Download Nessun titolo diapositiva

Estrazione del DNA batterico
Centrifugazione della
coltura batterica
Le cellule vengono
trattate con lisozima che
degrada la parete. La lisi
cellulare si ottiene
mediante differenti agenti
chimico-fisici:
- Calore
- NaOH + SDS
-Sonicazione
Trattamento con fenolo e/o fenolo-cloroformio per allontanare le proteine.
In presenza di etanolo (70%)
e Na+ il DNA cromosomale si
arrotola sulla bacchetta di
vetro.
In presenza di etanolo (70%)
e Na+ i frammenti di DNA
precipitano e possono
essere raccolti mediante
centrifugazione.
I Plasmidi
Molecole circolari che replicano indipendentemente dal cromosoma,
DNA extracromosomiale.
I plasmidi posseggono un propria origine di replicazione (ori).
I plasmidi variano in dimensione da 1,5 kb a 200-300 kb.
Il numero di copie per cellula può variare da 1-25 (low copy number)
fino a >100 (high copy number).
I plasmidi possono conferire differenti fenotipi:
- resistenza e sintesi di antibiotici;
- degradazione composti aromatici;
- fermentazione di zuccheri;
- sintesi di tossine;
- sintesi di batteriocina;
- induzione di tumori nelle piante;
- sintesi sistemi restrizione-modificazione del DNA;
- resistenza a metalli pesanti.
I plasmidi possono essere coniugativi (geni tra) o non-coniugativi.
Replicazione di derivati di ColE1
- RNA II  regolatore positivo della replicazione.
- RNAI e Rop  regolatori negativi della replicazione.
Mutazioni nel gene rop o nel RNA I determinano un incremento del copy number
Replicazione di pSC101
Iteroni
L’ origine (ori) contiene da 3 a 7
copie di una specifica sequenza R
(17-22 bp), detta iterone.
RepA si lega ai box R1, R2, e R3.
RepA si autoregola interagendo
con le sequenze ripetute invertite
IR1 e IR2 localizzate sul suo
promotore.
RepA funziona da regolatore negativo (RepA è in grado di prevenire l’inizio
della replicazione legandosi agli interoni di 2 plasmidi in modo da unirli
insieme e mutazioni a carico di questa proteina determinano un aumento del
numero di copie per cellula del plasmide pSC101.
pBR322
There are 40 enzymes with unique
cleavage sites on pBR322 (4361 bp).

pos. 1
The pBR322 contains the ApR and
TcR genes of RSF2124 (a ColE1
derivative carrying a transposon
specifying amp resistance) and
pSC101 respectively, combined
with replication element of pMB1, a
ColE1-like plasmid.
Features of many modern Plasmids
1) Small size
2) Origin of replication (e.g. ColE1, very high copy 500
copies per cell)
3) Multiple cloning site (MCS) , often embedded in a
LacZ report gene for ease of selecting inserts
4) Selectable marker genes (antibiotic resistance)
5) Some are expression vectors have sequences that
allow RNA polymerase to transcribe genes
6) DNA sequencing primers
7) Over expression of the cloned protein or expression of
fusion proteins
Purification of Plasmids
Takes advantage of distinct topological state of plasmids.
- plasmids will be covalently closed, negatively wound circles when E.
coli is lysed.
- chromosomal DNA will be sheared into linear, non-topologically
constrained fragments (because so big).
This difference can be exploited to allow purification of plasmids:
- difference in binding ethidium bromide, leading to different
densities (CsCl banding – Radloff et al. 1967).
- different rater of re-associate of two strands following denaturation
by boiling or alkaline treatment.
Alkaline denaturation
Birnboim & Doly (1979)
Cells + Lisozyme 
NaOH + SDS

Na-Acetate pH 5.2

Ctg.

Supernatant + Phenol /chloroform

Aqueous phase + Et-OH

Ctg.

Ctg  Plasmid DNA pellet
Plasmid DNA purification by centrifugation on EtBr-CsCl gradient
Less EtBr can bind to covalently
closed circular DNA (CCC) than
to a linear or nicked circular
DNA. In fact a CCC DNA
molecule as a plasmid has no
free ends and can only unwind
to limited extend, this limiting
the amount of EtBr
bound. Also, progressively
EtBr higher concentrations
shift DNA supercoiling
from negative to positive.
At 2 mg of EtBr per ml,
most of DNAs are
completely relaxed. The
arrow indicates the free
rotation of linear DNA.
The density of DNAEtBr complex
decreases as more
EtBr is bound
Ethidium bromide-caesium
chloride density gradient
centrifugation
Isolating Plasmids by spin column
•
Load supernatant with plasmids onto spin column.
•
The pellet is washed with EtOH, causing the plasmid DNA
to precipitate.
•
The plasmid DNA binds the resin in the spin column under
high salt conditions.
•
Wash the column.
•
Finally, the purified plasmid DNA is eluted in water.
Quality and Quantity of Nucleic Acids
Legge di Beer-Lambert
A=εxlxC
dove ε è detto coefficiente di assorbimento (estensione)
molare C è la concentrazione molare della soluzione e l è il
cammino ottico
1.
Quantity:
A260 = DNA
1 O.D. = 50 μg/ml DNA
O.D. x 50 (μg/ml) x dilution factor =
2.
Quality:
A280 = protein
XX μg/ml
Purity = A260/A280
If ratio ≈ 1.6 - 1.8, then assume it is a good prep.
If ratio > 2, then there is RNA contamination.
If ratio < 1.6, then there is protein contamination.
1 O.D. = 40 μg/ml RNA
1 O.D. = 33 μg/ml oligonucleotide
Trasformazione cellule batteriche
Metodo del Calcio cloruro.
Il CaCl2 forse provoca la
precipitazione del DNA sulla
cellula batterica o modifica la
parete migliorando il legame
del DNA.
Espressione geni
plasmidici (37°C)
Elettroporazione
L'elettroporazione è una tecnica per introdurre il DNA nelle cellule applicata a
protoplasti e funziona anche con le cellule animali, batteri e lieviti.
L'elettroporazione consiste in una repentina scarica elettrica (millisecondi)
operata in un piccolissimo contenitore che racchiude protoplasti vegetali e
molecole di DNA in una sospensione liquida. La scarica apre simultaneamente
la membrana plasmatica in numerosi punti (pori), permettendo alle molecole
di DNA di penetrare nella cellula.
Construction and identification of recombinant
pBR322 plasmids
Screening by replica plating
1) Master plate
containing tet only
2) Replica plating on plates
containing tet + amp
3) Cells on the replica
plate are allowed to grow
into colonies. Any colony
present on the master
plate but missing from the
replica plate carries a
recombinant pBR322 with
DNA inserted within amp
gene
pUC19
The polylinker encodes for
18 additional amino acids
that do not eliminate the
function of b-galactosidase
Cloning

Transformation
(lacZ- strain)

Selection on plates
containing amp +
IPTG + X-gal
Blue colonies  active b-gal  no insert
White colonies  inactive b-gal 
insertion of foreign DNA
galattosio
glucosio
Lattosio = 4-O-(b-galattopiranosil)-D-glucopiranosio
enzima b -galattosidasi
lattosio
galattosio + glucosio
IPTG
Isopropyl-b -D-thyiogalactospyranoside
Gratuitous inducer  è utilizzato per
indurre l’attività del lac operon poiché si
lega e inattiva il repressore lac, senza
essere degradato dall’enzima
X-gal
5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -Dgalactopyranoside
cleavage
Substrato cromogenico; a seguito
dell’azione enzimatica produce un
precipitato di colore blu-indaco
Expression vectors
pPLa2311 vector
Located 5-10 nucleotides upstream
the AUG [5’-UAAGGAGG-3’]
It should take into consideration
problems related to codon usage
Foreign DNA is cloned into EcoRI under the control of l PL
promoter. Ampicillin sensitivity can be used for screening of
positive clones.
The vector is inserted into an E. coli strain that carries on the
chromosome a temperature sensitive cI gene.
At 32°C  cI gene is active and
produces l repressor
At 42°C  inactivation of cI and
expression of the inserted gene
Standard protocol
Grow cells at 30°C

Shift the cells at 42°C for 10 min

Grow the cells at 37°C for 30 min

Collect the cells and
start protein purification
Overproduction of a toxic gene (hns)
After deletion of its own promoter the
hns gene is cloned into the pPLc2833
vector which is used to transform an E.
coli strain, carrying on the chromosome a
mutated (Ts) cI gene.
H-NS overproduction is checked by PAGE-SDS
C 1 2 3 M
C = crude extract of uninduced cells
1-3 = different aliquots of crude extract
of induced cells
M = protein marker
H-NS
Induced cells
Control sample (uninduced cells
growing at 30°C)
Time (min)
Vettori pET
-Il gene dell’RNA pol. di T7 (gene 1) viene inserito su cromosoma di E. coli
sotto il controllo del promotore lac.
-Il gene di interesse è clonato su vettore pET sotto il controllo del promotore di
T7.
-L’induzione si ottiene fornendo IPTG (analogo dell’allolattosio) che legandosi
al repressore LacI fa sicché quest’ultimo non riconosca l’operatore lacO.
-Il gene lacI è inserito sul cromosoma di E. coli.
-Il lisozima di T7, codificato dal plasmide pLysS, è in grado di legarsi alle rare
molecole di RNA pol. di T7 prodotte in assenza di induzione e di inattivarle.
-La presenza dell’operatore lacO tra il promotore di T7 ed il gene clonato
consente di ridurre ulteriormente l’espressione (ad es. gene tossico) in assenza
di IPTG.
Glutathione-S-Transferase fusion protein (1988)
Thrombin
Factor X
IPTG induction
using DE3 strain
GST fusion protein is purified under non-denaturating conditions by adsorption
to glutathione-agarose column which is subsequently eluted with glutathione.
His-tag expression vector
(pBAD/His plasmid)
PBAD  arabinose inducible
promoter
EK site  Enterokinase
cleavage site (Asp4-Lys)
A,B,C  MCS in all 3
reading frames
Epitope  antibody
recognition
araC  repressor
Repressione
Regolazione del promotore pBAD
Cambiamenti conformazionali a
carico del repressore AraC in seguito
alla presenza di arabinosio
determinano l’attivazione del
promotore pBAD
Attivazione
Purificazione della proteina ricombinante
La coda di istidine si lega alla colonna
che contiene ioni nichel immobilizzati
CL e FT  Proteine che non si
legano alla resina.
W1-W5  Lavaggi con bassa
concentrazione di imidazolo.
E1-E2  Eluizione con elevata
concentrazione di imidazolo.
 Proteina purificata
Vector for promoter analysis
pKK 232.8 is a vector
harbouring the promoterless cat
gene (reporter gene). The cat
gene encodes the enzyme
chloroamphenicol acetyl
transferase.
Cat expression

phenotype camr
Functional promoter is cloned into
polylinker of pKK232.8
Selection of transformed cells on plate LB+cam
Crude cellular extracts
CAT assay
CAT Assay
1= reaction performed without crude extract
2= mix containing the different products derived from the acetylation
reaction
3-12= samples
TLC = chloroform: methanol (19:1)