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Terapia Cellulare Non Trapiantologica
In Ematologia ed Oncologia
Fraia Melchionda
Possibile Definizione
Terapia Cellulare:
Trattamento che prevede la ricostituzione,
l’aumento di numero o di efficacia di una
funzione
biologica
ottenuto
mediante
l’impiego di popolazioni cellulari.
Terapia Cellulare
Terapia Cellulare Correlata a Procedura Trapiantologica
 Trapianto di Celulle Staminali Ematopoietiche Allogeniche
• Donor Lymphocites Infusion
• ,,
,, Allo-EBV-CTL nel trattamento delle Post
Tramplant Lymphoprolipherative Disorders (PTLD) in pz
sottoposti a BMT; AutoEBV-CTL nelle PTLD post SOT
• Utilizzo di CTLp anti-leucemia (LAM)
 Terapia Cellulare anti-infettiva CTL anti CMV, BK e Aspergillo
 APC artificiali (CD3+/CD28+ beads) nel contesto di Auto-TMO
(NHL, CML, MM)
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Strategie per stimolare/amplificare
la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Ripopolazione Adottiva (T cell)
•
T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene
•
•
•
•
Aumento antigen up-take e processing
Modulazione della maturazione delle DCs
Fornire co-stimulazione
Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune
•
•
Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)
Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF-b, -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
La storia dell’immunoterapia
M. Burnet e L. Thomas nel 1957 proposero il concetto di
“Cancer Immunesurveilance”
Le prime prove di tale ipotesi furono testate mediante
l’utilizzo di ceppi murini per K.O. per alcuni geni dimostratisi
essenziali per lo sviluppo di alcuni componenti fondamentali
del sistema immunitario:
Es.: RAG2-/- pertanto incapaci di formare T Ly, B ly, NKT;
perforina-/-; IFN gamma-/- ecc.
Questi animali sviluppano, con diverse caratteristiche, tumori
spontanei o elevata percentuale dopo stimolazione con
sostanze chimiche
Immunosorveglianza
Tumor Immunology: Cancer Immunoediting
Dunn & Schreiber Nature Immunology 2002 (3)11; 991-998
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Immunosorveglianza
Possibili Meccanismi di Tumor-Escape
Fattori del compartimento linfocitario:
•Scarso numero T cell help
•Insufficiente numero CTL anti-tumorali
•
,,
avidita’ dei CTL per il tumore
•Tolleranza immunologica
•Down-regulation di TCR signaling
•Apoptosi CTL
•Inadeguata funzione T cell (citochine, lisi)
•Aumento di T cellule a carattere soppressivo (T reg, CD4+CD25+)
•Produzione di citochine immunosoppressive (IL-10)
Fattori Tumorali
•Insufficiente/assente espressione dell’antigene
•Perdita di espressione MHC
•Assenza di molecole co-stimolatorie
•Produzione di citochine immunosoppressive (VEGF, IL-10,TGFb)
Possibili Effetti Indotti dalla Crescita Tumorale
sul Compartimento T Cellulare
IMPLICAZIONI
TERAPEUTICHE
STIMOLAZIONE
TOLLERANZA
- delezione clonale
- anergia clonale
Ripopolazione con T
cell Adottiva
Jenkins MK. JExpMed 1987;165 302
Pardoll D. Nature, 2001; 411, 1010
NEGLETTA
T- Cell
SIGNAL
#2
Ochsenbein A.F et Al
Nature, 2001, 411: 1058
Ag
Cellula
Tumorale
TCR
SIGNAL
#1
APC Ag
Ag
Ag
Cross
priming
ATTIVAZIONE/
INSUFFICIENTE
ESPANSIONE
Speiser D.E. et Al.
J.Exp.Med. 1997; 186, 645-653
Ottimizzare
presentazione dell’Ag
Strategia DC based,
peptide based, APC
artificiali, ecc.
Terapie immunologiche
Ottimizzare presentazione
dell’Ag (DCs, vaccini)
Amplificazione della
risposta T cellulo mediata
Terapia anti-soppressiva
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Strategie per stimolare/amplificare
la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Ripopolazione Adottiva (T cell)
•
T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene
•
•
•
•
Aumento antigen up-take e processing
Modulazione della maturazione delle DCs
Fornire co-stimulazione
Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune
•
•
Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)
Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF-b, -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Cellule Effettrici ad Azione Citotossica
• CTL: T Linfociti che esercitano la loro attività citotossica
mediante riconoscimento di cellule target (antigenicamente
differenti) nel contesto del MHC classe I e II.
• TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes): popolazione
eterogenea di linfociti (prevalentemente CD8+CD4+NK)
localizzati nel contesto tumorale (es. melanoma, ca.ovarico)
o linfonodi drenanti il tumore, aventi azione citotossica per
lo più LAK-type, spesso non MHC-mediata).
• LAK (Lymphokine-Activated Killer): cellule con un’azione
citotossica su target cellulari NK-resistenti (es. Daudi cell)
questa è implementata da IL-2.
• Cellule NK: hanno una spontanea attività citotossica nei
confronti di cellule target (es. cellula tumorale) con una
modalità non-MHC ristretta.
Immunosorveglianza: Modello Murino
Monitoraggio volume Tum.
Impianto K7M2
Amputazione
Volume: 0.8-1 cm3
MRD
Monitoraggio Recidiva
Osteosarcoma nell’Ospite SCID:
Invariata la crescita tumorale primaria
significativo incremento di recidive/metastasi
Primary Tumor Growth
Death from Recurrent Disease
100
1.00
Amputation size
80
0.75
60
0.50
p=0.008
40
Balb/c
0.25
Balb/c
20
SCID
SCID
0
0.00
0
10
20
30
40
50
Days After Implant
60
70
0
25
50
75
100
Days after tumor implant
125
150
K7M2 Osteosarcoma MRD
Ruolo dell’Immuno-ricostituzione nella Prevenzione di Metastasi
SCID
Monitoraggia volume
K7M2
Impianto
Amputazione
LN early
Immuno-ricostituzione
CD4+ e CD8+
25x 106 cells = 10 % T cell repertoire
Tumor Burden
Monitoraggio
Di Recidiva
LN late
Immuno-ricostituzione
CD4+ e CD8+
25x 106 cells = 10 % T cell repertoire
MRD
T Cell Immuno-Ricostituzione Puo’ Prevenire
Recidiva Tumorale
Death From Recurrent Disease
Primary Tumor Growth
scid
100
1.00
scid
LN early
0.75
LN early
LN late
80
60
p= 0.005 vs. SCID
0.50
p= 0.002 vs. SCID
40
0.25
20
0.00
0
0
10
20
30
40
50
Days After Implant
60
70
0
50
100
150
200
Days After Implant
Esposizione di cellule T alla Crescita Tumorale Primaria
Non Enficia la Capacita’ di Controllo di Recidiva
Evidenza di Priming Immunologico in Animali
con Progressiva Crescita di Osteosarcoma
Produzione di IFNg
dopo stimolazione in vitro con
cellule K7M2
Produzione di IFNg
dopo stimolazione in vitro con
DC pulsate Lisato Tumorale
160
160
p= 0.0092
140
140
120
120
p= 0.03
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
Naive
T. Bearing
Naive+
Tum. Bear.+ Tum. Bear.+
DCs
Lisato tum.- DC Tum. Lysate DC
Terapia Cellulare non Trapiantologica
PNAS 2004
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Strategie per stimolare/amplificare
la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Ripopolazione Adottiva (T cell)
•
T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene
•
•
•
•
Aumento antigen up-take e processing
Modulazione della maturazione delle DCs
Fornire co-stimulazione
Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune
•
•
Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)
Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF-b, -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Cellule Dendritiche (DC): biologia
Ottimizzazione di Strategie Vaccinali
Mediante l’Utilizzo di DC
Copyright  2000-2003
Cell Systems Initiative, University of Washington
Cellule Dendritiche: biologia …
Le Sentinelle del Sistema Immunitario
M. Jefford et al. Lancet 2003
La Processazione dell’Antigene
CD4
MHC-II
peptide
Endosoma/lisosomi
endocitosi
Cross-presentation
Patogeno
MHC-II
peptidi
citosol
Golgi
TAP
Proteosoma
MHC-I
DC
MHC-I
peptide
CD8
Immature vs Mature DCs
Importanza della maturazione, effetti sulla risposta immunitaria
DC Immature
DC Mature
Danger signals
Bacterial products
Cytokines
T cells
Uptake antigene
Endocitosi
Processazione antigene
via MHC class I/II
Costimolazione
high CD40, CD54, Class II
Migrazione vs linf.
Presentazione del Ag
Stimolazione cell T
Sviluppo cellule CD4+ CD8 T
antigene specifiche (CTL)
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Possibili Fonti di Antigeni Tumorali
nella strategia Vaccinale DC-based
DCs
DCs
cRNA
mRNA
Estratti proteici
rProteine
Corpi
apoptotici
cDNA
Tumor cells
Cellule di
fusione
DCs
Peptidi
Peptidi sintetici
(modificati)
DCs
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Classificazione degli Antigeni Tumorali
•Tumore specifici
•bcr/abl protein (CML, ALL)
•Idiotipo immunoglobuline (NHL,
MM)
•Pml/Rar alfa protein (APL)
•Shared Tumor-specific Ag
(cancer testis Ag, o Melanoma associate)
•MAGE
•BAGE
•GAGE
•Antigeni di differenziazione
(espressi anche dai normali tessuti)
•Melan A
•Mart-1
•Proteinase-3
•WT-1
•Oncogene/tumor suppression Ag
•P53
•Ras mutated protein
•Virus Associated Ag
•EBV
Terapia Cellulare non Trapiantologica
L’attivita’ di Antigen discovery nei tumori dell’adulto
implicazioni nei tumori pediatrici
NBL
EWS
RMS
Sarcomas
Glioblastoma
Medulloblastoma
Head & Neck
ALL t(8;21)
GAGE-1 (80%)
MAGE-1 (50-80%)
GAGE-1
XAGE-1,2
XAGE-1,2
GAGE-2 (25%)
NY-ESO-1(80%)
MAGE
GAGE-3,6 (70%)
MAGE-1
Her-2
gp100
GAGE-3,6 (45%)
PRAME
PRAME
Terapia Cellulare: Strategia Vaccinale
Selezione?
Utilizzo di
adiuvanti?
Quando?
Quanto?
MRD/low tumor burden
Immmuno Riconstituzione
Post alte dosi CT
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Fonti alternative di APC
• CD40 Activated B cell (CD40-B cell): Linfociti B attivati ex-vivo
mediante stimolazione con CD40. Tale trattamento media la upregolazione di molecole co-stimolatorie ed incremento della
presentazione dell’Ag. Conferendo alla cellula caratteristiche che
assomigliano a quelle tipiche della DC. ( espressione Rec.
Chemochine, produzione di citochine, ecc.) Possono essere
facilmente ottenute ed espanse in vitro, pertanto rappresentano una
potenziale alternativa fonte di APC autologhe.
• APC artificiali: CD3/CD28 stimolazione mediante anticorpi coniugati
con microbiglie. Mediano l’attivazione e l’espansione policlonale di
popolazioni T cellulari (NHL, CML)
Von Bergwelt et al. Cancer Res 2004; Lapointe R. Cancer Res 2004
Terapia cellulare non Trapiantologica
Studi in ambito pediatrico
• Expression of MHC class I, MHC class II and cancer germline antigens in
neuroblastoma (Wolfl et al Cancer Immunol Immunother 2004)
• Neuroblastona and DC function (Redlinger RE et al Semin Pedatr Surg 2004)
• Results of phase 1 study utilizing monocyte-derived Dendritic cells pulsed with
tumor RNA in children and young adults with brain tumor (DA Caruso et al.
Neuro-Oncol 2004)
• Restored immune response to an MHC-II restricted antigen in tumor bearing
hosts after elimination of regulatory T cell. (Nicholl et al. J ped. Surg 2004)
• Characterization of CD34+progenitor-derived DC pulsed with tumor cell lysate
for a vaccination strategy in children with malignant solid tumor and a poor
prognosis (Ackermann et al Klin Pediatr 2004)
• Functional and molecular characterization of interleukin-2 transgenic Ewing
tumor cell for in vivo immunotherapy (Burdach et al Ped Blood Cancer 2004)
• Pilot trial of tumor specific peptide vaccination and continous infusion of IL2 in
patients with recurrent Ewing sarcoma and Alveolar Rhabdomiosarcoma
(Dagher R Med. Ped. Oncol. 2002)
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Strategie per stimolare/amplificare
la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Ripopolazione Adottiva (T cell)
•
T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene
•
•
•
•
Aumento antigen up-take e processing
Modulazione della maturazione delle DCs
Fornire co-stimulazione
Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune
•
•
Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)
Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF-b, -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Effetti IL-2 mediati Potenzialmente Utili
Nel contesto di Immunoterapia
T Cell trophic factor
Proliferation of activated T cell
Differentiation of CTL
Activation-Induced
Cell Death
(AICD)
IL-2
IL-15
Therapy
Expand NK cells
NK
NK
NK
NK
(low dose)
NK
 Innate Immunity
Activate NK cell
(high dose)
Lysis
NK
Tumor
NK effector function
 Innate Immunity
 Type 1 Cytokines
Synergize for production
of other cytokines
(e.g. IFNg, TNF)
Substitute IL15
in NK cell
differentiation
(via IL2/15Rbgc)
NKpre
NK cell
CD56-
 Innate Immunity
CD56+
Effetti IL-7 mediati Potenzialmente Utili
Nel contesto di Immunoterapia
Induce Type 1 cytokines
 Memory T cell
Induce Other Cytokines
 Programmed Cell death
(e.g. IL-2, IFNg)
Partially substitute
Up-regulation bcl-2
IL-15 in the generation
family molecules
of memory CD8+ pool
 Lytic Activity (CTLs, NK)
Induce Lak cells
mono
GM-C SF + IL7
Generate Monocytes
derived DCs
DCs
Ag Presenatation
IL-7
Therapy
TGFb production
Tumor
cell
Broaden Immune response
Recruit Low Affinity
clones
Expand High affinity
CD8+ clones
Expand High Affinity
CD4+ clones ?
TGFb
production
 Tumor Induced Suppression
 Expansion of existing
or vaccine-induced
Immune response
Effetti IL-15 mediati Potenzialmente Utili
Nel contesto di Immunoterapia
Increase Memory CD8+ T cell
 Innate Immunity
Maintenance
Expansion
of NK cells
NK
NK
NK
NK
NK
NKpre
CD56-
Critical in the generation and
Maintenance
of Memory CD8+ pool
IL-15
Therapy
NK cell
NK cell
Differentiation
CD56+
 Innate Immunity
 Type 1 Cytokines
Synergize for production
of other cytokikens
(e.g. IFNg, TNF)
Recruit Low Affinity
CD8+ clones
Expand
High Affinity
CD8+ clones
Broaden
Immune response
No effect on naïve CD4+ T cell
(low expression IL2/15Rb)
 Expansion of existing
or vaccine-induced Immune response
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Strategie per stimolare/amplificare
la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Ripopolazione Adottiva (T cell)
•
T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene
•
•
•
•
Aumento antigen up-take e processing
Modulazione della maturazione delle DCs
Fornire co-stimulazione
Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune
•
•
Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)
Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF-b, -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Possibile Definizione
Terapia Genica:
Trattamento che si propone di correggere il/i
difetti molecolari causa di una determinata
patologia mediante introduzione nelle cellule
somatiche del gene mancante o difettivo.
Terapia Genica e Vaccinoterapia
Inserzione di geni in grado di ottimizzare la
risposta immunitaria nel contesto di vaccini
antitumorali
es:
Gene hIL-2 in TIL (vettori retrovirali)
TCR antigene specifico (es. Anti-gp100)
Gene per hIL-12 in DC
Gene per GM-CSF in cellule tumorali
Molecole co-stimolatorie (es. CD80) in cellule
tumorali
Vaccinoterapia
Citochine
Adoptive
T cell
Antigene
specifici
DCs
Proteine
GM-CSF
APC
artificiali
Terapia
genica