Download Il metabolismo: questo sconosciuto

Spingere, tirare o …?
Brute force is no substitute for understanding
Come aumentare/modificare l’amido?
Rilevanza dell’amido
* Cibo (wheat, rice, maize & potato) >109 t/yr
* Additivo in prodotti per consumo umano (farmaci…)
* Usi industriali: (cartaria, tessile, estrattiva …) 7x107 t/yr
* Etanolo…
E’ amido purificato (separato dal resto)
The UK alone consumes approximately 880,000 tonnes of starch
annually, 3/4 of which is eaten, while the rest is destined for industry.
Starch and its derivatives are already widely employed in the
manufacture of paper, textiles and adhesives, and due to their
biodegradable and renewable nature they are increasingly being
considered as an environmentally-friendly alternative to the use of
synthetic additives in other products, including plastics, detergents,
pharmaceutical tablets, pesticides, cosmetics, oil-drilling fluids…
http://www.andrewgray.com/essays/starch.htm
17/01/2014
53+22 = 75 M kg  460 M litri
Con 1 Kg di granella si fanno 6 l
di birra
Starch Technology
http://www.zuckerforschung.at/inhalt_en.php?titel=STARCH%20TECHNOLOGY&nav=nstaerkeinfo_en&con=cstaerkinfo_en
Very comprehensive website on starch technology, raw materials, properties, uses and
extraction.
The largest users of starch in the EU (30 %) are the paper, cardboard and corrugating industries.
Other important fields of starch application are textiles, cosmetics, pharmaceuticals, construction
and paints. In the medium and long run starch will play an increasing role in the field of
“renewable raw materials” for the production of biodegradable plastics, packaging material and
moulds.
Uso dell’amido nell’industria cartaria:
Paper industry is one of the largest users of starch. Starch is, in fact, the third
most prevalent raw material component in paper, only surpassed by cellulose
fiber and mineral filler. Depending on the type of paper produced, starch content
in the final products may be as high as 10% by paper weight. Starch used in
paper manufacture is generally found in three application areas which are wet end
internal sizing, surface sizing and coating.
http://www.thaitapiocastarch.org/article17.asp
In Germany alone the paper and adhesives industry require 500,000 tonnes of
highly purified amylopectin each year. Then there is the textile industry too, which
uses the starch to glaze threats prior to weaving. The food industry is also relevant.
http://www.zuckerforschung.at/fenster_en.php?img=images/cist_dia1_g_en.jpg
~70 Mt di amido nel 2010; una crescita annua del 4%
Starch is made of about 70% amylopectin and 30% amylose by
weight (la proporzione dipende dalla coltura, varietà, stadio…)
Amylopectin
Amylopectin is not soluble in water.
Large and highly branched
 addensante
(aumenta la viscosità)
Branched polymer with linear streches with α(1→4) glycosidic bonds
and branches with α(1→6) bonds every 24 to 30 glucose units.
Contains 2,000 to 200,000 glucose units
Amylose
Linear polymer, 300-3000 units
Amylose is soluble in water, assumes a spyral shape in solution
 Gelificante
Amylose starch is less readily digested than amylopectin (why?)
 dal punto di vista nutrizionale diluisce il carico da glucosio ed
è interessante per i diabetici
Biogenesis of potato starch granules
http://www.agfdt.de/loads/st07/visseabb.pdf
www.jic.ac.uk/staff/trevor-wang/appgen/starch/images/starchpath2.jpg
L’industria chiede sostanze
arricchite (e.g. solo amilopectina).
Purificabili con procedimenti
industriali (costosi).
 è possibile ottenere amidi
modificati per mezzo di mutanti
spontanei o transgenici (alterando
GBSS, SSI, I & III …).
http://www.jic.ac.uk/staff/trevorwang/appgen/starch/mutatab.html
High Amylopectin
High Amylose
National Center for Genetic Engineering and Biotechnology Thailand
Varietà con un contenuto di amilosio/amilopectina alterato esistono
già per numerosi organismi:
Waxy mutants (maize, rice, cassava, broad bean, pea, wheat, barley,
potato…, even Chlamydomonas) present little or no amylose.
Waxy corn: 100 % amylopectin, normal corn 75 % amylopectin
High amylopectin
maize mutants
All’estremo opposto: Amylomaize: a unique corn starch with
high (>50%) amylose. Similar mutants in cassava…
http://en.wikipedia.org/wiki/Waxy_corn
http://en.wikipedia.org/wiki/Amylomaize
http://www.freshplaza.it/news_detail.asp?id=30541
Introduzione delle patate OGM per uso industriale e nuovi
scenari nei materiali ecologici
A cura di Rossella Gigli
E' notizia recente che la BASF, in collaborazione con l'olandese AVEBE, sta
lavorando allo sviluppo di patate geneticamente modificate al fine di produrre
tuberi con livelli maggiori di amido, soprattutto nella tipologia molecolare
dell'amilopectina. Queste patate, come la già autorizzata Amflora, aprono
interessanti scenari nel settore degli impieghi non-food della fecola di patate.
 ELENCO DEGLI USI (interessante)
Due pesi, due misure…
Amflora potato: starch consists almost solely of amylopectin
Ottenuta nel ‘94 tramite antisenso contro un’isoforma di
GBSS. Prima applicazione del 1996
 15 years to get approval in the EU…
http://www.basf.com/group/corporate/en/innovations/research-verbund/research-projects/products/amflora
Visser RG, Somhorst I, Kuipers GJ, Ruys NJ, Feenstra WJ, Jacobsen E. (1991)
Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in
potato by antisense constructs. Mol Gen Genet. 225:289-96. Proof of concept:
B. Kull et al.: Genetic engineering of potato starch composition: inhibition of
amylose biosynthesis in tubers from transgenic potato lines by expression of
antisense sequences of the gene for granule-bound starch synthase. (1995) J.
Genet. & Breed. 49: 69-76
http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/16.docu.html
Muth J, Hartje S, Twyman RM, Hofferbert HR,
Tacke E, Prüfer D. (2008) Precision breeding for
novel starch variants in potato. Plant Biotechnol J.
6:576-84.
Super-patata del Fraunhofer Inst.
http://www.fraunhofer.de/en/press/research-news/2009/12/super-potato.jsp
“This fall (2009), 100 tonnes of the new super
potato that exclusively produces amylopectin
were harvested.”
Forse che queste non sono
modificazioni genetiche?
Same phenotype, essentially same genotype (loss of function)…
Ingegneria metabolica per aumentare l’amido
Oltre alla composizione (amylose vs. amylopectin) è possibile
modificare ed in particolare aumentare la quantità di amido?
Diversi gruppi hanno provato ad alterare gli enzimi della via
biosintetica.
I risultati? Modesti, nel migliore dei casi, o non riproducibili
Un esempio storico consiste nell’uso di una ADP-glucosio PPasi desensitizzata rispetto
all’inibitore a feedback 3-PGA (Stark et al., 1992), ma questi risultati non hanno potuto
essere riprodotti da un altro gruppo (usando un’altra varietà di patata).
Il sistema modello utilizzato è principalmente la patata.
Esamineremo in dettaglio alcuni tentativi di
modificazione del contenuto di amido.
Schema della sintesi dell’amido
Da Kossmann e Lloyd (2000), ridisegnato
Suc
pol. lineare 1→4
pol. ramificato 1→4, 1 → 6
CYTOSOL
Suc
Amylopectin Amylose
UDP-Glucose + Fructose
ADP-Glucose
Glucose-1-Phosphate
G-1-P
Glucose-6-Phosphate
G-6-P
PLASTID
Cellula del
tubero
G6P è un passaggio obbligato in patata
APOPLAST
Import
CYTOSOL
Pi
Suc
Susy
UDP
Gluc
Fru
starch
UDP
SPS
UDP-Gluc
PPi
UGPase
HK
GK
Suc6P
SPP
Inv
FK
PLASTID
ADP
Stasy
ADP-Gluc
PPi
AGPase
UTP
G1P
ATP
G1P
cPGM
ADP
ADP
Glycolysis
F6P
PGI
pPGM
G6P
G6P
Termodinamica
Geigenberger et al. (2004)
1° approccio: spingere
La sintesi di amido è limitata dalla disponibilità di zuccheri
o zuccheri fosfati?
Aumentiamo l’idrolisi del saccarosio (invertasi citosolica,
saccarosio fosforilasi, …)
Aumentiamo la capacità di fosforilare gli zuccheri (GK)
Esempio di manipolazione: patata che esprime l’invertasi e che è stata poi
super-trasformata con la gluco-kinasi.
Transgeni ingegnerizzati allo stesso scopo (es. Sucrose Phosphorylase)
mostrano fenotipi analoghi
Trethewey et al. (1998) Combined expression of glucokinase and invertase in potato tubers
leads to a dramatic reduction in starch accumulation and a stimulation of glycolysis. Plant J
15: 109-118
The original aim of this work was to increase starch accumulation
in potato tubers by enhancing their capacity to metabolise sucrose.
Invertasi
Invertasi + Glucokinasi
Contenuto in carboidrati
Zuccheri fosforilati
Un grosso aumento delle concentrazioni, ma una riduzione nel
flusso ad amido. L’omeostasi dei metaboliti, specialmente degli
zuccheri fosforilati è andata a pallino...
Aumenta la glicolisi
e la respirazione
Tuber-specific expression of
a yeast invertase and a
bacterial glucokinase in
potato leads to an activation
of glycolysis and a reduction
of starch
Altri tentitivi con lo stesso
scopo (aumentare gli
zuccheri fosforilati):
- Saccarosio fosforilasi
- Xilosio isomerasi
- ...
APOPLAST
Import
CYTOSOL
Pi
Suc
Susy
UDP
Gluc
Fru
starch
UDP
SPS
Xylose
Isomerase
HK
GK
Suc6P
SPP
Inv
UDP-Gluc
Sucrose
PPi
phosphor. UGPase
FK
PLASTID
ADP
Stasy
ADP-Gluc
PPi
AGPase
UTP
G1P
ATP
G1P
cPGM
ADP
ADP
Glycolysis
F6P
PGI
pPGM
G6P
G6P
Sucrose phosphorylase
Suc + Pi  G1P + F
I trasformanti possiedono
l’attività enzimatica attesa
Trethewey et al. (2001) Expression of a bacterial sucrose phosphorylase in potato tubers
results in a glucose-independent induction of glycolysis. Plant Cell Environ 24: 357-365.
Cosa provoca la SuPho?
Meno peso in patate e minor densità
(cioè meno amido per pianta)
Riduzione del contenuto di
amido e della resa in tuberi
È possibile calcolare la quantità di
amido prodotta da ciascuna pianta
(come moli di C6/g di tuberi)
Anche in questo caso
aumenta la glicolisi e la
respirazione
La sovraespressione della Saccarosio fosforilasi comporta...
Altri metaboliti
I livelli degli altri enzimi
Aumenta la sintesi del saccarosio …
…ma anche la sua idrolisi.
Che relazione tra futile cycling e ATP demand?
Fernie et al. (2002)
Tuber-specific expression of a yeast invertase and a bacterial glucokinase in potato leads
to an activation of sucrose phosphate synthase and the creation of a sucrose futile cycle
Sucrose(P) biosynthesis
SPS
UDP-Gluc
+
F6P
SPP
Suc6P
Suc
+
Pi
+
UDP
UDP-glucose + D-fructose 6-phosphate
UDP + sucrose 6-phosphate
SPS activity is stimulated by an increase in 1) substrates (F6P and
UDP-G), 2) allosteric activator (G6P) 3) a decrease in inhibitor (Pi)
4) activation of SnRK1 (stimulated by G6P)… [what about T6P?]
In the transgenics all metabolites change in the direction of an
activation of SPS.
ATP scende, ADP sale
2° approccio: tirare
TEORIA: sintesi di amido limitata dall’incorporazione di
ADP-G (il “rate limiting step”!) da parte della ADP-G PPasi
Aumentiamo la quantità di ADP-G PPasi o diminuiamo la
sensibilità all’inibitore a FeedBack
Risultati non esaltanti (un piccolo aumento nel flusso ad amido) o non riproducibili (nel
caso di ADPG PPasi desensitizzata:
A 4–5-fold increase in activity of the enzyme, achieved by transformation with the
Escherichia coli ADPglucose pyrophosphorylase gene glgC-16, had no detectable effect
on the starch content of developing or mature tubers. No significant effects were found
on the contents of ADPglucose, UDPglucose, glucose 1-phosphate, glucose 6phosphate, PPi, ATP and ADP.
Ma allora chi controlla la sintesi di amido???
Una sintesi dell’analisi condotta
su una decina di transgeni...
Geigenberger P, Stitt M, Fernie AR. (2004) Metabolic control
analysis and regulation of the conversion of sucrose to starch
in growing potato tubers. Plant, Cell and Environment
27:655–673.
Circa 30 papers!!!
 Valori del coefficiente di controllo del flusso ad amido
Geigenberger et al. (2004)
La sintesi dell’amido ha un RLS!
• Si tratta dell’importo di ATP dal citosol al
plastidio
• La quantità di trasportatore limita il flusso
• CJ è intorno a 0.9
• Serie di evidenze per il ruolo del metabolismo
degli adenilati nel regolare il flusso ad amido
• Ci sono anche altre reazioni con un certo
controllo…
Piante alterate nel trasportatore
Tjaden et al. (1998)
Morphology and number of wt and transgenic tubers
wt
as
(a) Wild-type, (b) antisense line 676
Notare che i tuberi antisenso mostrano una
strana morfologia, con numerosi bitorzoli
as
sense
(c) antisense line 654, and (d) sense line 62
(a) Wild-type, (b) antisense line 676, (c) antisense line 594, and (d) antisense line
654. Note the pronounced elongation and adventitious budding.
sense
wt
as
CJ ≈ 1
ΔG≈0
Bologa et al (2003)
Oxygen gradients within potato tubers expressing
Invertase or Sucrose phosphorylase (analysed using a
microelectrode)
Nothing is for free
 Increasing ATP consumption makes the tuber dangerously anoxic
Growing tuber
Stem
WT
INV
Expression of an ADH1-GUS reporter-gene in wt and
transgenic tubers expressing invertase in the cytosol
Bologa et al (2003) Plant Physiology 132:2058-2072.
Percentages of label
metabolized to starch
Wild type
Suc Phosphorylase
Nei tuberi SuPho la
marcatura contribuisce
meno all’amido (il
resto viene respirato)
Phenotype of fully
mature potato tubers
constitutively
expressing
plastidial apyrase.
Riewe et al., (2008)
Apyrase: enzima che
idrolizza ATP
Il sensore è plastidiale?
(il fenotipo è simile ai
tuberi antisenso per il
traslocatore e che
quindi probabilmente
consumano meno ATP
e hanno più ossigeno
disponibile...)
La sintesi di amido è limitata dal flusso di ATP
• Strategia sensata nell’economia cellulare perchè se
molto troppo ATP viene impiegato per fare amido,
la cellula risponde aumentando la respirazione
• Il tubero rischia di andare in ipossia/anossia con
tutti i conseguenti pericoli
• Altri transgeni che aumentano il flusso ad amido,
se esistono, potrebbero essere molto sensibili alle
condizioni colturali (es. terreni fradici)
Sono stati pubblicati altri transgeni che
sembrano aumentare il flusso ad amido...
Production of high-starch, low-glucose
potatoes through over-expression of
the metabolic regulator SnRK1
Overexpressing SnRK
McKibbins et al. Plant Biotechnol J. 2006 4:409-18
SnRK attiva la trascrizione e
stimola l’attività di due enzimi
della via dell’amido
L’aumento di amido, in
questo caso, sembra più
wishful thinking che reale
MA: Antisense expression of SnRK1 in
potato tubers does not result in a decrease
in starch levels (Purcell et al., 1998).
http://forosdelavirgen.org/17444/la-opinion-de-cientificos-catolicos-sobre-los-transgenicos-en-agricultura-2010-12-28/
3° approccio: luck!
Evidenze sperimentali che la sintesi di amido può essere
limitata dal rifornimento di ATP
* La sovraespressione (o riduzione) del traslocatore plastidiale per
ATP/ADP comporta un aumento (o una diminuzione) dell’accumulo
di amido in maniera praticamente lineare.
* Incubando fettine di tubero con adenina, si aumenta il pool degli
adenilati e anche la velocità di sintesi dell’amido.
 ci sono altri enzimi che esercitano un’azione sul
metabolismo degli adenilati?
Regierer et al. (2002)
Alterare la quantità di ATP a
livello del plastidio manipolando
l’adenilato kinasi plastidiale
Nessuna differenza fenotipica nella parte aerea…
…aumenta il pool
degli adenilati
ATP aumenta
ADP aumenta
AMP aumenta
ADP-G aumenta
(3-7x)
ATP/ADP scende
ec costante
e aumenta il contenuto in amido!
…con differenze nella quantità, peso e densità dei tuberi e
anche nel contenuto di quegli aminoacidi che richiedono ATP
…no no-one licensed the ADK patent which is a great pity. Since it is reproducible. I would
also have thought a company would have approached me about the Centeno Plant Cell paper
this year but they did not. I am sure regulatory costs and public perception played there parts in
both decisions. However, I have no evidence for either statement. (Fernie, pers. communic.)
Altro esempio
Centeno et al. (2011) Malate plays a crucial role in starch metabolism,
ripening, and soluble solid content of tomato fruit and affects
postharvest softening. Plant Cell 23:1162-184.
Articolo da leggere con
attenzione (uno dei pochi)
Amflora
Visser RG, Somhorst I, Kuipers GJ, Ruys NJ, Feenstra WJ, Jacobsen
E. (1991) Inhibition of the expression of the gene for granule-bound
starch synthase in potato by antisense constructs. Mol Gen Genet.
225:289-96.
B. Kull et al (1995) Genetic engineering of potato starch
composition: inhibition of amylose biosynthesis in tubers from
transgenic potato lines by expression of antisense sequences of the
gene for granule-bound starch synthase. J. Genet. & Breed. 49: 69-76
Muth J, Hartje S, Twyman RM, Hofferbert HR, Tacke E, Prüfer D.
(2008) Precision breeding for novel starch variants in potato. Plant
Biotechnol J. 2008 Aug;6(6):576-84.
VIB report (molto ben fatto):
http://www.vib.be/en/news/Documents/VIB%20Background%20report%20Amflora.pdf
Sintesi di amido
1 Kossman & Lloyd Understanding and influencing starch biochemistry (2000) Crit. Rev.
Plant Sci. 19:171-226
2 Geigenberger P, Stitt M, Fernie AR. (2004) Metabolic control analysis and regulation of
the conversion of sucrose to starch in growing potato tubers. Plant, Cell and Environment
27:655–673.
3 Sweetlove et al. (1999) The contribution of adenosine 5 '-diphosphoglucose
pyrophosphorylase to the control of starch synthesis in potato tubers Planta 209:330-337.
4 Trethewey et al., (1998) Induction of the activity of glycolytic enzymes correlates with
enhanced hydrolysis of sucrose in the cytosol of transgenic potato tubers Plant Cell Environ.
22:71-79
5 Trethewey et al., (1999) Combined expression of GlucoKinase and invertase in potato
tubers leads to a dramatic reduction in starch accumulation and a stimulation of Glycolysis
Plant J. 15:109-118
6 Fernie et al. (2002) Altered metabolic fluxes result from shifts in metabolite levels in
sucrose phosphorylase-expressing potato tubers. Plant, Cell & Environment, 25:1219-1232.
Continua....
7 Urbanczyk-Wochniak et al. (2003) Expression of a bacterial xylose isomerase in potato
tubers results in an altered hexose composition and a consequent induction of metabolism.
Plant Cell Physiol. 44:1359-67.
8 Tjaden J, Mohlmann T, Kampfenkel K, Henrichs G, Neuhaus HE (1998) Altered plastidic
ATP/ADP-transporter activity influences potato (Solanum tuberosum L.) tuber morphology,
yield and composition of tuber starch. Plant Journal 16: 531-540.
9 Loef et al. (2001) Increased levels of adenine nucleotides modify the interaction between
starch synthesis and respiration when adenine is supplied to discs from growing potato
tubers. Planta 212: 782-791.
10 Regierer et al. (2002) Starch content and yield increase as a result of altering adenylate
pools in transgenic plants. Nat Biotechnol. 20:1256-60.
11 Oliver et al. (2008) Decreased expression of plastidial adenylate kinase in potato tubers
results in an enhanced rate of respiration and a stimulation of starch synthesis that is
attributable to post-translational redox-activation of ADP-glucose pyrophosphorylase. J Exp
Bot. 2008
12 Riewe et al. (2008) Metabolic and developmental adaptations of growing potato tubers in
response to specific manipulations of the adenylate energy status. Plant Physiol. 146:157998.
Sweetlove LJ, Burrell MM, ap Rees T. (1996) Starch metabolism
in tubers of transgenic potato (Solanum tuberosum) with increased
ADPglucose pyrophosphorylase. Biochem J. 320:493-8.
Lloyd JR, Springer F, Buléon A, Müller-Röber B, Willmitzer L,
Kossmann J. (1999) The influence of alterations in ADP-glucose
pyrophosphorylase activities on starch structure and composition
in potato tubers. Planta. 209:230-238.
Bologa et al (2003) A Bypass of Sucrose Synthase Leads to Low
Internal Oxygen and Impaired Metabolic Performance in Growing
Potato Tubers. Plant Physiology 132:2058-2072.