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Vector for cloning large DNA inserts
l PHAGE
l DNA
La regione N-J (circa 19 kb) può essere rimossa o sostituita
senza danneggiare il ciclo litico del fago.
Replicazione del DNA del fago l
durante il ciclo litico ed il ciclo
lisogenico
Forma replicativa
Lambda phage vectors
Many l vector are constructed with a stuffer fragment, a DNA segment
that resides in the region between J and N genes. The stuffer fragment is
cut out and replaced by foreign DNA during cloning procedure.
1) The stuffer fragment keeps the l vector at the correct size for packaging
as a phage particle.
2) The stuffer DNA fragment carries selectable marker genes that are
removed when foreign DNA is inserted.
About 60 % of lambda
genome is needed for the
lytic pathway
The lac5 gene encodes
b-galactosidase allowing blue-white
screening (cells lacZ- on medium
containing IPTG and X-gal).
EMBL series contain a
polylinker with EcoRI,
BamHI and SalI sites.
Recombinant molecules are
packaged into bacteriophage
lambda heads in vitro.
The product of
gene A cuts DNA at
cos sites.
The product of gene D is
necessary for DNA packaging.
Impaccamento in vitro dei concatenameri di l in presenza della
miscela dei due estratti di packaging
Il processo di impaccamento in vitro si basa sulla miscelazione del DNA fagico
ricombinante con elevate concentrazioni di precursori della testa, di code e
proteine di packaging. Si utilizzano estratti concentrati di due particolari ceppi
lisogeni per profagi l difettivi.
Mutante nel gene E
Mutante nel gene D
Reazione di ligasi
condotta in vitro
Durante il processo di
impaccamento i siti cos
devono trovarsi ad un
distanza compresa tra 37 e 52
kb. La proteina A taglia il
DNA a livello dei siti cos.
Life cycle and DNA
replication of M13
DNA cloning with singlestranded DNA vectors
Sequencing of M13, f1 and fd
filamentous coliphages indicates
that they are very similar (~ 6400
base).
Advantages of these vectors.
Preparation of single-stranded DNA
for sequencing (original deoxy
method) and oligonucleotide
directed mutagenesis.
The RF can be purified and
manipulated in vitro just like a
plasmid.
The RF is present at 100 copies per
cell.
For cloning purpose, DNA up to six
times the length of M13 can been
packaged (~ 30 kb).
Up to 1000 phages per cell
To the M13 series of
phage vectors belongs
M13 mp, pEMBL,
pBluescript, pSELECT.
ori
Cosmid vector, a combination of λ and plasmid vectors
Main features of cosmids (4-6 kb)
1) l cos sites. DNA fragments in the range of
30-46 kb cannot be cloned in lambda vectors
but they can be cloned in cosmid vectors where
large regions of l DNA are deleted.
2) a plasmid origin of replication
3) an antibiotic resistance
4) several unique restriction sites
Foreign DNA is usually
dephosphorylated to prevent
ligation of different fragments
and/or circularization.
Cut recombinant molecules at
cos sites (product of gene A).
Possible products of
the ligase reactions
RE sites
The λ phage is needed only to
inject the recombinant DNA
into E. coli cells
The cosmid contains the ori
and so behaves as a plasmid
replicating into E. coli cells.
Cosmids are particularly
attractive vectors for
constructing libraries of
eukaryotic genomes fragments.
Clonaggio mediante cosmidi
Il fago l viene usato
solo per inserire il
DNA cosmidico
all’interno della
cellula di E. coli.
Il cosmide viene tagliato in un sito BglII nei pressi di un sito cos. Il DNA
genomico viene tagliato con Sau3A, enzima che produce estremità
compatibili con quelle generate con BglII.
Mescolando si ottiene una serie alternata inserto di DNA-vettore. Il fago
viene impacchettato in vitro mediante un taglio a livello dei siti cos ad
opera dell’endonucleasi A.
Dopo l’inserimento nelle cellula batterica il cosmide ricircolarizza e si
replica come un plasmide grazie alla presenza dell’origine di replicazione
batterica (ori).
Cromosomi artificiali basati sul fago P1 (PACs)
E
I PAC possono contenere
fino a 100 kb.
E
Dopo digestione con un
enzima di restrizione (E)
le estremità del PAC
(braccio corto e lungo)
vengono defosforilate.
Ligasi del PAC con i
frammenti da clonare.
Taglio da parte
dell’enzima Pacasi ed
eliminazione del DNA in
eccesso delle 115 kb.
Impacchettamento in
vitro del DNA in
presenza delle teste e
delle code.
Le particelle fagiche
mature iniettano il DNA
in un ceppo di E. coli
cre+.
La ricombinasi Cre agisce sui siti loxP producendo una molecola di plasmide
P1 circolare (come λ) che viene mantenuto a basso numero di copie
all’interno del batterio grazie all’origine di replicazione ori. Resistenza alla
kanamicina. Per ottenere la produzione di un elevato numero di copie di P1
ricombinante è sufficiente indurre l’operone litico (repliconi P1) che è sotto il
controllo del promotore lac. Normalmente il PAC è mantenuto in cellule che
esprimono il repressore LacI
Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)
BACs (7 kb) are genetically engineered F factors that carry segment
of foreign DNA as long as 300 kb.
1) oriS and repE control F-factor replication.
2) parA and parB genes limit the number of copies to 1 or 2 per cell.
3) A chloroamphenicol resistance gene.
4) A cloning segment including rare cutting enzymes as NotI and SfiI
5) BACs are introduced into E. coli host cells by electroporation.
6) BACs with PACs have been extensively used to construct human
genomic DNA library.
Yeast Artificial Chromosomes (YACs)
(cloning site)
A non recombinant YAC is
a circular plasmid that
replicates in E. coli when it
does not contain foreign
DNA.
YACs can accommodate up
to 500 kb – 1 Mb DNA
fragment.
BamHI

The foreign DNA is
inserted YAC, into the
EcoRI site and then the
vector is linearized with
BamHI.
EcoRI

Then the YAC is
transferred into yeast
cells where it replicates as
an eukaryotic chromosome.
1) ori is the plasmid origin
of replication from pBR322
2) Ampr from pBR322
EcoRI

BamHI

3) It contains the
autonomous replication
sequences, ARS, a yeast
centromere sequence and 2
yeast telomere sequences
Cloning Strategies
Shotgun cloning – Construction of Human genomic DNA library
An EcoRI human genomic library may contain more than 700.000 different clones
assuming that DNA fragments are 4 kb long (human haploid genome is 2,8x109 bp). For
a cloned fragment of 20 kb the Minimum Number of Recombinants (MNR) is about
140.000
genome size
= MNR
Assuming the probability of including any sequence
average length of
P = 95% and MNR = 140.000 (2,8x109: 20.000)
cloned fragments
the total number of recombinants (N) necessary for
producing a representative gene library is 420.000
N=
ln (1-P)
ln (1-1/MNR)
If P = 99%, N = 650.000
Detection of recombinant clones in a
DNA library by colony hybridization
Probe identification and
synthesis
All 24 probes match this amino acids
sequence: Trp-Asp-Arg-Asp-Met
1) heterologous probe
2) synthesis of a degenerate set of
probes starting from the amino acid
sequence of the protein
3) Single probes of 40-60 bases
including inosine
Met, Trp  single codon
Asp  two codons
Leu, Ser, Arg  six codons
Codon usage  GUU, GUC, GUG
and GUA are the 4 cognate codons
for Val but in human 50 % of valine
codons are GUG.
2 x 3x 2 x1 x 2x 2
= 48 differenti oligonucleotidi
15-20 nucleotidi rappresentano un livello di specificità già sufficiente
per trovare una sequenza unica all’interno di una genoteca.
cDNA cloning
Una libreria di cDNA è più piccola (104-105 cloni) di
una libreria genomica completa. Ad esempio
nell’uomo abbiamo 30-35000 geni. Inoltre i
frammenti di cDNA clonati hanno dimensioni ridotte
(circa 2000 bp) rispetto a quelli comunemente usati
per la costruzione di una libreria genomica
(semplificazione delle procedure di clonaggio).
Le librerie genomiche hanno il vantaggio di contenere
i geni nella loro forma nativa che include le sequenze
introniche e regioni regolative.
Classica strategia per il
clonaggio di cDNA
Alternativamente
a questo step
possiamo inserire
dei DNA linkers
Strategia alternativa per
il clonaggio di cDNA che
non prevede l’uso della
nucleasi S1 ma della
terminal trasferasi.
L’enzima S1 è infatti
relativamente poco puro e
difficilmente controllabile,
fattori che determinano il
danneggiamento delle
molecole di DNA.
primer
Primer-dG, DNA
polimerasi (Klenow) + 4
dNTP
Una libreria a cDNA permette l’espressione di proteine
eucariotiche in cellule batteriche (i batteri non possono infatti
rimuovere gli introni).
Le librerie a cDNA sono usate per lo studio delle espressione
genica (espressione tessuto-specifica e differenziamento).
Le librerie a cDNA trovano un vasto impiego quando l’obiettivo
finale è rappresentato dal prodotto proteico.
In vitro site-directed mutagenesis is an
invaluable technique for studying:
- protein structure-function relationships
- gene expression
- vector modification (insertion or deletion of
restriction sites  DNA cloning procedures)
Regulation of
transcription and
translation
- promoters
- target sites for DNA binding
proteins (activators, repressors)
- translational apparatus
components (mRNA, ribosomes,
tRNA)
Protein
engineering
-Mutant proteins facilitate the
study of catalysis, substrate
specificity, stability, etc.
- Generation of chimeric proteins
- Increasing the bioactivity of
proteins (e.g. insulin, sequenase)
Three different methods of site-directed mutagenesis are available:

cassette mutagenesis

primer extension

procedures based on PCR
Mutagenesi a cassetta
Una breve sequenza sintetica di DNA contenente la mutazione desiderata
viene inserita nel gene bersaglio al posto della corrispondente regione wildtype.
Svantaggi:
- Siti di restrizione unici
ai lati della regione da
mutagenizzare.
Residui aminoacidici
mutagenizzati
N = A,T,G, C
I = Inosina
- Numero di
oligonucleotidi da
sintetizzare.
Single-stranded DNA
vector (M13, pSELECT)
Primer extension
The oligo pairing with
the amp gene causes a
four nucleotides
insertion which repairs
a frame shift mutation.
Does not strand displace
Repair deficient,
suppress in vivo
mismatch repair
Mutagenesi mediante PCR
Metodo del megaprimer
-Vengono utilizzati tre primers e due reazioni di amplificazione.
-Il prodotto della reazione di PCR viene utilizzato come primer
(megaprimer) per la seconda reazione di amplificazione.
Amplificazione con I° e II° primer
(il prodotto rappresenta il megaprimer)
Amplificazione con III° primer ed il megaprimer
Un vantaggio è che la mutazione desiderata viene ottenuta con una
frequenza praticamente del 100%. Uno svantaggio è invece legato alla
bassa fedeltà replicativa della Taq polimerasi. Attualmente si usano enzimi
quali Vent e Pfu dotati di attività 3'-5' exo (proofreading) e viene effettuato
come controllo il sequenziamento dei prodotti di PCR.
Mutagenesi mediante
PCR e DpnI
I due primers mutagenici
5’-------TTC---------3’
3’-------AAG---------5’
Il DNA stampo è metilato
Questa tecnica di mutagenesi puo’ essere effettuata su qualsiasi vettore e si
basa sul fatto che i prodotti di amplificazione non sono metilati.
I primers portanti la mutazione sono di solito di 35-50 nt.
Per la sintesi del DNA si usano enzimi quali Vent e Pfu dotati di attività 3'5' exo (proofreading o correzione delle bozze) e si effettuano circa 18 cicli
di PCR.
DpnI digerisce sia il DNA metilato che quello emimetilato.
Sintesi di un gene
artificiale
samples (C mix)
G A T C samples (C mix)
Screening dei prodotti di mutagenesi
(PCR-DpnI) mediante
sequenziamento del DNA con il
metodo di Sanger.
Solo l’ultimo campione è uguale
al wt (presenza di 2 C), gli altri
sono tutti dei mutanti.