖ PADĖTIS, DIAGNOSTIKA,
PROFILAKTIKA IR PREVENCIJA LIETUVOJE
Daktaro disertacijos santrauka
Žemės ūkio mokslai, veterinarinė medicina (02A)
Kaunas, 2012
Disertacija rengta 2005–2011 metais Lietuvos sveikatos mokslų
universiteto Veterinarijos akademijoje.
Mokslinis vadovas – Prof. dr. Algirdas Šalomskas (Lietuvos sveikatos
mokslų universiteto Veterinarijos akademija, žemės ūkio mokslai,
veterinarinė medicina – 02 A).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
Veterinarijos akademijos Veterinarinės medicinos mokslo krypties
taryboje:
Pirmininkė – prof. dr. Ingrida Monkevičienė (Lietuvos sveikatos
mokslų universiteto Veterinarijos akademija, žemės ūkio mokslai,
veterinarinė medicina – 02 A).
Nariai:
Dr. Irena Klimienė (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos
akademijos Veterinarijos institutas, žemės ūkio mokslai, veterinarinė
medicina – 02 A);
Dr. Mykolas Mauricas (Valstybinis mokslinių tyrimų institutas
Inovatyvios medicinos centras, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B);
Prof. dr. Algimantas Paulauskas (Vytauto Didžiojo universitetas,
biomedicinos mokslai, biologija – 01 B);
Dr. Dainius Zienius (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
Veterinarijos akademijos Veterinarijos institutas, žemės ūkio mokslai,
veterinarinė medicina – 02 A).
Oponentai:
Prof. dr. Rasa Želvytė (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
Veterinarijos akademija, žemės ūkio mokslai, veterinarinė medicina –
02 A);
Prof. habil. dr. Aniolas Sruoga (Vytauto Didžiojo universitetas,
biomedicinos mokslai, biologija – 01 B).
Disertacija bus ginama viešame Veterinarinės medicinos mokslo
krypties tarybos posėdyje 2012 m. gegužės 18 d. 13 val. Lietuvos sveikatos
mokslų universiteto Veterinarijos akademijos dr. S. Jankausko auditorijoje.
Adresas: Tilžės g. 18, LT-47181 Kaunas, Lietuva.
Disertacijos santrauka išsiuntinėta 2012 m. balandžio 18 d. pagal
patvirtintą sąrašą.
Disertaciją galima peržiūrėti LSMU Veterinarijos akademijos
bibliotekoje.
Adresas: Tilžės g. 18, LT-47181 Kaunas, Lietuva.
INTRODUCTION
The first report about respiratory infectious bovine rhinotracheitis was
published in 1954 (Schroeder and Moys, 1954). The disease was
characterised by high fever, agalactia and the symptoms of damage of the
respiratory tract. Later the name of the disease was proposed and accepted –
infectious bovine rhinotracheitis (Mckercher et al., 1955).
The agent of infectious bovine rhinotracheitis (IBR) is the virus of the
Varicellovirus genus (BoHV-1) of the Alphaherpesvirinae subfamily of the
Herpesviridae family. This is one of the most widespread viruses in the
world bovine population due to which many countries engaged in cattle
breeding suffer great economic losses due to decreased milk production,
fertilisation problems, a loss of bovine younger animals, and abortions
caused by the disease. Carriers of this virus could be not only domestic
cattle but also wild ruminants (Kendrick et al., 1987, Thiry et al., 1988,
Afshar and Eaglesome, 1990, Veselinovič and Medič, 1992, Oirchot et al.,
1993, Kaashoek et al., 1996, Hage et al., 1998, Frolich et al., 2002, Frolich
et al., 2006). In-depth investigations into both domestic and wild animals
carried out showed that the agent of IBR is widespread not only in the
groups of domestic ruminants but also among the wild ruminants grazing in
freedom (Kalman and Egyed, 2005). The circulation of this virus in the
population of wild ruminants can have a great significance to eradication
and controlling the virus in the population of domestic animals in Europe.
All the more so that transfer of BoHV-1 among different species of animals
has not been fully investigated thus far (Lillehaug et al., 2003, Kalman and
Egyed, 2005, Frolich et al., 2006).
BoHV-1 infection is related to two major syndromes called infectious
bovine rhinotracheitis and infectious pustular vulvovaginitis (IPV). The
variety of other clinical symptoms is characteristic of the cattle infected with
these viruses: conjunctivitis, encephalitis and abortions (Pastoret et al.,
1982, Ackermann and Engels, 2006). Also, this virus is an important factor
determining the development of a complex of many other diseases
especially bovine respiratory diseases (BRD) because BoHV-1 genome
codes several albumens, which take part in suppressing a response of the
immune system of the organism (Turin et al., 1999, Jones and Chowdhury,
2007, Jones and Chowdhury, 2010). Though after infection with BoHV-1 an
immune response of the organism develops, the virus never leaves the
organism of the infected animals, and the latter remain latent carriers of this
virus for the rest of their life. The protective immunity that forms after the
disease is not long-term, and the animals can become sick repeatedly
(Mechor et al., 1987, Madic et al., 1995, Babiuk et al., 1996, Schynts et al.,
5
2001, Ackermann and Engels, 2006). Stress may cause an acute condition of
latent infection therefore viruses can periodically be shed into the
environment. Therefore the main source of IBR in the herd are the cattle that
had been sick with that disease, which become latent carriers of BoHV-1
and disseminate viruses by means of direct contact or through aerosols, and
bulls – with their semen (Vossen et al, 2002, Jones, 2003, Favoreel et al.,
2003).
BoHV-1 infection is noted for a great variety of clinical symptoms.
Since the course of many infections brought about by this virus is
subclinical, control measures are to be applied to eradicate the infection
itself rather than to suppress the symptoms. Economically IBR is a very
important disease. Alongside other dangerous infectious diseases, IBR
control is regulated by Part II of Annex E to Directive of the European
Union 64/432/EEB. Therefore seeking to eradicate this disease it is
recommended to approve national control programmes.
BoHV-1 infection, as a cause of the disease, can be diagnosed on the
basis of clinical, pathological and epidemiological features. However, to
confirm the diagnosis laboratory tests are necessary. In this case complex
laboratory diagnostics is based on the detection of the virus itself or its
components and specific antibodies to this virus (Parsonson and Snowdon,
1975, Mars et al., 2000). The majority of methods applied in virology are
suitable for determining IBR. However, these methods differ in their
sensitivity and specificity. Therefore in practice it is expedient to apply
different methods that complement one another. Also, it is expedient to
make use of the research methods with the help of which it would be
possible to investigate biological properties of viruses. This is especially
important in assessing IBR prevalence on cattle farms in Lithuania.
Until 1996, in Europe, IBR was diagnosed in all the countries in which
investigations were carried out; however, the distribution of BoHV-1 was
not even. The campaign of eradication this disease was launched in the
Scandinavian countries where IBR was diagnosed much rarer. At the present
time IBR has been eradicated in Denmark, Sweden, Finland, Austria and in
the province of Bolzano in Italy. Germany has achieved much in fighting
IBR (Decision of the EEA Joint Committee 2007/584/EB, Nardelli et al.,
2008).
In Lithuania IBR has been started to be investigated more extensively
since 1993. At that time the greatest attention was devoted to eradication of
the disease in the herds of bulls – semen producers. By 1997, all
seropositive bulls and all infected semen series had been removed from
artificial insemination (AI) centres (Šalomskas et al., 1998). Later
investigations showed that having implemented these measures bulls of
6
those enterprises were not infected again though during laboratory tests
individual seropositive bulls kept under quarantine were periodically
detected (Mockeliūnas et al., 2003). However, the IBR condition on
industrial dairy farms practically has not been investigated, prevalence of
the disease on the national scale has not been analysed. A significant spread
of IBR in the herds of dairy cattle in Lithuania, enzooticity of this disease
and primary investigations carried out show that much attention should be
devoted to the investigation into the epidemiological situation of this disease
because only then will it be possible to prepare and apply scientifically
substantiated programmes of diagnosing the disease, its prophylaxis,
controlling and eradicating it and thus to reduce prevalence of IBR on cattle
farms, as well as to minimise economic losses incurred by this disease.
Objective of study
To investigate the epidemiology of infectious bovine rhinotracheitis in
cattle farms of Lithuania, to carry out comparative investigations in the
methods of diagnosing IBR, as well as to perform investigations of active
and passive immunity and the efficiency of IBR control and prophylaxis.
Goals of study
1. To carry out the analysis of prevalence of cattle diseases and causes
of the loss of cattle in Lithuania.
2. To establish prevalence of the infectious bovine rhinotracheitis virus
on cattle farms in Lithuania.
3. To investigate epidemiology of infectious bovine rhinotracheitis in
Lithuania.
4. To carry out a comparative assessment of methods of IBR laboratory
diagnostics.
5. To assess the possibilities of the polymerase chain reaction in
diagnosing the acute BoHV-1 infection.
6. To carry out investigations into prevalence of IBR and other viral
infections (parainfluenza-3, respiratory syncytial virus, bovine viral
diarrhoea virus) in cattle population.
7. To evaluate IBR preventative measures taken in Lithuania and their
effectiveness.
Novelty of study and its scientific value
1. Prevalence of the IBR virus on cattle farms in Lithuania has been
determined.
2. The influence of the size of a cattle herd, cattle age and sex on
prevalence of IBR has been established.
7
3. The risk of the IBR virus infection frequency according to the
distribution of the seropositive cattle has been established.
4. Sensitivity and specificity of the diagnostics method of the enzymelinked immunosorbent assay (ELISA Ab) of antibodies to IBR viruses have
been assessed.
5. Possibilities of the use of polymerase chain reaction in diagnosing the
acute BoHV-1 infection have been assessed.
6. Peculiarities of prevalence of IBR and other viral infections
(parainfluenza-3, respiratory syncytial virus, bovine viral diarrhoea virus) in
a cattle population have been compared.
7. The efficiency of IBR control and prophylaxis measures has been
assessed.
Practical importance of study
It has been proved that when ELISA Ab and polymerase chain reaction
(PCR) methods are applied together it is possible to ensure a fast and
efficient detection of the IBR virus carriers in a cattle herd.
It has been established that the PCR method is applied to detect BoHV-1
in clinical and pathological material thus ensuring the confirmation of the
diagnosis of being infected with BoHV-1.
IBR eradication and prophylaxis measures have been assessed. As a
result of that it will be possible to create new IBR eradication and
prophylaxis measures to be taken in cattle farms of Lithuania.
The draft of the national IBR eradication programme has been drawn up
and presented.
RESEARCH MATERIALS AND METHODS
The study was carried out at the Department of Infectious Diseases of
the Lithuanian Veterinary Academy (since 1 September 2010, the
Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences), at the
Veterinary Institute of Veterinary Academy and the Virology Research
Division of the Laboratory Department of the National Food and Veterinary
Risk Assessment Institute between 2005 and 2011. All investigations were
carried out in accordance with requirements laid down in the Order No. B1639 of the Director of the State Food and Veterinary Service of the Republic
of Lithuania adopted on 22 January 2009: on keeping, breeding and using
animals for experimental and other scientific purposes (Official Gazette
Valstybės žinios No. 8-287, 22 January 2009).
8
Subject of investigations
In 2005–2010, investigations of infectious bovine rhinotracheitis from
blood serum were carried out by means of the method of the enzyme-linked
immunosorbent assay. The material for serological investigations was
collected from different cattle farms in Lithuania. Samples were collected
from different age and sex animals at random. Cattle from 37 districts of
Lithuania (n=15368) raised on randomly chosen farms and herds of different
number of cattle were investigated. Samples were taken from both the
farms, which had problems about health of the cattle and from the farms,
which kept herds of healthy cattle and which required the possibility of
BoHV-1 prevalence on these farms to be investigated. Serum samples of a
total of 15368 cattle were serologically investigated.
Investigations of clinical and pathological material of cattle were
performed using the polymerase chain reaction. The investigations were
performed in 24 herds of cattle. A total of 193 samples of clinical and
pathological material were studied.
Sampling methods
Blood samples for serological tests were taken sterilely from the jugular
or caudal vein in 10 ml vacuum tubes without anticoagulant. Blood taken
was kept for one hour at room temperature, then kept at +4oC temperature
overnight. Sera were poured into plastic tubes 1 ml each, numbered and kept
at minus 20ºC temperature until the investigation.
Lungs samples and the nasal cavity discharges for PCR tests were taken
from calves aged one to twelve months.
Clinical and epidemiological investigations
The data about cattle productivity and the type of farm management
were taken from the Department of Statistics of the Republic of Lithuania
(2000 Statistical Yearbook of Lithuania, 2003 Statistical Yearbook of
Lithuania). The dynamics of prevalence of cattle diseases and mortality was
assessed on the basis of official yearly reports of the State Food and
Veterinary Service applying the retrospective research method.
For preliminary study sera samples (n=360) from randomly selected
cattle in nine high productivity dairy farms were tested for antibodies to
BoHV-1 at the Division of Virology Research of the National Food and
Veterinary Risk Assessment Institute.
To carry out comparative studies of diagnostics methods of infectious
bovine rhinotracheitis three age groups of cattle were formed – cattle
younger than 3 months, between the ages of 3 and 9 months, and cattle older
than 9 months. Total 81 samples of bovine sera were investigated by ELISA
9
and virus neutralization (VN) methods.
To compare prevalence of BoHV-1 infection with other bovine viral
diseases in Lithuania, in parallel investigations into IBR, PI-3, RSV and
BVD virus prevalence by ELISA were performed. For detection of
antibodies to PI-3 and BVD viruses 558 samples were tested. For detection
of antibodies to RSV and IBR viruses – 538 samples were tested.
Seroprevalence to all mentioned viruses on 19 farms with herds larger than
200 cattle located in 11 districts has been analysed.
Samples for investigations of passive and active immunity were taken
from two farms, in which applied similar cattle breeding technology and
kept the same number of cattle. In the farms were kept about 1500 cattle,
1000 of them were older than 3 months age. In those farms cattle were kept
in very similar conditions. However, the essential difference was that the
cattle of one farm were vaccinated against IBR, whereas the cattle of the
other farm were unvaccinated. Seeking to establish the duration of passive
and active immunity, 96 samples of blood serum were investigated.
When carrying out clinical and epidemiological investigation attention
was paid to the features characteristic of IBR endemics. Clinical and
epidemiological investigations concerning IBR endemics were carried out in
random pedigree cattle farms considering to consideration the data of
serological studies of the National Food and Veterinary Risk Assessment
Institute, clinical observation of the health of the herds. The material for
investigations was taken from five cattle farms in which pathological
anatomic and clinical symptoms characteristic of IBR were determined.
During the investigation of the efficiency of infectious bovine
rhinotracheitis control measures in 54 farms were analysed in which
periodical IBR investigations were carried out, part in IBR eradication
programmes was taken, the cattle were vaccinated, IBR monitoring was
conducted and selection of the IBR seropositive cattle was made.
Enzyme-linked immunosorbent assay
Commercial standardised Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
kits (Institute Pourquier, France and IDEXX, USA) were used for the
detection of antibodies to BoHV-1 gB and gE glycoproteins and to
investigate blood samples for BVD, PG-3 and RSV infections. ELISA was
performed according the producer manual.
Comparative evaluation of diagnostic methods
In the course of investigations a comparative evaluation of standard virus
neutralisation (VN) and gB ELISA methods used in IBR diagnostics was
made. Blood samples collected (n=81) were divided taking into
10
consideration animal groups by age. 100 TCID50 viral particles/ 0.1 ml of
BoHV-1 “4019” strain were used in the VN reaction. The data obtained by
means of different research methods were compared assessing sensitivity
and specificity of the reactions according to the recommendations of
Kramps and the World Organization for Animal Health (Kramps et al.,
1999).
Polymerase chain reaction (PCR)
DNR extraction from the samples of homogenate organs or discharge
from the nostrils was carried out by means of phenol – chloroform- isoamyl
alcohol and Genomic methods. During PCR 35 amplification cycles were
completed: +95ºC 1 min., +56ºC 1 min. and +72ºC 1 min. To complete the
final amplification a three-minute longer procedure +72ºC was carried out.
The product of 468 nucleotide pairs was obtained during PCR. Cattle
herpesvirus-1 oligonucleotides primers were used during PCR (Vilcek,
1993): P1(sense): 5´-CAC GGA CCT GGT GGA CAA GAA G-3´ and
P2(antisense): 5´-CTA CCG TCA CGT GCT GTG TAC G-3´.
Viruses and cell cultures
The Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cell line was used for virus
propagation. Cells were cultivated in Minimum essential medium Eagle
(MEM) with 10% fetal calf serum (FCS, “Biochrom”, Germany). Standard
“4019” BoHV-1 strain was used in the studies. Viruses were adapted and
propagated in MDBK cell cultures after 2 to 6 passages. The cell monolayer
formed was washed three times with MEM without serum prior to
inoculation and virus suspension was poured on the cells. The amount of
viral suspension poured was such that the infecting dose should equal 0.1-1
of infecting doses of tissue cultures per cell (0.1-1 TCID50). The infected
cells were incubated in an incubator at +37o C temperature for 48-72 hours
up to 70-90% of the establishment of the cytopathogenic effect (CPE).
Virus neutralisation reaction (VN)
Prior to carrying out the VN reaction, the virus of BoHV-1 “4019” strain
was titrated and its titre in MDBK cell culture amounted to 10 6,5TCID50/ml
(50% of the tissue culture infection dose). The VN reaction was performed
by means of micro-method using MDBK cell culture, which was not
contaminated with pestiviruses, with 100 TCID50.
Prior to the investigation blood serums were inactivated by heating in a
water bath at +56o C temperature for 30 min. The samples were titrated on a
micro-plate with 96 wells using the medium of cell cultures as a diluent. The
highest dilution, in which viruses are neutralised in 50% of the wells, i.e.
11
when CPE is completely stopped, is considered to be the titre of the VN
reaction.
Assessment of statistical data
Statistical calculations were made at the Department of Infectious
Diseases of the Lithuanian Veterinary Academy of the Lithuanian
University of Health Sciences, the Veterinary Institute of the Veterinary
Academy and the National Food and Veterinary Risk Assessment Institute.
The statistical data analysis was performed of the computer programme
“Graph Prism 3.0TM”. The Student t test and the data calculated are
regarded to be significant when p< 0.05.
The confidence interval (CI) of serological prevalence of the BoHV-1 in
a cattle population and significance of differences in the prevalence
percentage, with the confidence level 95%, was calculated by means of
Dimension Research, Inc. programme.
RESULTS AND DISCUSSION
Analysis of disease prevalence and mortality of cattle in Lithuania
During the first stage of investigations, the analysis of the data of cattle
treatment, which were collected until 2002 only, showed that during the
period between 1999 and 2002 up to 13.9% of all cattle kept in Lithuania
suffered from one or another disease. Most often diseases of digestive
system and respiratory organs were recorded. In 1999, as much as 5.0% and
2.6% of cattle kept at that time, respectively, suffered from these diseases.
In later years the incidence of calves falling ill with the diseases of the
digestive system and respiratory organs gradually decreased, and in 2002
they accounted for 3.4% and 1.8%, respectively.
When analysing the data it was established that the majority of the cattle
were rejected due to udder diseases (9.7%) and reproductive disorders,
infertility and genital diseases (11.9%). At that time only 1% of cattle were
rejected due to infectious diseases. During the period between 1999 and
2002 of 402 thousand cattle were treated, of which 26 thousands (6.5%) of
cattle died.
During the period between 1999 and 2002 mainly cattle died from the
diseases of respiratory organs. In 2002, the cattle mortality rate from the
diseases of the digestive system increased (10.5%). However, diseases of
respiratory organs were much more dangerous because many more animals
died of these diseases (14%).
The results of these investigations correspond with the data obtained by
other investigators who maintain that 37.8% of dead calves had lung or
12
intestine injuries (Večerek et al., 2003). There are more data about the
highest mortality rate of the calves from enteritis and pneumonia (Sivula et
al., 1996). The larger incidence of diseases of calves and their mortality
from enteritis and respiratory diseases can be accounted by a wide spread of
viral diseases such as bovine viral diarrhoea, infectious bovine
rhinotracheitis, rotaviral enteritis, coronaviral infection and bacterial
infections (Šalomskas et al., 1997, Mockeliūnienė et al., 2004, Milius et al.,
2005).
Diagnostic investigations of infectious bovine rhinotracheitis in the
herds of pedigree cattle
During the second stage of investigations the condition of IBR was
analysed in typical herds of highly productive cattle. In cattle on seven
(77.8%) out of nine chosen farms were detected antibodies to BoHV-1
viruses. When analysing the data it was established that IBR was more often
detected in a group of cows, especially old ones (p< 0.01). In some herds
86.7% of cows were seropositive, i.e. carriers of BoHV-1 viruses.
On average, 45.5% of the cattle under investigation were infected with
BoHV-1 viruses, however, it was not clear whether our chosen methods of
laboratory diagnostics was sufficiently sensitive and specific, therefore
during the third stage of study comparative investigations of IBR
diagnostics methods was conducted.
Comparative investigations of diagnostics methods of infectious
bovine rhinotracheitis
The comparative assessment of the Enzyme-linked immunosorbent assay
of antibodies (ELISA Ab) used in the preliminary investigation of IBR
serological prevalence and standard virus neutralisation (VN) methods was
performed by means of each method in determining IBR seropositive
animals. The data of the investigations are presented in Table 1.
Table 1. Distribution of BoHV-1 infection research data in cattle
groups by age depending on the diagnostics methods applied
Cattle
group
< 3 months
3-9 months
> 9 months
Total:
Number of cattle
under study,
n
24
32
25
81
N
19
22
11
52
13
Number of positive
VN
ELISA Ab
%
N
%
79.2
21
87.5
68.8
22
68.8
44.0
10
40.0
64.2
53
65.4
The data presented in Table 1 shows that by means of both the VN and
ELISA Ab methods statistically the same number of cattle that reacted
serologically (p< 0.05) was established. However, the results of the
investigations into the groups of different age differed. The greatest number
of inconsistencies was found in the group of calves under 3 months of age
where 8.3% more seropositive individuals were found when examining
them with the ELISA method than when using the standard VN method.
Though these differences were not statistically significant, in practice such
research results can have an influence on the quality of investigations
therefore seeking to make clear differences in the results of blood serum
tests received by means of the standard VN and ELISA Ab sensitivity and
specificity of ELISA Ab was assessed according to the calculation schemes
recommended by the World Organization for Animal Health.
Though ELISA Ab was noted for high diagnostic sensitivity and
specificity exceeding 90%, causes of inconsistency between the VN and
ELISA Ab results were further analysed. For that purpose data of standard
VN and ELISA Ab reactions were classified according to the titre groups.
The highest inconsistency in ELISA Ab and VN results were obtained in
the group of calves under three months of age and in the samples where
antibody titres were low. Since the majority of calves of that age can have
colostrial antibodies BoHV-1, this inconsistency is of no great significance
to serological diagnostics of IBR infection therefore in further serological
investigations namely the ELISA Ab research was applied. Scientific
investigations conducted in other countries confirm that too (Van Oirschot
et al., 1997, Wellenberg et al., 1998, Ballagi et al., 1999). At the present
time the following serological research methods are often used to diagnose
IBR infection: virus neutralisation (VN) and enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). These methods are most often made use of to determine
antibodies to the BoHV1 virus in blood serum (Kramps et al., 1993).
Besides, gE ELISA is also used in determining antibodies to the BoHV-1
virus in cattle herds in which the marker vaccine had been used (Van
Oirschot et al., 1997).
Epidemiological investigations of infectious bovine rhinotracheitis
Having carried out the investigations provided for in the fourth stage,
antibodies to infectious bovine rhinotracheitis were detected in blood sera
samples of 1839 cattle, which accounted for 11.97% of all samples studied.
Having made the analysis of the data of the investigations by the year of
conducting the investigations, it was established that the greatest number of
cattle infected with the IBR virus was in 2009 – 17.88% (CI 15.07–20.69).
On the basis of the investigations performed between 2005 and 2007, a
14
tendency for the number of IBR seropositive animals to decrease was
observed – in 2005 – 12.13% (CI 11.14–13.12), in 2006 – 10.80% (CI
10.04–11.56), in 2007 – 9.54% (CI 8.35–10.73). However, the
investigations performed in 2008 showed that 16.68% (CI 14.93–18.43) of
the cattle under investigation were IBR seropositive. In 2007, considerably
fewer seropositive cattle (9.54%) than in 2009 – 17.88% (CI 15.07–20.69,
p≤0.05) were found. The average of IBR seropositive cattle investigated
between 2005 and 2009 accounted for 11.97% (CI 11.46–12.48).
Having made the analysis of the data of the investigations by the size of
cattle herds it was established that the largest per cent of IBR Ab positive
cattle (14.79%) was in those cattle herds, which contained more than 200
animals. In the herds containing from one to 200 cattle the number of
seropositive cattle was statistically much smaller (5.58%) than in the cattle
herds containing more than 200 animals (14.79%, p≤0.05). Hence,
dependence of the spread of IBR on the number of cattle in a herd was
established, i.e. the more cattle were kept in one herd a larger part of cattle
was infected with BoHV-1.
It was also established that the greatest BoHV-1 seroprevalence was in a
group of cows – 34.64% (CI 32.97–36.31), and the smallest one was among
bull-calves – 2.01% (CI 1.27–2.75). BoHV-1 seroprevalence in the group of
heifers accounted for 10.01% (CI 9.23–10.79), and in the group of younger
animals it amounted to 4.41% (CI 3.82–5.00).
The analysis of the influence of the cattle age on IBR prevalence in
cattle herds was also made. Having carried out the investigations it was
established that in the groups of cattle of the ages between 0 and 4 months,
and between one and two years the number of seropositive cattle differed
insignificantly and fluctuated from 4.26% (CI 3.7–4.84) to 6.69% (CI 5.95–
7.43). However, beginning with the age of 2–3 years the number of
seropositive cattle is rapidly on the increase. In the group of animals of the
ages between 2 and 3 years this percentage was 18.26% (CI 16.56–19.96),
and in the group where the cattle is older than 7 years seropositive animals
accounted 53.98% (CI 49.03–58.93, p≤0,05) (Fig. 1).
Our epidemiological investigations showed that despite the control
measures that have been taken thus far, between 2005 and 2009 from
12.13% to 17.88% of all investigated cattle was infected with BoHV-1.
More often IBR was serologically diagnosed in the herds in which
concentration of the cattle was great, rarer IBR occurred on small farms.
Our investigations show that cows were infected with BoHV-1 most
often, heifers were infected rarer, and BoHV-1 developed among bull-calves
and younger animals the least. The analysis of the influence of the cattle age
on IBR prevalence in cattle herds in Lithuania showed that the IBR infection
15
prevalence in the age groups of younger animals was even and depended on
the age very insignificantly, however, in other cattle groups, beginning with
the age of 2–3 years it had a great influence on the spread of BoHV-1
infection, i.e. the older the cattle the greater serological spread of BoHV-1
was. On the basis of our research data, the following tendency can be
observed: with the number of cattle in a herd increasing, the risk of bovine
BoHV-1 prevalence in a herd increases, i. e., the greater number of the cattle
is kept in one herd, the more infected animals there are in it. Scientists of
other countries also noticed dependence of BoHV-1 prevalence on the size
of a herd and the cattle age (Boelaert et al., 2000, Woodbine et al., 2009).
60
52.81 53.98
50
40
26.30 28.70
30
34.46
%
18.26
20
10
6.54 5.55 6.69
4.26
0
0 - 4 5 - 6 7 - 12 1 - 2 2 - 3 3 - 4 4 - 5 5 - 6 6 - 7 > 7
monthmonthmonth year year year year year year year
Fig. 1. BoHV-1 infection prevalence by cattle age groups
Geographical features of infectious bovine rhinotracheitis
prevalence in Lithuania
The analysis of geographical BoHV-1 prevalence carried out during the
fifth stage of study shows that between 2005 and 2009 the number of
seropositive cattle was greatest in the following districts: in Šiauliai –
22.69%, Kaunas – 19.51%, Marijampolė – 17.26% and Utena – 15.74%.
The number of seropositive cattle in other districts was much smaller: in
Panevėžys – 7.77%, in Alytus – 2.76%, in Vilnius – 2.55%, in Telšiai –
1.54%, in Klaipėda – 0.85%, and in Tauragė – 0.53%. Having analysed the
results of the investigations it was established that BoHV-1 infection
prevailed in the districts of southern, central and northern Lithuania.
16
BoHV-1 infection investigation by means of the polymerise chain
reaction (PCR)
As can be seen from the investigations, BoHV-1 viruses are wide-spread
in a cattle population in Lithuania. We have also established that cattle
respiratory diseases, though they are in the third place according to their
prevalence, are very difficult to be healed therefore animals die of them
most often. Because BoHV-1 is one of the most important agents of the
complex of cattle respiratory diseases, during the sixth stage of our
investigations we investigated the significance of these viruses in etiology of
cattle diseases.
The investigations carried out by means of the PCR method confirmed
that in five out of 24 cattle herds (20.83%) the cause of respiratory diseases
of endemic nature of calves was BoHV-1. Having examined samples of
lungs and discharge from the nostrils of 193 calves from one to twelve yearold calves, BoHV-1 nucleoacid was detected in 19 cases, or 9.84%. The data
presented in the Table 2 show that BoHV-1 is usually detected in lung
samples as many as 4.4 times more often than in the discharge from the
nostrils of the sick calves (p=0.004). When comparing the results of the lung
sample tests with the average of positive samples (9.84%) a significant
difference was also obtained (p=0.037; Table 2).
Table 2. Results of investigations into the calves with respiratory
diseases for infectious bovine rhinotracheitis by means of the PCR
method
Subject of
investigation
Discharge from
nostril
Lung samples
Total
Number of
animals, n
Number of
positive, n
Percentage
of positive
CI, %
160
10
6.25
3.42–11.12
33
193
9
19
27.27
9.84
15.07–44.22
6.39–14.86
Further was analysed the epidemiological situation in the herds in which
in calves with respiratory diseases were diagnosed IBR by means of the
PCR.
The data of the investigations showed that during the outbreak of BoHV1 infection the percentage of positive samples is from 40% to 100%. Nine
(52.9%) out of 17 examined lung samples were positive, when examining 16
samples of the discharge from the nostrils the number of positive ones stood
at 10 (62.5%). However, this difference was not statistically significant, that
is, it can be stated that these investigations were of equal value from the
point of view of diagnostics.
17
The PCR method has not been applied to determine BoHV-1 viruses in
the country thus far. The objective of the investigations carried out was to
assess the possibilities of the polymerase chain reaction in diagnosing the
acute BoHV-1 infection. Thus far it has been thought that the latent IBR
form is characteristic of Lithuania, however, our PCR investigations showed
that the cause of bronchopneumonia of calves could often be IBR viruses
too.
A rapid spread of BoHV-1 in a herd can be explained by the fact that
during observation respiratory diseases were diagnosed for younger animals.
The data of the investigations coincided with the data obtained by other
scientists who established that BoHV-1 spread in a herd in an aerogenic way
much faster than in a contact way (Mars et al., 2000). Our selected and
applied the diagnostic PCR method allowed the rapid diagnosis of IBR. It
was established that on all five chosen farms where calves suffered from
respiratory diseases, one cause of disease and mortality was BoHV-1. The
results obtained also showed that only 20.83% of cases of the outbreak of
respiratory diseases were caused by BoHV-1 infection. Therefore in
diagnosing respiratory diseases in calves is necessary to take into
consideration the spread of other pathogens, especially parainfluenza-3 and
respiratory syncytial viruses in cattle herds.
Comparison of BoHV-1 infection prevalence with other bovine viral
diseases in Lithuania
During the seventh stage of work our investigations were aimed at
making a complex analysis of the prevalence of infectious viral bovine
diseases, serologically studying the prevalence of IBR, bovine
parainfluenza-3 (PI-3), bovine respiratory syncytial virus infection (RSV)
and bovine viral diarrhoea (BVD) in cattle herds. During the investigation
were detected antibodies against all four viral diseases on most cattle farms
(14 out of 19 farms, 73.7%), and only on five (26.3%) farms were detected
antibodies against two or three viral diseases.
When analysing the investigations carried out it was established that on
84.2% of the farms studied the cattle that had antibodies to IBR viruses were
found. The cattle that had antibodies to PI-3 and RS viruses were detected
on 95% of the farms studied. BVD infection was detected on 85% of farms.
On average, 30.5% of cattle had antibodies to BVD, 72.2% of cattle had
antibodies to PI-3, on 54.5% of cattle were detected RS viral infection, and
43.4% – BVD. The number of the seropositive cattle found differed on
different farms. The number of the cattle that had antibodies to PI-3 viruses
fluctuated from 28% to 93.3%. The seropositive cattle distributed
themselves even more when examining RSV, IBR and BVD viral infections
– from 12.5% to 100%, from 2.4% to 100% and from 6.7% to 94.4%,
18
respectively.
In summing up the investigations of laboratory diagnostics of PI-3, RSV,
IBR and BVD viral infections it can be stated that the said viruses are
extremely widespread and might be the cause of respiratory diseases that
have manifested themselves recently. Our investigations confirm the
supposition that viruses causing respiratory diseases in Lithuania are very
widespread, and the cause of bronchopneumonia can be not only BoHV-1
viruses causing infectious bovine rhinotracheitis. Our investigations also
showed that the spread of PI-3 viruses raises especially many problems, and
a similar situation is recorded in other countries of the world where
intensive cattle breeding is developed (Norstrom et al., 2001, Sardi et al.,
2002). It can be stated that PI-3, RS and IBR viruses, together with BVD
viruses is the main cause of respiratory diseases in large herds of high
productivity.
Investigations into passive and active immunity
During the eighth stage of work investigations into a passive and active
immunity of calves were carried out. The results of blood serum tests of
detection of antibodies to IBR virus glycoprotein gB is presented in Fig. 2.
When studying the data we see that calves of the ages from one week to two
months of the unvaccinated naturally infected cows were all seropositve.
120
100 100 100 100
100
100
100
.
87,5
Positive, %
80
100 100
87,5
62,5
60
37,5
40
20
0
7
30
60
120
Age of calves by days
Farm No. 1
180
270
Farm No. 2
Fig. 2. Dynamics of antibodies to virus glycoprotein gB in groups of
calves of different age
Note: calves of Farm No. 1 were unvaccinated; calves of farm No. 2
were vaccinated on the 90th day of their life
19
gB Ab OD
The number of seropositive calves has decreased to 37.5% in a
vaccinated herd (farm No. 2) of calves of the age of two months. The part of
seropositive calves in an unvaccinated group of calves (farm No. 1) changed
insignificantly. The percentage dynamics of the age of seropositive calves
was investigated in determining antibodies to IBR virus glycoprotein gE too.
The data analysed show that all the calves up to the age of two months were
seropositive in the unvaccinated herd (farm No. 1). The number of
seropositive calves decreased to 12.5% in the age group of four months,
whereas the number of seropositive calves in the groups of older calves
constantly increased. No seropositive calves were detected in the herd of
vaccinated cattle (farm No. 2) at all.
When analysing the dynamics of antibodies to IBR virus glycoprotein
gB it was established that antibody titres of the calves born in the herd of the
unvaccinated cattle differed very insignificantly from the antibody titres of
the calves born to the vaccinated cows. However, natural colostrum
immunity of the calves on farm No. 1 was more durable, whereas antibody
titres in the group of age of 60 days were much higher than those of the
calves born to the vaccinated cows (Fig. 3).
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
7
30
60
120
180
270
Age of calves by days
Farm No. 1
Farm No. 2
Fig. 3. Dynamics of titre of antibodies to virus glycoprotein gB
Titre of antibodies of seropositive calves expressed in optical density.
Note: calves of farm No. 1 were unvaccinated; calves of farm No. 2 were
vaccinated on the 90th day of their life
20
The analysis of the investigations of antibodies to IBR virus glycoprotein
gE in the group of the unvaccinated calves (farm No. 1) showed that the
highest antibody titres (OD < 0.1) were detected for the calves in the age
groups 7 and 180 days. The antibody titre in the groups of calves of the age
of 120 days decreased. The lowest antibody titre of the seropositive calves
was detected in the group of calves of the age of 270 days. Antibodies to
IBR virus glycoprotein gE in the herd of the vaccinated calves (farm No. 2)
not detected.
Investigations into the dynamics of antibody titres showed that the
duration of passive immunity after vaccination was shorter though antibody
titres for seven-day-old calves were higher. A constant increase in antibody
titres in the groups of older calves can be explained by getting infected with
BoHV-1 field strain (farm No.1) and the effect of vaccination (farm No.2).
The investigation into the antibodies titres to IBR virus glycoprotein gE
confirmed effectiveness of vaccination. This investigation showed that
infected calves were not detected in the vaccinated herd in all, whereas in
the herd of the unvaccinated calves this investigation confirmed the spread
of the IBR virus. Investigations into the dynamics of antibody titres carried
out by other authors for the vaccinated cattle and the cattle experimentally
infected with pathogenic BoHV-1 viruses also showed the efficiency of
vaccine against IBR (Kaashoek et al., 1996, Bosch et al., 1998, Kamaraj et
al., 2009).
Investigation of effectiveness of infectious bovine rhinotracheitis
control measures
According to our data, by the end of 2010 year in 54 farms were applied
IBR control measures. Their largest part limited themselves to periodical
investigations into BoHV-1 sero-distribution (67.86%) only. In 28 farms
(51.85%) carried out eradication and monitoring programmes. Ten farms
(18.52%), due to a too large number of seropositive cattle, vaccinated them
with marker vaccines. Hence, less than one per cent of the farms in which
the control animals were kept carried out the programmes. Three of the
farms had the status of the IBR free herd, which accounted for as little as
0.05% of a total number of all pedigree cattle herds.
We established that only a small part of the farms applied IBR control
measures. However, those 28 farms where the eradication and monitoring
programmes were carried out faced with problems of implementing the
programme.
Hence, most often the farms failed to follow such instructions provided
for in IBR eradication plans as adequate handling of documents and clinical
examination of the herd performed according to the plan. Vaccination was
21
most often given adequately since both owners of the cattle and veterinary
surgeons devote much attention to this part of the programme. There were
eight farms (28.57%) where everything that was provided for in the
programme was done. Five of them performed vaccine IBR prophylaxis. On
these farms the number of the infected cattle prior to the beginning of
vaccination was from 11.2% to 52.3%. Following our control investigations
conducted on these farms, 20-24 months after the beginning of vaccination,
it was established that after vaccination the number of the seropositive cattle
decreased to 0% on four out of five farms, that is, no new BoHV-1 infection
cases were diagnosed, with the exception of one farm where the number of
the seropositive cattle decreased by as many as 2.4 times (from 45% to
18.6%) after vaccination. In our opinion, the vaccinated cattle do not
become infected, and older seropositive cows are liquidated and their
number decreases. Thus, it can be stated that constant vaccination of the
entire herd is the most suitable way to eradicate BoHV-1 infection.
Investigations into the efficiency of vaccination were conducted in other
countries too, where it was also indicated that vaccination of cattle
decreased the number of IBR cases and put a stop to the spread of BoHV-1
(Mars et al., 2001, Nardelli et al., 2008).
The investigations carried out showed that on the chosen farms the
majority of highly productive cows were seropositive therefore to eradicate
IBR infection the method of depopulation would not be efficient in
Lithuania. On the basis of experience of German, Belgian, French and
Dutch scientists and veterinary surgeon-practitioners, it could be
recommended to use the marker vaccine to eradicate IBR/BIPV in some
herds (Eloit, 1997, Wiseman, 1997, Bosch et al., 1998, De Wit et al., 1998).
The positive feature of this vaccine is that the vaccinated cattle can be
distinguished from the infected ones by means of serological and molecular
biological techniques (Siebert et al., 1995, Strube et al., 1996, Bosch et al.,
1998).
Assessment of a threat of bringing BoHV-1 to Lithuania with
imported cattle
IBR are widespread in Lithuania, however, it is for 5 years already that
the disease is being eradicated in the 28 herds of highly productive cows,
and three farms are officially free from IBR. The situation is very different
in different countries of the European Union, so in buying cattle the risk of
infection getting into the cattle herds of our country is different, therefore in
2004 the European Commission adopted the decision to divide the Member
States of the Community in groups according to the spread of IBR viruses
and to apply control measures against this disease. In 2010, the list of the
22
countries was supplemented. There is no risk of infecting our cattle with
IBR in importing the cattle from Denmark, Austria, administrative units of
Upper Pfalce and Upper Frankonia of Federal Land of Bavaria, Germany,
the province of Bolzano in northern Italy, Finland, Sweden, a small risk
remains when importing cattle from the Czech Republic, Germany – all the
regions (with the exception of the administrative units of Upper Pfalce and
Upper Frankonia of Federal Land of Bavaria, Germany), the autonomous
region of Friuli-Veneza Giulisa in Italy and Autonomous province of Trent,
a great risk of becoming infected with IBR remains when importing cattle
form other EU states not mentioned here (Decision of the European
Commission 2010/433/EU).
According to the data of the State Animal Breeding Supervision Service
under the Ministry of Agriculture, in 2006 year 959 pedigree beef cattle
were imported to Lithuania. The majority of them (633 heads, or 66%) were
brought from France and Ireland, that is, from the countries where IBR is
widespread and the possibility of infection is high. At the same time the
number of dairy heifers imported totalled 1975. The majority of them (1415
heads, or 71.6%) were bought in Germany and Denmark where IBR was
either eradicated or very little widespread due to strict control. Hence, the
possibility of bringing BoHV-1 viruses together with the heifers being
imported is very small, with the exception of those cases when heifers were
purchased in the Netherlands (21.4% of the total import of heifers in 2006).
Therefore during the quarantine period the cattle are to be examined for IBR
antibodies.
CONCLUSIONS
1. As much as 26.7–77.8% of cattle are infected with the infectious
bovine rinotracheitis virus on highly productive cattle farms, and prevalence
of the IBR virus in the cattle population in Lithuania consists for 11.9%.
Since 2008 an increasing tendency for a spread of viruses has been revealed.
2. Prevalence of the IBR virus depends on the size of a cattle herd. In the
herds containing from one to 200 cattle the percentage of infected animals
were 5.58% and in the herds with more than 200 cattle this figure stood at
14.8%.
3. The spread of the IBR virus is influenced by the age of cattle too. It
was established that IBR prevalence in the group of cattle older than 7 years
accounted for 57%, and the smallest prevalence was discovered in the
groups of cattle of the ages between 0 and 4 months and between one and 2
years (4.3% and 6.7%). The IBR virus was extremely widespread among the
23
cows – 34.6%, and it was the least spread among the bulls – 2%.
4. ELISA Ab is noted for high sensitivity (96.3%) and specificity
(90.6%) therefore it is recommended to use for serological investigations of
infectious bovine rinotracheitis.
5. The PCR investigations carried out showed that only BoHV-1
infection was the cause of the outbreak of cattle respiratory diseases in
20.8% of cases therefore it is necessary to take into consideration the spread
of other viruses (PI-3, RSV, BVD) in cattle herds.
6. Having made a complex analysis of the spread of viruses it was
established that 30.5% of cattle had been ill with IBR, 72.2% – with PI-3,
54.5% – with RSV infection, 43.4% of cattle had been ill with BVD. It was
established that on the majority of farms the cattle had been ill with four
diseases, which proves that these viruses can be the cause of respiratory
diseases.
7. It was established by investigations that passive immunity of the
calves born to the unvaccinated cows lasted up to two months and was more
durable than that of the calves born to the vaccinated cows.
8. Investigations of the efficiency of vaccination show a very high
protective efficiency of vaccines on the farms where the cattle are
vaccinated. No new cases of IBR infection were detected, and the number of
the infected cattle decreased from 52.3 to 0%.
PRACTICAL RECOMMENDATIONS
To prevent IBR and other respiratory infections from getting into farms
it is recommended to put the imported cattle under quarantine and to
examine them by means of serological methods.
In exercising IBR control on the farms it is recommended to carry out
serological investigations to establish carriers of viruses. To prevent a
spread of a disease on a farm, carriers of viruses and the infected animals
must be separated from the healthy ones. It is necessary to ensure that the
personnel servicing the farm should not spread IBR agents.
It is recommended to use marker vaccines and carry out investigations
according to the devised IBR eradication programmes on the farms where
IBR is very widespread.
The programme “Control of infectious bovine rinotracheitis (IBR) in
pedigree cattle herds” is presented.
24
LIST OF PUBLICATIONS
1. Mockeliūnas R., Sederevičius A., Šalomskas A., Mockeliūnienė V.,
Mačiulskis P., Jacevičius E. Galvijų ligų paplitimo ir gaišimo priežasčių
Lietuvoje analizė. Veterinarija ir Zootechnika. 2005. T. 32 (54). P. 16–19.
(In Lithuanian).
2. Šalomskas A., Mockeliūnienė V., Jacevičius E., Lelešius R.,
Mockeliūnas R., Kliučinskas R., Petkevičius S. Galvijų infekcinio
rinotracheito ir virusinės diarėjos diagnostikos ir prevencijos problemos.
Veterinarija ir Zootechnika. 2006. T. 33 (55). P. 16–21. (In Lithuanian).
3. Šalomskas A., Jacevičius E., Kęstaitienė K., Petkevičius S.,
Lukauskas K., Liutkevičienė V., Milius J., Venskutonis D., Mockeliūnas R.,
Jokimas J. Ekonomiškai svarbių virusinių ligų paplitimas galvijų bandose.
Veterinarija ir Zootechnika. 2008. T. 41(63). P. 95–100. (In Lithuanian).
4. Jacevičius E., Šalomskas A., Milius J., Petkevičius S., Mockeliūnas
R., Jacevičienė I., Lelešius R., Pridotkas G. Prevalence and control measures
of infectious bovine rhinotracheitis in Lithuania“. Veterinarmedicinas raksti.
2008. P. 49–53. ISSN 1407–1754.
5. Šalomskas A., Jacevičius E. Galvijų infekcinio rinotracheito
paplitimas ir vakcinacijos efektyvumas. VetInfo, 2008/4 (60). P. 58–61. (In
Lithuanian).
6. Jacevičius E., Šalomskas A., Petkevičius S., Jacevičienė I., Milius J.,
Pridotkas G.. Seroprevalence of antibodies to bovine herpesvirus Type 1 in
cattle in Lithuania. Proceedings of the International Veterinary Laboratory
Scientific and Applied Conference. ISBN 978-9984-39-865-5. 2009.
P. 41–42.
7. Jacevičius E., Šalomskas A., Milius J., Petkevičius S., Jacevičienė I.,
Pridotkas G., Mockeliūnas R., Malakauskas A., Morkūnas M. Five year
serological study of bovine herpesvirus type-1 in cattle in Lithuania. Bull
Vet Inst Pulawy. 2010. Vol. 54. P. 289–292.
25
ĮVADAS
Pirmasis pranešimas apie galvijų kvėpavimo takų infekcinį rinotracheitą
publikuotas 1954 metais (Schroeder and Moys, 1954). Liga buvo apibūdinta
dideliu karščiavimu, agalaktija ir kvėpavimo takų pažeidimo simptomais.
Vėliau buvo pasiūlytas ir priimtas ligos pavadinimas – galvijų infekcinis
rinotracheitas (Mckercher et al., 1955).
Galvijų infekcinio rinotracheito (GIR) sukėlėjas – Herpesviridae šeimos
Alphaherpesvirinae pošeimio Varicellovirus genties virusas (BoHV-1). Tai
vienas labiausiai pasaulio galvijų populiacijoje paplitusių virusų, dėl kurio
daugelis galvijininkystę praktikuojančių šalių patiria didelių ekonominių
nuostolių dėl sumažėjusios pieno produkcijos, apvaisinimo problemų,
galvijų prieauglio netekimo, ligos sukeltų abortų. Šio viruso nešiotojai gali
būti ne tik naminiai galvijai, bet ir laukiniai atrajotojai (Kendrick et al.,
1987, Thiry et al., 1988, Afshar and Eaglesome, 1990, Veselinovič and
Medič, 1992, Oirchot et al., 1993, Kaashoek et al., 1996, Hage et al., 1998,
Frolich et al., 2002, Frolich et al., 2006). Šio viruso cirkuliacija laukinių
atrajotojų populiacijoje gali turėti didelės reikšmės likviduojant ir
kontroliuojant virusą naminių galvijų populiacijoje Europoje. Tuo labiau
kad BoHV-1 perdavimas tarp skirtingų gyvūnų rūšių dar nėra iki galo
ištirtas (Lillehaug et al., 2003, Kalman and Egyed, 2005, Frolich et al.,
2006). BoHV-1 infekcija siejama su dviem pagrindiniais sindromais,
vadinamais galvijų infekciniu rinotracheitu ir infekciniu pustuliniu
vulvovaginitu (IPV). Šis virusas yra svarbus veiksnys, lemiantis daugelio
kitų ligų, ypač galvijų respiratorinių ligų komplekso (GRLK), vystymąsi,
nes BoHV-1 genomas koduoja keletą baltymų, dalyvaujančių slopinant
organizmo imuninės sistemos atsaką (Turin et al., 1999, Jones and
Chowdhury, 2007, Jones and Chowdhury, 2010). Nors užsikrėtus BoHV-1
virusais vystosi organizmo imuninis atsakas, virusas niekada nepasišalina iš
užsikrėtusių gyvulių organizmo, ir jie visą gyvenimą išlieka latentiniais šio
viruso nešiotojais (Mechor et al., 1987, Madic et al., 1995, Babiuk et al.,
1996, Schynts et al., 2001, Ackermann and Engels, 2006, 188). Stresas gali
sukelti latentinės infekcijos paūmėjimą, dėl to virusai gali periodiškai sklisti
į aplinką. Todėl pagrindinis GIR šaltinis bandoje yra galvijai, kurie, persirgę
šia liga, tampa latentiniais BoHV-1 nešiotojais ir platina virusus tiesioginio
kontakto ar oro lašeliniu būdu, o buliai – su sperma (Vossen et al, 2002,
Jones, 2003, Favoreel et al., 2003).
BoHV-1 infekcija pasižymi didele klinikinių simptomų įvairove.
Kadangi daugelio šio viruso sukeltų infekcijų eiga yra subklinikinė, turi būti
taikomos kontrolės priemonės pačiai infekcijai likviduoti, o ne simptomams
slopinti. GIR yra ekonomiškai labai svarbi liga. Kartu su kitomis
26
pavojingomis užkrečiamosiomis ligomis GIR kontrolė reglamentuojama
Europos Sąjungos (ES) Direktyvos 64/432/EEB E priedo II dalimi. Todėl
šios ligos likvidavimui rekomenduojama patvirtinti nacionalines kontrolės
programas.
BoHV-1 infekcija, kaip ligos priežastis, gali būti įtariama remiantis
klinikiniais, patologiniais ir epidemiologiniais požymiais. Tačiau, norint
patvirtinti diagnozę, reikalingi laboratoriniai tyrimai. Kompleksinė
laboratorinė diagnostika šiuo atveju remiasi paties viruso arba jo
komponentų ir specifinių antikūnų šiam virusui nustatymu (Parsonson and
Snowdon, 1975, Mars et al., 2000). Metodai skiriasi jautrumu ir
specifiškumu. Todėl yra tikslinga praktikoje taikyti skirtingus, vienas kitą
papildančius metodus. Taip pat tikslinga naudotis tyrimo metodais, kuriais
būtų galima tyrinėti virusų biologines savybes. Tai aktualu, vertinant GIR
plitimą tarp Lietuvos galvijų ūkių.
Europoje GIR iki 1996 metų buvo diagnozuojama visose šalyse, kur tik
buvo atlikti tyrimai, tačiau BoHV-1 išplitimas nebuvo tolygus.
Skandinavijos šalyse, kur GIR diagnozuotas rečiau, buvo pradėta ligos
likvidavimo kampanija. GIR yra likviduota Danijoje, Švedijoje, Suomijoje,
Austrijoje ir Italijos Bolzano provincijoje. (ES Komisijos sprendimas
2007/584/EB, Nardelli et al., 2008).
Lietuvoje GIR plačiau pradėtas tyrinėti nuo 1993 metų. Tuo metu
didžiausias dėmesys buvo skiriamas ligos likvidavimui bulių – spermos
donorų bandose. Iki 1997 metų veislininkystės įmonėse buvo likviduoti visi
seroteigiami buliai ir visos užkrėstos spermos serijos (Šalomskas et
al.,1998). Vėlesni tyrimai parodė, kad įgyvendinus šias priemones
veislininkystės įmonių buliai daugiau nebeužsikrėtė, nors laboratorinių
tyrimų metu periodiškai buvo aptinkami pavieniai seroteigiami karantine
esantys buliai (Mockeliūnas et al., 2003). Tačiau GIR padėtis pramoniniuose
pienininkystės ūkiuose praktiškai netirta, anksčiau atlikti tyrimai buvo
nedidelės apimties, ligos paplitimas visos šalies mastu nėra analizuotas.
Ženklus GIR išplitimas Lietuvos pieninių galvijų bandose, šios ligos
enzootiškumas ir atlikti tyrimai rodo, kad reikia skirti daug dėmesio šios
ligos epidemiologinės situacijos nagrinėjimui, nes tik tada bus galima
parengti ir efektyviai taikyti ligos diagnostikos, profilaktikos, kontrolės bei
moksliškai pagrįstas ligos likvidavimo programas ir taip sumažinti GIR
paplitimą galvijų ūkiuose bei šios ligos sukeliamus ekonominius nuostolius.
Darbo tikslas
Ištirti galvijų infekcinio rinotracheito epidemiologinę padėtį Lietuvos
galvijų ūkiuose, atlikti GIR diagnostikos metodų lyginamuosius tyrimus,
27
pasyvaus ir aktyvaus imuniteto bei GIR kontrolės ir profilaktikos
efektyvumo tyrimus.
Darbo uždaviniai
1. Atlikti galvijų ligų paplitimo ir gaišimo priežasčių analizę Lietuvoje.
2. Nustatyti galvijų infekcinio rinotracheito viruso paplitimą Lietuvos
galvijų ūkiuose.
3. Ištirti galvijų infekcinio rinotracheito epidemiologinius ypatumus.
4. Atlikti GIR laboratorinės diagnostikos metodų palyginamąjį
ivertinimą.
5. Įvertinti polimerazės grandininės reakcijos galimybes diagnozuojant
ūmią BoHV-1 infekciją.
6. Atlikti GIR ir kitų virusinių infekcijų (paragripo 3, respiratorinių
sincitinių virusų infekcijos, galvijų virusinė diarėja virusų) paplitimo
tyrimus galvijų populiacijoje.
7. Apžvelgti ir įvertinti Lietuvoje taikomas GIR prevencijos priemones ir
jų efektyvumą.
Darbo naujumas ir mokslinė reikšmė
1. Nustatytas GIR viruso paplitimas Lietuvos galvijų ūkiuose.
2. Nustatyta galvijų bandos dydžio, galvijų amžiaus ir lyties įtaka GIR
išplitimui.
3. Nustatyta GIR virusų infekcijos dažnumo rizika pagal seroteigiamų
galvijų pasiskirstymą.
4. Įvertintas diagnostikoje naudojamo antikūnų GIR virusams
imunofermentinės analizės (IFA Ak) diagnostikos metodo jautrumas ir
specifiškumas.
5. Įvertintos polimerazės grandininės reakcijos panaudojimo galimybės
diagnozuojant ūmią BoHV-1 infekciją.
6. Palyginti GIR ir kitų virusinių infekcijų (paragripo 3, respiratorinių
sincitinių virusų infekcijos, galvijų virusinės diarėjos virusų) paplitimo
ypatumai galvijų populiacijoje.
7. Įvertintas GIR kontrolės ir profilaktikos priemonių efektyvumas.
Darbo praktinė reikšmė
Įrodyta, kad kartu taikant IFA Ak ir polimerazės grandininės reakcijos
(PGR) metodus, galima užtikrinti greitą ir efektyvų GIR viruso nešiotojų
nustatymą galvijų bandoje.
Nustatyta, kad PGR metodas yra tinkamas aptikti BoHV-1 klinikinėje ir
patologinėje medžiagoje, taip užtikrinant užsikrėtimo BoHV-1 diagnozės
patvirtinimą.
28
Įvertintos GIR likvidavimo ir profilaktikos priemonės, ko pasėkoje bus
galima sukurti naujas GIR likvidavimo ir profilaktikos programas galvijų
ūkiams.
Sukurtas ir pateiktas GIR likvidavimo programos projektas.
TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODIKA
Mokslinis tiriamasis darbas buvo atliktas 2005-2011 metais Lietuvos
veterinarijos akademijoje (nuo 2010 09 01 Lietuvos sveikatos mokslų
universiteto Veterinarijos Akademija) Užkrečiamųjų ligų katedroje,
Veterinarijos institute ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos
vertinimo instituto Laboratorijos departamento Virusologinių tyrimų
skyriuje. Visi tyrimai atlikti laikantis 2009 01 22 Lietuvos Respublikos
valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymu priimto
įstatymo reikalavimų: dėl gyvūnų, skirtų eksperimentiniams ir kitiems
mokslo tikslams, laikymo, priežiūros ir naudojimo Nr. B1-639 („Valstybės
žinios”, 2009 01 22, Nr. 8-287).
Tyrimų objektas
2005–2010 metais Lietuvoje buvo atliekami galvijų infekcinio
rinotracheito tyrimai iš kraujo serumo imunofermentinės analizės metodu.
Medžiaga serologiniams tyrimams rinkta iš įvairių Lietuvos galvijų ūkių.
Mėginiai buvo imami iš įvairaus amžiaus ir lyties galvijų atsitiktinės
atrankos būdu. Ištirti 37 Lietuvos rajonuose auginami galvijai (n=15368)
atsitiktinai pasirinktuose ūkiuose ir įvairaus dydžio galvijų bandose.
Mėginiai buvo renkami tiek iš ūkių, kuriuose buvo problemų dėl galvijų
sveikatos, tiek ir iš ūkių, laikančių sveikas bandas, kuriose buvo norima
ištirti galimą BoHV-1 paplitimą. Iš viso serologiškai buvo ištirti 15368
galvijų serumo mėginiai.
Galvijų klinikinės ir patologinės medžiagos tyrimai buvo atliekami
naudojant polimerazės grandininę reakciją. Tyrimai atlikti 24 galvijų
bandose. Iš viso ištirti 193 klinikinės ir patologinės medžiagos mėginiai.
Klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai
Tyrimams duomenys apie galvijų produktyvumą ir ūkių valdymo tipą
paimti iš Lietuvos statistikos departamento (Lietuvos statistikos metraštis,
2000, Lietuvos statistikos metraštis, 2003). Galvijų ligų paplitimo ir gaišimo
dinamika vertinta pagal oficialias VMVT metines ataskaitas, taikant
retrospektyvųjį tyrimo metodą.
GIR padėties tyrimams labai produktyvių pieninių galvijų bandose
pasirinkti devyni veislinių galvijų ūkiai, kuriuose atsitiktinai parinktiems
29
galvijams (n=360) Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo
instituto (NMVRVI) Virusologinių tyrimų skyriuje buvo atliekamas
antikūnų BoHV-1 tyrimas kraujo serume.
Galvijų infekcinio rinotracheito diagnostikos metodų lyginamiesiems
tyrimams atlikti buvo sudarytos trys galvijų amžiaus grupės – jaunesni kaip
3 mėn., 3-9 mėn. ir vyresni kaip 9 mėn. Iš viso IFA ir VN metodais buvo
ištirtas 81 galvijo kraujo serumo mėginys.
BoHV-1 infekcijos paplitimo palyginimui su kitomis galvijų virusinėmis
ligomis Lietuvoje lygiagrečiai atlikome GIR, PG-3, RSV ir GVD virusų
paplitimo tyrimus imunofermentine analize. Atliekant tyrimus dėl antikūnų
PG-3 ir GVD virusams, ištirti 558 mėginiai, o dėl antikūnų RSV ir GIR
virusams – 538 mėginiai. Išanalizuotas šių virusų paplitimas 11 rajonų
esančiuose 19 ūkių, kur buvo laikomos didesnės nei 200 galvijų bandos.
Pasyvaus ir aktyvaus imuniteto tyrimams mėginiai paimti iš dviejų
panašią galvijų auginimo technologiją taikančių, vienodą galvijų skaičių
laikančių ir greta esančių ūkių. Siekiant nustatyti pasyvaus ir aktyvaus
imuniteto laikotarpį, ištirti 96 kraujo serumo mėginiai. Klinikinių ir
epidemiologinių tyrimų metu atkreiptas dėmesys į GIR endemijoms
būdingus požymius. Galvijų infekcinio rinotracheito kontrolės priemonių
efektyvumo tyrimo metu buvo analizuojami 54 ūkiai, kuriuose buvo
atliekami periodiniai GIR tyrimai, dalyvaujama GIR likvidavimo
programose, galvijai vakcinuojami, vyko GIR stebėsena ir GIR seroteigiamų
galvijų atranka.
Imunofermentinės analizės (IFA Ak) metodas antikūnams nustatyti
Kraujo mėginių tyrimams buvo naudojami komerciniai standartizuoti
imunofermentinės analizės (IFA) rinkiniai (Institute Pourquier, Prancūzija
IDEX, JAV). Jie skirti antikūnams BoHV-1 virusų gB ir gE glikoproteinams
nustatyti kraujo serume ir piene. Kraujo mėginių tyrimams dėl GVD, PG-3
ir RS virusų infekcijų naudoti komerciniai standartizuoti imunofermentinės
analizės (IFA) rinkiniai (Institute Pourquier, Prancūzija). IFA atlikta,
laikantis diagnostinių rinkinių gamintojo instrukcijų.
Lyginamasis diagnostinių metodų įvertinimas
Tyrimų eigoje atliktas lyginamasis standartinės virusų neutralizacijos
(VN) ir gB IFA metodų, naudojamų GIR diagnostikoje, įvertinimas.
Surinkti kraujo mėginiai (n=81) buvo suskirstyti, atsižvelgiant į gyvulių
grupes pagal amžių. VN reakcijoje naudota BoHV-1 „4019“ padermės 100
AKID50 virusinių dalelių/ 0,1 ml, persėjamosios MDBK – galvijų embriono
inkstų ląstelių kultūrų linijos. Ląstelėms kultivuoti panaudota MEM terpė
(Minimum essential medium Eagle) su 10 proc. fetaliniu veršelių serumu
(FVS, Biochrom, Vokietija). Duomenys, gauti skirtingais tyrimo metodais,
30
buvo lyginami, įvertinant reakcijų jautrumą ir specifiškumą pagal Kramps ir
Pasaulinės gyvūnų sveikatos organizacijos rekomendacijas (Kramps et al.,
1999).
Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
DNR ekstrakcija iš susmulkintų organų ar šnervių ištakų mėginių buvo
atliekama fenolo – chloroformo- izoamilo alkoholio ir Genomic metodais.
PGR metu atlikti 35 amplifikavimo ciklai: +95º C 1 min., +56º C 1 min. ir
+72º C 1 min. Galutiniam amplifikavimui užbaigti panaudota 3 min.
pailginta procedūra +72º C. PGR metu gautas 468 nukleotidų porų
produktas. PGR panaudoti galvijų herpesviruso-1 oligonukleotidų
pradmenys (Vilcek, 1993): P1(sense): 5´-CAC GGA CCT GGT GGA
CAA GAA G-3´ ir P2(antisense): 5´-CTA CCG TCA CGT GCT GTG
TAC G-3´.
Statistinis duomenų įvertinimas
Statistiniai skaičiavimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijos, VA
Veterinarijos instituto ir NMVRVI virusologijos skyriuose. Statistinė
duomenų analizė atlikta kompiuterine programa Graph Prism 3.0TM.
Apskaičiuotas Stjudento patikimumo koeficientas ir duomenys laikyti
patikimais, kai p< 0,05. BoHV-1 viruso serologinio paplitimo galvijų
populiacijoje pasikliautinis intervalas (PI) ir paplitimo procento skirtumų
patikimumas, esant 95 proc. tikimybei, apskaičiuotas Dimension Research,
Inc. programa.
TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS
Galvijų ligų paplitimo ir gaišimo priežasčių Lietuvoje analizė
Pirmajame tyrimų etape galvijų gydymo duomenų, kurie buvo renkami
tik iki 2002 metų, analizė parodė, kad Lietuvoje 1999–2002 metų
laikotarpiu iki 13,9 proc. visų laikomų galvijų persirgo vienokia ar kitokia
liga. Dažniausiai buvo registruojamos veršelių virškinimo ir kvėpavimo
organų ligos. Šiomis ligomis 1999 metais sirgo atitinkamai 5,0 proc. ir 2,6
proc. visų tuo metu laikytų galvijų. Vėlesniais metais veršelių susirgimų
virškinimo ir kvėpavimo organų ligomis palaipsniui mažėjo, ir 2002 metais
buvo 3,4 proc. ir 1,8 proc. Nustatyta, kad daugiausia galvijų buvo
išbrokuojama dėl tešmens ligų (9,7 proc.) ir reprodukcijos sutrikimų,
nevaisingumo ir lyties organų ligų (11,9 proc.). Tuo metu dėl infekcinių ligų
išbrokuojama tik 1,1proc. galvijų. Iš viso 2002 metais išbrokuota 21 296
(13,7 proc.) karvių. 1999–2002 metų laikotarpiu gydyta 402 tūkstančiai
galvijų, iš jų 26 tūkstančiai (6,5 proc.) nugaišo. 1999–2002 metais
daugiausia gaišdavo galvijai, sergantys kvėpavimo organų ligomis. 2002
31
metais padidėjo galvijų gaišimas nuo virškinimo organų ligų (10,5 proc.).
Kvėpavimo takų ligos, kurių viena priežasčių gali būti BoHV-1 virusai,
buvo daug pavojingesnės, kadangi nuo šių ligų gaišo daugiau gyvulių (14
proc.).
Dėl virškinimo ir kvėpavimo organų ligų galvijai gaišo kur kas dažniau
nei nuo reprodukcijos, medžiagų apykaitos ligų ar mastitų. Šie tyrimų
rezultatai sutampa su duomenimis kitų tyrėjų, teigiančių, jog 37,8 proc.
nugaišusių veršelių turėjo plaučių ir žarnyno pažeidimų (Večerek et al.,
2003). Yra ir daugiau duomenų apie didžiausią veršelių gaišimą nuo enteritų
ir pneumonijos (Sivula et al., 1996).
Galvijų infekcinio rinotracheito diagnostiniai tyrimai veislinių
galvijų bandose
Antrajame tyrimų etape GIR padėtį analizavome tipiškose labai
produktyvių galvijų bandose. Iš pasirinktų devynių ūkių septyniuose (77,8
proc.) rasta galvijų, turinčių antikūnų BoHV-1 virusams. Analizuojant
duomenis nustatyta, kad GIR dažniau rastas karvių, ypač vyresnių, grupėje
(p< 0,01). Kai kuriose bandose net iki 86,7 proc. karvių buvo seroteigiamos,
t. y. BoHV-1 virusų nešiotojos. Vidutiniškai BoHV-1 virusais buvo
apsikrėtę 45,5 proc. tirtų galvijų, tačiau nebuvo aišku, ar mūsų pasirinktas
laboratorinės diagnostikos būdas yra pakankamai jautrus ir specifiškas, todėl
trečiajame darbų etape atlikome GIR diagnostikos metodų lyginamuosius
tyrimus.
Galvijų infekcinio rinotracheito diagnostikos metodų lyginamieji
tyrimai
Lyginamasis antikūnų imunofermentinės analizės (IFA Ak), naudotos
preliminariame GIR serologinio paplitimo tyrime, ir standartinio virusų
neutralizavimo (VN) metodų įvertinimas buvo atliekamas kiekvienu metodu
išaiškinant GIR seroteigiamus gyvulius.
Tyrimai parodė, kad tiek VN reakcija, tiek ir IFA Ak metodais buvo
nustatytas statistiškai vienodas serologiškai reagavusių galvijų skaičius (p<
0,05). Tačiau atskirų amžiaus grupių tyrimų rezultatai skyrėsi. Daugiausia
neatitikimų buvo iki 3 mėn. amžiaus veršelių grupėje, kur seroteigiamų
gyvulių, tiriant juos IFA metodu, buvo rasta 8,3 proc. daugiau, nei tiriant
standartiniu VN metodu. Nors šie skirtumai statistiškai ir nebuvo
reikšmingi, tačiau praktikoje tokie tyrimų rezultatų skirtumai gali turėti
įtakos tyrimų kokybei, todėl siekdami išsiaiškinti kraujo serumų tyrimo
rezultatų skirtumus, gautus standartine VN ir IFA Ak, įvertinome IFA Ak
jautrumą ir specifiškumą pagal Pasaulinės gyvūnų sveikatos organizacijos
rekomenduojamas apskaičiavimo schemas. Nors IFA Ak pasižymėjo dideliu
diagnostiniu jautrumu ir specifiškumu, viršijančiu 90 proc., toliau
32
analizavome VN ir IFA Ak rezultatų neatitikimo priežastis. Tam tikslui
standartinės VN ir IFA Ak reakcijų duomenys buvo suskirstyti pagal titrų
grupes. Didžiausi IFA Ak ir VN rezultatų neatitikimai gauti iki 3 mėnesių
amžiaus veršelių grupėje ir mėginiuose, kur buvo žemi antikūnų titrai.
Kadangi dauguma tokio amžiaus veršelių gali turėti motininius antikūnus
BoHV-1, šis neatitikimas neturi didelės reikšmės GIR infekcijos serologinei
diagnostikai, todėl tolimesniuose serologiniuose tyrimuose taikėme būtent
IFA Ak tyrimą. Tą patį patvirtina ir kitose šalyse atlikti moksliniai tyrimai
(Van Oirschot et al., 1997, Wellenberg et al., 1998, Ballagi et al., 1999).
Galvijų infekcinio rinotracheito epidemiologiniai tyrimai
Atlikus ketvirtajame etape numatytus tyrimus, 1839 galvijų kraujo
serumo mėginiuose buvo nustatyti galvijų infekcinio rinotracheito antikūnai,
tai sudarė 11,97 proc. visų tirtų mėginių. Taip pat atlikti epidemiologiniai
tyrimai parodė, kad nepaisant iki šiol taikomų kontrolės priemonių, 2005–
2009 metais nuo 12,13 proc. iki 17,88 proc. visų tirtų galvijų buvo užsikrėtę
BoHV-1. Dažniau GIR serologiškai buvo nustatytas bandose, kuriose yra
didelė galvijų koncentracija, rečiau GIR pasitaiko smulkiuose ūkiuose.
Mūsų tyrimai rodo, kad dažniausiai BoHV-1 buvo užsikrėtusios karvės,
rečiau – telyčios, o tarp buliukų ir prieauglio BoHV-1 paplitęs mažiausiai.
Nustatyta, kad GIR infekcijos paplitimas galvijų prieauglio amžiaus grupėse
yra tolygus ir nedaug priklauso nuo amžiaus, tačiau kitose galvijų grupėse
nuo 2–3 metų amžius turi didelę įtaką BoHV-1 infekcijos išplitimui, t. y.
kuo vyresni galvijai, tuo didesnis BoHV-1 serologinis paplitimas. Taip pat
nustatyta, kad didėjant galvijų skaičiui bandoje proporcingai didėja galvijų
BoHV-1 išplitimo bandoje rizika, t. y. kuo daugiau galvijų laikoma vienoje
bandoje, tuo daugiau yra užsikrėtusių. BoHV-1 paplitimo priklausomybę
nuo bandos dydžio ir galvijų amžiaus pastebėjo ir kitų šalių mokslininkai
(Boelaert et al., 2000, Woodbine et al., 2009).
Galvijų infekcinio rinotracheito paplitimo geografiniai ypatumai
Lietuvoje
2005-2009 metais teigiamai reaguojančių galvijų daugiausiai buvo
Šiaulių – 22,69 proc., Kauno – 19,51 proc., Marijampolės – 17,26 proc. ir
Utenos – 15,74 proc. apskrityse. Kitose apskrityse teigiamai reguojančių
galvijų buvo kur kas mažiau: Panevėžio – 7,77 proc., Alytaus – 2,76 proc.,
Vilniaus – 2,55 proc., Telšių – 1,54proc., Klaipėdos – 0,85 proc., o Tauragės
– tik 0,53 proc. tirtų galvijų. Išanalizavus tyrimų rezultatus nustatyta, kad
BoHV-1 infekcija vyrauja Pietų, Vidurio ir Šiaurės Lietuvos apskrityse.
33
BoHV-1 infekcijos tyrimas polimerazės grandinine reakcija (PGR)
Tyrimai PGR metodu patvirtino, kad penkiose iš 24 galvijų bandų (20,83
proc.) endeminio pobūdžio veršelių kvėpavimo takų ligų priežastis buvo
BoHV-1. Ištyrus 193 nugaišusių ar sergančių 1–12 mėnesių veršelių plaučių
ir šnervių ištakų mėginius, BoHV-1 nukleorūgštis buvo nustatyta 19 atvejų,
arba 9,84 proc. BoHV-1 plaučių mėginiuose rastas 4,4 kartus dažniau nei
ištakose iš sergančių veršelių šnervių (p=0.004). Lyginant plaučių mėginių
tyrimų rezultatus su teigiamų mėginių vidurkiu (9,84 proc.) taip pat gautas
patikimas skirtumas (p=0,037).
Toliau buvo analizuojama epidemiologinė padėtis bandose, kuriose
kvėpavimo takų ligomis sergantiems veršeliams PGR metodu buvo
diagnozuotas GIR. Tyrimų duomenys parodė, kad BoHV-1 infekcijos
protrūkio metu teigiamų mėginių būna nuo 40 proc. iki 100 proc. Iš 17 tirtų
plaučių mėginių teigiamų buvo 9 (52,9 proc.), tiriant 16 šnervių ištakų
mėginius teigiamų buvo 10 (62,5 proc.). Tačiau šis skirtumas nebuvo
statistiškai patikimas, t. y. galime teigti, kad šie tyrimai diagnostikos
požiūriu buvo lygiaverčiai.
BoHV-1 infekcijos paplitimo palyginimas su kitomis galvijų
virusinėmis ligomis Lietuvoje
Septintajame darbų etape mūsų tyrimų tikslas buvo atlikti galvijų
užkrečiamųjų virusinių ligų paplitimo kompleksinę analizę, serologiškai
ištirti GIR, galvijų paragripo 3 (PG-3), galvijų respiracinės sincitinės
infekcijos (RS) ir galvijų virusinės diarėjos (GVD) virusų paplitimą
pramoninių veislinių galvijų bandose. Nustatyta, kad daugumoje ūkių (14 iš
19, 73,7 proc.) buvo galvijų, persirgusių visomis keturiomis virusinėmis
ligomis, tik penkiuose (26,3 proc.) ūkiuose buvo nustatyti galvijai, persirgę
dviem arba trimis virusinėmis ligomis. Nustatyta, kad 84,2 proc. tirtų ūkių
rasta galvijų, turinčių antikūnų GIR virusams. 95 proc. tirtų ūkių buvo rasta
galvijų, turinčių antikūnų PG-3 ir RS virusams. GVD virusų infekcija
nustatyta 85 proc. ūkių. Vidutiniškai GIR buvo persirgę 30,5 proc., PG-3 72,2 proc., RS virusų infekcija – 54,5 proc., o GVD – 43,4 proc. galvijų.
Seroteigiamų galvijų įvairiuose ūkiuose rasta nevienodas skaičius. Turinčių
antikūnų PG-3 virusams galvijų dalis svyravo nuo 28 proc. iki 93,3 proc.
Dar labiau seroteigiami galvijai pasiskirstė tiriant RSV, GIR ir GVD virusų
infekcijas – atitinkamai nuo 12,5 proc. iki 100 proc., nuo 2,4 proc. iki 100
proc. ir nuo 6,7 proc. iki 94,4 proc.
Mūsų tyrimai patvirtino, kad ir Lietuvoje kvėpavimo takų ligas
sukeliantys virusai yra labai išplitę, o bronchopneumonijų priežastis gali
būti ne tik BoHV-1 virusai, sukeliantys galvijų infekcinį rinotracheitą. Mūsų
tyrimai taip pat parodė, kad ypač daug problemų kelia PG-3 virusų
34
išplitimas, o panaši padėtis registruojama ir kitose pasaulio šalyse, kur
išvystyta intensyvi galvijininkystė (Norstrom et al., 2001, Sardi et al., 2002).
Galime teigti, kad PG-3, RS ir GIR virusai kartu su GVD virusais yra dažna
galvijų kvėpavimo takų ligų priežastis gausiose didelio produktyvumo
bandose.
Pasyvaus ir aktyvaus imuniteto tyrimai
Aštuntajame darbų etape buvo atliekami veršelių pasyvaus ir aktyvaus
imuniteto tyrimai. Nagrinėdami duomenis matome, kad nevakcinuotų
natūraliai užsikrėtusių karvių veršeliai nuo vienos savaitės iki dviejų
mėnesių amžiaus visi buvo seroteigiami.
Vakcinuotoje bandoje (ūkis Nr. 2) 2 mėn. amžiaus veršelių grupėje
seroteigiamų veršelių sumažėjo iki 37,5 proc., o nevakcinuotų veršelių
grupėje (ūkis Nr.1) seroteigiamų veršelių dalis kito nežymiai.
Procentinė seroteigiamų veršelių amžiaus dinamika buvo tiriama ir
nustatant antikūnus GIR viruso gE glikoproteinui. Gauti duomenys rodo,
kad nevakcinuotoje bandoje (ūkis Nr.1 ) visi veršeliai iki 2 mėn. amžiaus
buvo seroteigiami. Keturių mėn. amžiaus grupėje seroteigiamų veršelių
sumažėjo iki 12,5 proc., o vyresnių grupėse seroteigiamų gyvulių tolydžiai
daugėjo. Tuo tarpu vakcinuotų galvijų bandoje (ūkis Nr. 2) seroteigiamų
veršelių iš viso nebuvo nustatyta.
Analizuojant antikūnų GIR viruso gB glikoproteinams dinamiką
nustatyta, kad nevakcinuotų galvijų bandoje gimusių veršelių antikūnų titrai
nedaug skyrėsi nuo veršelių, gimusių iš vakcinuotų karvių, antikūnų titrų.
Tačiau ūkio Nr. 1 veršelių natūralus krekeninis imunitetas buvo patvaresnis,
o 60 dienų amžiaus grupėje antikūnų titrai buvo kur kas didesni nei veršelių,
gimusių iš vakcinuotų karvių.
Antikūnų GIR viruso gE glikoproteinui tyrimų analizė nevakcinuotų
veršelių grupėje (ūkis Nr. 1) parodė, kad didžiausi antikūnų titrai (OT < 0,1)
buvo nustatyti 7 ir 180 dienų amžiaus veršeliams. 120 dienų amžiaus
veršelių grupėje antikūnų titras sumažėjo. Mažiausias seroteigiamų veršelių
antikūnų titras nustatytas 270 dienų amžiaus veršelių grupėje. Seroteigiamų
GIR viruso gE glikoproteinui veršelių vakcinuotoje bandoje (ūkis Nr. 2)
nebuvo nustatyta.
Antikūnų titrų dinamikos tyrimai parodė, kad povakcininio pasyvaus
imuniteto trukmė buvo trumpesnė, nors antikūnų titrai 7 dienų amžiaus
veršeliams buvo aukštesni. Vyresnių veršelių grupėse antikūnų titrų tolygų
didėjimą galima paaiškinti užsikrėtimu BoHV-1 lauko padermėmis (ūkis Nr.
1) ir vakcinavimo (ūkis Nr. 2) poveikiu. Vakcinavimo efektyvumą patvirtino
ir antikūnų titrų GIR viruso gE glikoproteinui tyrimas. Šis tyrimas parodė,
kad vakcinuotoje bandoje visai nebuvo nustatyta užsikrėtusių veršelių. O
35
nevakcinuotų veršelių bandoje šis tyrimas patvirtino GIR viruso plitimą.
Kitų autorių atlikti antikūnų titro dinamikos tyrimai vakcinuotiems ir
eksperimentiškai patogeniniais BoHV-1 virusais užkrėstiems galvijams taip
pat parodė vakcinos nuo GIR efektyvumą (Kaashoek et al., 1996, Bosch et
al., 1998, Kamaraj et al., 2009).
Galvijų infekcinio rinotracheito kontrolės priemonių efektyvumo
tyrimas
Mūsų surinktais duomenimis, iki 2010 metų pabaigos GIR kontrolės
priemones taikė 54 ūkiai. Didžioji dalis jų apsiribojo tik periodiniais BoHV1 seropaplitimo tyrimais (67,86 proc.). Likvidavimo ir stebėsenos programas
vykdė 28 ūkiai (51,85 proc.). 10 ūkių (18,52 proc.) dėl didelio seroteigiamų
galvijų skaičiaus juos vakcinavo žymėtosiomis vakcinomis. Vadinasi,
programas vykdė mažiau nei 1 proc. ūkių, kuriuose laikomi kontroliuojami
veisliniai galvijai. Iš jų trys ūkiai turėjo oficialiai GIR neapimto bandos
statusą, kas sudarė vos 0,05 proc. visų veislinių bandų skaičiaus.
Mes nustatėmė, kad tik nedidelė ūkių dalis taiko GIR kontrolės
priemones. Tačiau ir tuose 28 ūkiuose, kur buvo vykdomos likvidavimo ir
stebėsenos programos, buvo programos vykdymo problemų. Dažniausiai
nesilaikoma tokių GIR likvidavimo planuose numatytų veiksmų, kaip
tinkamas dokumentacijos tvarkymas ir ne pagal planą atliekama klinikinė
bandos apžiūra. O vakcinavimas dažniausiai atliekamas tinkamai, ir šiai
programos daliai tiek galvijų savininkai, tiek ir veterinarijos gydytojai skiria
daugiausia dėmesio. Ūkių, kuriuose buvo atliekami visi programose
numatyti darbai, nustatėme 8 (28,57 proc.). Penkiuose iš jų vykdoma
vakcininė GIR profilaktika. Šiuose ūkiuose prieš vakcinavimo pradžią
užsikrėtusių galvijų skaičius buvo nuo 11,2 proc. iki 52,3 proc. Po mūsų
kontrolinių tyrimų, atliktų šiuose ūkiuose praėjus 20–24 mėnesiams nuo
vakcinavimo pradžios, buvo nustatyta, kad po vakcinavimo seroteigiamų
galvijų skaičius keturiuose iš penkių ūkių sumažėjo iki 0 proc., t. y. nebuvo
nustatyta naujų BoHV-1 infekcijos atvejų, išskyrus vieną ūkį, kuriame po
vakcinavimo seroteigiamų galvijų skaičius sumažėjo 2,4 karto (nuo 45 proc.
iki 18,6 proc.). Taigi mūsų tyrimai patvirtina vakcinavimo nuo GIR
efektyvumą. Tyrimo rezultatai parodė, kad kai kuriose vakcinuotose
bandose užsikrėtusių galvijų per tą patį laikotarpį sumažėjo nuo 52,3 proc.
iki 0 proc. Mūsų nuomone, vakcinuoti galvijai neužsikrečia, o vyresnio
amžiaus seroteigiamos karvės periodiškai išbrokuojamos ir jų skaičius
mažėja. Taigi galime teigti, kad nuolatinis visos bandos vakcinavimas yra
tinkamiausias būdas likviduoti BoHV-1 infekciją. Vakcinavimo efektyvumo
tyrimai yra atlikti ir kitose šalyse, kur taip pat nurodoma, kad galvijų
36
vakcinavimas sumažina GIR sergamumą ir sustabdo BoHV-1 plitimą (Mars
et al., 2001, Nardelli et al., 2008).
BoHV-1 patekimo į Lietuvą su importuojamais galvijais grėsmės
įvertinimas
Lietuvoje GIR sukėlėjai yra labai išplitę, tačiau jau penktus metus 28
didelio produktyvumo pieninių karvių bandose liga likviduojama, o trys
ūkiai yra oficialiai laisvi nuo GIR. Įvairiose ES šalyse padėtis yra labai
skirtinga, tad perkant galvijus skirtinga ir rizika užkratui patekti į mūsų
šalies galvijų bandas.
2006 metais į Lietuvą buvo importuoti 959 veisliniai mėsiniai galvijai.
Dauguma jų (633 vnt., arba 66 proc.) buvo atvežti iš Prancūzijos ir Airijos,
t. y. šalių, kur GIR yra išplitęs ir užsikrėtimo galimybė didelė. Tuo pat metu
veislinių pieninių telyčių įvežta 1975. Dauguma jų (1415 vnt., arba 71,6
proc.) pirktos Vokietijoje ir Danijoje, kur GIR arba likviduota, arba labai
mažai išplitusi dėl griežtos kontrolės. Taigi BoHV-1 virusų patekimas su
įvežtomis telyčiomis yra mažai tikėtinas, išskyrus tuos atvejus, kai telyčios
buvo pirktos Nyderlanduose (21,4 proc. viso telyčių importo 2006 m.).
Todėl karantinavimo metu galvijus reikia tirti dėl GIR antikūnų.
IŠVADOS
1. Labai produktyvių galvijų ūkiuose 26,7–77,8 proc. galvijų yra
užsikrėtę galvijų infekcinio rinotracheito virusu, o GIR viruso paplitimas
Lietuvos galvijų populiacijoje sudaro 11,9 proc., nuo 2008 metų nustatyta
didėjanti BoHV-1 plitimo tendencija.
2. GIR viruso paplitimas priklauso nuo galvijų bandos dydžio. Bandose
nuo 1 iki 200 galvijų užsikrėtusių individų buvo 5,58 proc., o bandose,
kuriose laikoma daugiau kaip 200 galvijų – 14,8 proc.
3. GIR viruso plitimui įtakos turi galvijų amžius. Nustatyta, kad vyresnių
kaip 7 metų amžiaus galvijų grupėje GIR paplitimas – 57 proc., o
mažiausias– 0–4 mėn. ir 1–2 metų galvijų grupėse (4,3 proc. ir 6,7 proc.).
Labiausiai GIR virusas paplitęs yra tarp karvių– 34,6 proc., mažiausiai –
tarp bulių– 2 proc.
4. IFA Ak pasižymi dideliu jautrumu (96,3 proc.) ir specifiškumu (90,6
proc.), todėl rekomenduotina ją naudoti galvijų infekcinio rinotracheito
serologiniams tyrimams.
37
5. Atlikti PGR tyrimai parodė, kad tik 20,8 proc. atvejų galvijų
kvėpavimo ligų protrūkių priežastis buvo BoHV-1 infekcija, todėl būtina
atsižvelgti ir kitų virusų (PG3, RSV, GVD) išplitimą galvijų bandose.
6. Atlikus kompleksinę galvijų virusų paplitimo analizę nustatyta, kad
GIR persirgę – 30,5 proc., PG3 – 72,2 proc., RSV infekcija – 54,5 proc.,
GVD – 43,4 proc. galvijų. Daugumoje ūkių nustatyta, kad galvijai yra
persirgę visomis keturiomis ligomis, ir tai įrodo, kad šie virusai gali būti
kvėpavimo ligų priežastis.
7. Nustatyta, kad veršelių, gimusių iš nevakcinuotų karvių, pasyvus
imunitetas trunka iki 2 mėn. ir yra patvaresnis nei veršelių, gimusių iš
vakcinuotų karvių.
8. Vakcinavimo efektyvumo tyrimai rodo labai didelį vakcinų apsauginį
efektyvumą – ūkiuose, kuriuose atliekamas vakcinavimas , nebuvo nustatyta
naujų GIR atvejų, o užsikrėtusių galvijų sumažėjo nuo 52,3 iki 0 proc
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
GIR ir kitų respiratorinių infekcijų patekimui į ūkius keliui užkirsti
rekomenduojama atvežtus naujus galvijus karantinuoti ir juos ištirti
serologiniais metodais.
Atliekant GIR kontrolę ūkiuose rekomenduojama atlikti serologinius
tyrimus, nustatant virusų nešiotojus. Užkertant kelią ligos plitimui ūkyje
nustatyti virusų nešiotojai ir sergantys galvijai turi būti atskirti nuo sveikų.
Užtikrinti, kad ūkį aptarnaujantis personalas neplatintų GIR sukėlėjų.
Rekomenduojama ūkiuose, kuriuose GIR yra labai išplitęs, naudoti
žymėtas vakcinas ir nuolat atlikti tyrimus pagal sudarytas GIR likvidavimo
programas.
Pateikiama sukurta „Galvijų infekcinio rinotracheito (GIR) kontrolės
veislinėse bandose“ programa.
38
PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS
1. Mockeliūnas R., Sederevičius A., Šalomskas A., Mockeliūnienė V.,
Mačiulskis P., Jacevičius E. Galvijų ligų paplitimo ir gaišimo priežasčių
Lietuvoje analizė. Veterinarija ir Zootechnika. 2005. T. 32 (54). P. 16–19.
(In Lithuanian).
2. Šalomskas A., Mockeliūnienė V., Jacevičius E., Lelešius R.,
Mockeliūnas R., Kliučinskas R., Petkevičius S. Galvijų infekcinio
rinotracheito ir virusinės diarėjos diagnostikos ir prevencijos problemos.
Veterinarija ir Zootechnika. 2006. T. 33 (55). P. 16–21. (In Lithuanian).
3. Šalomskas A., Jacevičius E., Kęstaitienė K., Petkevičius S.,
Lukauskas K., Liutkevičienė V., Milius J., Venskutonis D., Mockeliūnas R.,
Jokimas J. Ekonomiškai svarbių virusinių ligų paplitimas galvijų bandose.
Veterinarija ir Zootechnika. 2008. T. 41(63). P. 95–100. (In Lithuanian).
4. Jacevičius E., Šalomskas A., Milius J., Petkevičius S., Mockeliūnas
R., Jacevičienė I., Lelešius R., Pridotkas G. Prevalence and control measures
of infectious bovine rhinotracheitis in Lithuania“. Veterinarmedicinas raksti.
2008. P. 49–53. ISSN 1407–1754.
5. Šalomskas A., Jacevičius E. Galvijų infekcinio rinotracheito
paplitimas ir vakcinacijos efektyvumas. VetInfo, 2008/4 (60). P. 58–61. (In
Lithuanian).
6. Jacevičius E., Šalomskas A., Petkevičius S., Jacevičienė I., Milius J.,
Pridotkas G.. Seroprevalence of antibodies to bovine herpesvirus Type 1 in
cattle in Lithuania. Proceedings of the International Veterinary Laboratory
Scientific and Applied Conference. ISBN 978-9984-39-865-5. 2009.
P. 41–42.
7. Jacevičius E., Šalomskas A., Milius J., Petkevičius S., Jacevičienė I.,
Pridotkas G., Mockeliūnas R., Malakauskas A., Morkūnas M. Five year
serological study of bovine herpesvirus type-1 in cattle in Lithuania. Bull
Vet Inst Pulawy. 2010. Vol. 54. P. 289–292.
39
GYVENIMO APRAŠYMAS
Vardas, Pavardė:
Adresas:
El. paštas:
Gimimo data:
Gimimo vieta:
Eugenijus Jacevičius
Gabijos 25-16, Vilnius, Lietuva
ejacevič[email protected]
1971 03 02
Kėdainiai, Lietuva
Išsilavinimas:
Kvalifikacijos
lygmuo pagal
nacionalinę arba
tarptautinę
kvalifikaciją:
1989–1994 Lietuvos Veterinarijos akademija
2005–2011
Doktorantūros studijos LVA Užkrečiamųjų ligų
katedroje
1994–2001 Alytaus apskrities VMVT laboratorija,
bakteriologas-virusologas
2001–2008 Nacionalinė Veterinarijos laboratorija,
Virusologinių tyrimų skyriaus vedėjas
2008–2011 Nacionalinis maisto ir
veterinarijos rizikos vertinimo institutas,
Laboratorijos departamentas,
Virusologinių tyrimų skyriaus vedėjas
2011–2012 Valstybinė maisto ir veterinarijos
tarnyba, Gyvūnų sveikatingumo ir gerovės skyriaus
vedėjas
2012 – iki dabar, Nacionalinis maisto ir
veterinarijos rizikos vertinimo institutas,
Veterinarijos rizikos vertinimo skyriaus vedėjas
Darbinė veikla:
Mokymai:
Veterinarijos gydytojas
Dalyvauta įvairiuose mokymuose ir kvalifikacijos
kėlimo kursuose Lietuvoje ir užsienyje (Danija,
Norvegija, Vokietija, Belgija, Ispanija, Italija,
Jungtinė Karalystė ir kt.), kuriuos organizavo
Lietuvos ir užsienio mokslo institucijos.
Maketavo R. Trainienė
Už teksto turinį ir redagavimą atsakingas autorius
Spausdino LSMU Leidybos namai
Tilžės g. 18, LT-47181 Kaunas
Tiražas 35. 2,50 sp.l. Užs. Nr. 5 d. 2012
40