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Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie
Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie
a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica
METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
What influences microbial growth?
• Nutrition
• Environment
2014  Giovanni Vallini
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Nutrition
• Bacterial needs:
MAJOR ELEMENTS (C, H, O, N, P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe)
• Essential elements that make up cell parts and
macromolecules
• Source of C defines groups of bacteria:
– Heterotrophs
– Autotrophs
• Other elements can be derived from inorganic salts
TRACE ELEMENTS (B, Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn)
• Elements needed in minute amounts, usually for
enzyme functioning
GROWTH FACTORS (vitamins, amino acids, etc.)
Organic compounds required in small amounts that microbes can
not synthesised by themselves
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Environment
• Temperature
• pH
• Oxygen concentration
• Salinity
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Effetto della temperatura sul tasso di crescita
e conseguenze a livello molecolare per la cellula microbica
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
OPTIMA di temperatura per i microorganismi
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
OPTIMA di pH per i microorganismi
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Microorganismi e O2
L’ossigeno molecolare è un gas che risulta estremamente tossico nei confronti dei sistemi biologici i quali non
abbiano sviluppato meccanismi di difesa nei confronti dello stesso.
Bisogna ricordare che l’origine e lo sviluppo delle prime forme di vita sulla Terra è avvenuto in condizioni
strettamente anaerobiche. Solo in un secondo momento, con l’avvento della fotosintesi ossigenica, l’atmosfera si
è progressivamente arricchita di O2. Ciò ha spinto l’evoluzione nel senso di organismi capaci di sopravvivere in
presenza di questo gas, con indubbi vantaggi sul piano energetico-metabolico per i medesimi.
Al tempo stesso, lo sfruttamento di questi vantaggi ha richiesto l’adozione di adeguati sistemi di difesa contro gli
intermedi (veri responsabili della tossicità, dal momento che ossidano molecole biologiche chiave come i lipidi di
membrana!) quali lo ione superossido (O2-), il perossido di idrogeno (H2O2) ed il radicale idrossile (HO·) che si
formano allorquando l’O2 viene ridotto – nella respirazione aerobica - ad H2O.
La difesa nei confronti della tossicità legata alla presenza di ossigeno molecolare include meccanismi che limitino
il più possibile la produzione delle specie chimiche intermedie oppure eliminino questi intermedi allorché
inevitabilmente prodotti.
I microorganismi in grado di fronteggiare la presenza di O2 devono quindi disporre di sistemi enzimatici quali a)
superossido-dismutasi che catalizza la seguente reazione:
O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2
e ancora b) 1) catalasi e 2) perossidasi che catalizzano invece le reazione seguenti:
1) H2O2 + H2O2 -----> 2H2O + O2
2) H2O2 + NADH + H+ -----> 2H2O + O2 + NAD+
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
SULLA BASE DELLA RISPOSTA ALLA PRESENZA DI O2,
SI DISTINGUONO TRE CATEGORIE DI MICROORGANISMI
Categoria 1
AEROBI
Usano O2 e posseggono gli enzimi per detossificare gli intermedi
Categoria 2
ANAEROBI OSSIGENO-TOLLERANTI
Non usano l’O2 ma sono in grado di detossificare gli intermedi
Categoria 3
ANAEROBI OBBLIGATI
Non usano l’O2 e sono incapaci di detossificare le specie chimiche intermedie
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Classificazione dei microorganismi sulla base della richiesta di ossigeno
Categoria 1
A) AEROBI OBBLIGATI
B) MICROAEROFILI
C) CAPNOFILI
D) ANAEROBI FACOLTATIVI
muoiono in assenza di ossigeno molecolare (O2); non hanno
capacità di metabolismo fermentativo
crescono in maniera ottimale a concentrazioni di O2 più basse
(5-10 % fino a 15%) rispetto al livello di ossigeno atmosferico (20
-21%)
crescono in presenza di concentrazioni di O2 ridotte (intorno al
15%) ed elevate concentrazioni di CO2 (intorno al 5%)
crescono meglio in presenza di ossigeno; se assente, possono
fermentare o adottare la respirazione anaerobica: in tali
condizioni crescono più lentamente
Categoria 2
E) ANAEROBI AEROTOLLERANTI
fermentano sia in condizioni aerobiche che anaerobiche: l’O2 non
li uccide (es. Streptococcus lactis)
Categoria 3
F) ANAEROBI OBBLIGATI
sono uccisi dalla presenza di ossigeno molecolare; possono
avere metabolismo fermentativo ovvero adottare la respirazione
anaerobica
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
CRESCITA BATTERICA SULLA BASE DELLA RICHIESTA DI OSSIGENO
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Sistema Gas-Pack per colture microbiche in anaerobiosi
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Anaerobic Glove Box
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
BATTERI ED OSMOLARITA’
• Hypotonic
• Isotonic (0.85% NaCl)
• Hypertonic
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
BATTERI E SALINITA’ DEL MEZZO DI CRESCITA
Halophiles require elevated salt concentrations to grow; often require
0.2 M ionic strength or greater and may some may grow at 1 M or
greater; example, Halobacterium.
Osmotolerant (halotolerant) organisms grow over a wide range of
salt concentrations or ionic strengths; for example, Staphylococcus
aureus.
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
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● Corso
● Corso
di Microbiologia
di Metodologie
Generale
di Microbiologia
● Titolare: Prof.
e Genetica
Giovanni Vallini
METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
IL TASSO DI CRESCITA DI UNA COLTURA BATTERICA
Equation for calculating population size
over time:
Nƒ = (Ni)2n
Nƒ is total number of cells in the population.
Ni is starting number of cells.
Exponent n denotes the number of
generations
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Raffronto della stima della crescita microbica
mediante determinazione della densità ottica (nefelometria) e conta diretta su piastra
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Conta delle cellule batteriche
mediante ematocitometro
(es. Camera di Thoma modificata da Helber:
profondità 0.02 mm, superficie del quadrato centrale 0.0025 mm 2)
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Conta delle cellule batteriche mediante turbidimetro (nefelometro)
(OD = optical density; assorbanza espressa in NTU = nephelometric turbidity units)
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Conta microbica diretta
mediante il metodo del piastraggio delle sospensioni/diluizioni seriali
(CFU = colony forming units)
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
CONTA MICROBICA SU PIASTRA
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
A quick example problem: Suppose you inoculate a plate with 0.1 ml of a
10–1 dilution of a sample of milk. After incubation, you find that 80 colonies
have arisen on the plate. How may CFUs were there per ml of the milk?
Solution
As plating 0.1 ml of a 10–1 dilution is the equivalent of
plating 1 ml of a 10–2 dilution which is in turn equivalent to
plating 10–2 ml of the original, undiluted sample of milk,
then you could say that there would have been 80 CFUs
per 10–2 ml of the sample, and – proportionately – there
would have been 102 times as many CFUs (i.e., 8000 or 8.0
X 103) per ml of the undiluted milk sample.
Looking at the problem this way:
IF 80 colonies arise from plating 0.01 ml of the milk,
THEN there were 8.0 X 103 CFUs per one ml of the milk.
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Conta microbica mediante determinazione MPN (Most Probable Number)
3 0 0 0.23
3 0 1 0.39
3 0 2 0.64
3 0 3 0.95
3 1 0 0.43
3 1 1 0.75
Stima della carica microbica secondo il Metodo MPN
mediante ricorso alle Tavole di McCrady
The heading of the last column tells us that this
combination of results (in order: 3-2-0) suggests an
average of 0.93 organisms being inoculated into
each of the tubes of the middle set (of the three sets
of tubes chosen) – i.e., those inoculated with one ml
of a 10–3 dilution. Therefore, the most-probable
number of organisms per one ml of the original,
undiluted sample would be 0.93 X 103 or 9.3 X 102.
3 1 2
1.2
3 1 3
1.6
3 2 0 0.93
3 2 1
1.5
3 2 2
2.1
3 2 3
2.9
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
10-1
10-2
10-3
10-4
Annotare il numero di tubi positivi per ciascuna diluizione
Al fine di calcolare l’MPN, la prima cosa da individuare è l’ultima diluizione (detta anche diluizione
limite) che presenta tutti i tubi positivi (nell'esempio è la diluizione 10-2, dove la positività dei tubi è
indicata dall’accumulo di gas nella campanula di Durham) e il numero di tubi negativi nelle due
successive diluizioni. Nell'esempio in figura:
3 tubi positivi alla diluizione 10-1 ; 3 tubi positivi alla diluizione10-2 ; 2 tubi positivi alla diluizione10-3
; 0 tubi positivi alla diluizione10-4
La combinazione da leggere sulle Tavole di McCrady, come numero caratteristico, è 320
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Dinamica della crescita di Penicillium sp. e della produzione di penicillina
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Bioassay plate showing antibacterial activity
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Saggio per la determinazione dell’attività antibatterica
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
ANTIBIOGRAMMA
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Three bacterial colonies growing on this plate
secrete antifungal-antibiotics that diffuse into the
medium and inhibit the growth of a mold
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Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie
Chemical class
Examples
Biological source
Spectrum (effective against)
Mode of action
Beta-lactams
(penicillins and
cephalosporins)
Penicillin G,
Cephalothin
Penicillium notatum and
Cephalosporium
species
Gram-positive bacteria
Inhibits steps in cell wall
(peptidoglycan) synthesis and
murein assembly
Semisynthetic
penicillin
Ampicillin,
Amoxycillin
Gram-positive and Gram-negative bacteria
Inhibits steps in cell wall
(peptidoglycan) synthesis and
murein assembly
Clavulanic Acid
Clavamox is
clavulanic acid plus
amoxycillin
Streptomyces
clavuligerus
Gram-positive and Gram-negative bacteria
Suicide inhibitor of beta-lactamases
Monobactams
Aztreonam
Chromobacter
violaceum
Gram-positive and Gram-negative bacteria
Inhibits steps in cell wall
(peptidoglycan) synthesis and
murein assembly
Carboxypenems
Imipenem
Streptomyces cattleya
Gram-positive and Gram-negative bacteria
Inhibits steps in cell wall
(peptidoglycan) synthesis and
murein assembly
Aminoglycosides
Streptomycin
Streptomyces griseus
Gram-positive and Gram-negative bacteria
Inhibit translation (protein synthesis)
(30S ribosomal subunit inhibitor)
Gentamicin
Micromonospora
species
Gram-positive and Gram-negative bacteria
esp. Pseudomonas
Inhibit translation (protein synthesis)
Glycopeptides
Vancomycin
Streptomyces orientales
Gram-positive bacteria, esp. Staphylococcus
aureus
Inhibits steps in murein
(peptidoglycan) biosynthesis and
assembly
Lincomycins
Clindamycin
Streptomyces
lincolnensis
Gram-positive and Gram-negative bacteria
esp. anaerobic Bacteroides
Inhibits translation (protein synthesis)
Macrolides
Erythromycin
Streptomyces erythreus
Gram-positive bacteria, Gram-negative
bacteria not enterics, Neisseria, Legionella,
Mycoplasma
Inhibits translation (protein synthesis)
(50S ribosomal subunit inhibitor)
Polypeptides
Polymyxin
Bacillus polymyxa
Gram-negative bacteria
Damages cytoplasmic membranes
Bacitracin
Bacillus subtilis
Gram-positive bacteria
Inhibits steps in murein
(peptidoglycan) biosynthesis and
assembly
Amphotericin
Streptomyces nodosus
Fungi
Inactivate membranes containing
sterols
Nystatin
Streptomyces noursei
Fungi (Candida)
Inactivate membranes containing
sterols
Rifamycins
Rifampicin
Streptomyces
mediterranei
Gram-positive and Gram-negative bacteria,
Mycobacterium tuberculosis
Inhibits transcription (eubacterial
RNA polymerase)
Tetracyclines
Tetracycline
Streptomyces species
Gram-positive and Gram-negative bacteria,
Rickettsias
Inhibit translation (protein synthesis)
(30S ribosomal subunit inhibitor)
Semisynthetic
tetracycline
Doxycycline
Gram-positive and Gram-negative bacteria,
Rickettsias Ehrlichia, Borrelia
Inhibit translation (protein synthesis)
Chloramphenicol
Chloramphenicol
Gram-positive and Gram-negative bacteria
Inhibits translation (protein synthesis)
(50S ribosomal subunit inhibitor)
Polyenes
Streptomyces
venezuelae
METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Table 3. Classes of antibiotics and their properties
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Classes of antibiotics and their properties
Bacterial Hopanoids
Fungal Sterols
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Cultural Characteristics
Stock culture procedure
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Cultural Characteristics
Procedure for morphological study
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Cultural Characteristics
Types of bacterial growth on nutrient agar slants
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Cultural Characteristics
Type of surface growth in nutrient broth
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Cultural Characteristics
Colony characteristics
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Cultural Characteristics
Colony characteristics (bis)
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METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA
Cultural Characteristics
Colony characteristics (ter)
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