Download Document 8909945

UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
Facultat de Veterinària
ESTUDI D’EFICÀCIA DELS CANNABINOIDES SOBRE
MODELS CUTANIS CANINS
SANTIAGO CERRATO TOMÀS
Directores: Anna Puigdemont i Pilar Brazís
Departament de Farmacologia, de Terapèutica i de Toxicologia
Programa de Doctorat en Farmacologia
Bellaterra, 2013
UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
Departament de Farmacologia, de Terapèutica i de Toxicologia
Facultat de Veterinària
La Dra. Anna Puigdemont Rodríguez, Catedràtica d’Universitat del Departament de
Farmacologia, de Terapèutica i de Toxicologia de la Universitat Autònoma de
Barcelona, i la Dra. Pilar Brazís Caubet, Directora d’Univet S.L.
CERTIFIQUEN:
Que el treball titulat: “Estudi d’eficàcia dels cannabinoides sobre models cutanis
canins”, l’autor del qual és SANTIAGO CERRATO TOMÀS, ha estat realitzat sota la seva
direcció i que compleix amb les condicions exigides per optar al títol de Doctor per la
Universitat Autònoma de Barcelona.
Dra. Anna Puigdemont Rodríguez
Dra. Pilar Brazís Caubet
Bellaterra, 15 de Maig del 2013
3
4
AGRAÏMENTS
5
6
AGRAÏMENTS
Arribat al final d’aquesta etapa, en la que he trobat innumerables satisfaccions i alguna
que altra dificultat, em refermo en la idea que la major part del mèrit de la consecució
d’aquesta tesis doctoral no està en la meva aportació personal, sinó en la participació
de les persones i institucions sense les quals aquest treball no hagués arribat a bon
port. Per això, és un plaer disposar d’aquest espai per poder expressar els meus
agraïments i poder ser just i conseqüent amb elles, ja que m’han permès créixer tant
personalment com professionalment.
En primer lloc agraeixo l’oportunitat que l’Anna i la Pilar em van concedir a l’hora de
realitzar aquesta tesi doctoral, la qual, sense la seva direcció, suport i confiança, no
hauria estat possible. Així mateix, també he d’agrair la seva contribució en la meva
formació com a investigador i permetre’m desenvolupar aquesta tasca a Univet i al
Departament de Farmacologia. Moltíssimes gràcies!
A l’Helena i a tota la meva família pel suport explícit i implícit en tot el que fet, mil
gràcies!
A tots els companys del Departament de Farmacologia, Toxicologia i Terapèutica i en
especial a l’Anna, la Maria, la Mariona, la Judith, en Toni i en Pere amb els qui he
compartit tants bons moments i espero compartir-ne de millors.
A totes les companyes d’Univet amb les qui és un plaer treballar i gaudir de bons
moments i millors àpats i en especial a la Laura per ser tan bona companya, i per
encomanar-me tant entusiasme i optimisme.
Thanks to Innovet for supported in part this work. Especially thanks to Maria Federica
della Valle for her invaluable help in the elaboration of these studies. I also would like
to thank Alda Miolo, Stefania Petrosino and Vicenzo Di Marzo for their essential
contribution to the different studies.
A l’Agencia de Gestió d’Ajuts Universitaris i de Recerca (AGAUR). Aquest treball s’ha
desenvolupat parcialment amb el suport del Comissionat per a Universitats i Recerca
del Departament d’Innovació, Universitats i Empresa de la Generalitat de Catalunya, a
través del programa FIE convocats per l’AGAUR.
“Les ciències tenen les arrels amargues, però molt dolços els fruits.”
Aristòtil (384 aC – 322 aC)
7
8
CONTINGUTS
CONTINGUTS
Abreviacions
13
I. SUMMARY
17
II. REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
21
1. Cannabinoides
23
1.1. Cànnabis
23
1.2. Cannabinoides
24
1.3. Endocannabinoides
25
1.4.Receptors cannabinoides
26
1.5. Sistema endocannabinoide
28
2. PEA
29
2.1. Metabolisme de la PEA: síntesi i degradació
30
2.2. Aliamides i accions farmacològiques de la PEA
32
2.3. Anàleg sintètic: adelmidrol
33
3. Inflamació al·lèrgica: resposta primerenca i tardana
34
3.1. Sensibilització
35
3.2. Fase primerenca o aguda
35
3.3. Fase tardana o crònica
36
4. Mastòcits
38
4.1. Funcions dels mastòcits
39
4.2. Els mastòcits i la dermatitis atòpica en el gos
41
4.3. Els mastòcits com a diana terapèutica
44
9
CONTINGUTS
III. HIPÒTESI I OBJECTIUS
47
IV. CAPÍTOLS
51
CAPÍTOL 1/CHAPTER 1
53
1. EFFECTS OF PALMITOYETHANOLAMIDE ON IMMUNOLOGICALLY
INDUCED HISTAMINE, PGD2 AND TNF ALPHA RELEASE FROM CANINE SKIN
MAST CELLS.
1.1. Abstract
55
1.2. Introduction
55
1.3. Material and methods
57
1.3.1. Reagents
57
1.3.2. PEA dissolution
57
1.3.3. Isolation and culture of canine skin MCs
58
1.3.4. Sensitization and activation of cutaneous MCs
58
1.3.5. Determination of histamine release from canine skin MCs
59
1.3.6. Determination of PGD2 release from canine skin MCs
59
1.3.7. Determination of TNFα release from canine skin MCs
60
1.3.8. Statistical analyses
60
1.4. Results
60
1.4.1. Effects of ethanol and PEA on cellular viability
60
1.4.2. Effects of PEA on anti-IgE-induced histamine release
62
1.4.3. Effects of PEA on anti-IgE-induced PGD2 release
63
1.4.4. Effects of PEA on anti-IgE-induced TNFα release
63
1.5. Discussion
65
1.6 Acknowledgements
68
1.7. References
68
10
CONTINGUTS
CAPÍTOL 2/CHAPTER 2
75
2. EFFECTS OF PALMITOYLETHANOLAMIDE ON THE CUTAENOUS
ALLERGIC INFLAMMATORY RESPONSE IN ASCARIS HYPERSENSITIVE
BEAGLE DOGS.
2.1. Abstract
77
2.2. Introduction
77
2.3. Material and methods
79
2.3.1. Drugs, chemicals, and reagents
79
2.3.2. Animals
79
2.3.3. Experimental protocol
80
2.3.4. Intradermal challenge
80
2.3.5. PEA extraction and detection by high-pressure liquid
chromatography (HPLC)
81
2.3.6. Data analysis
81
2.4. Results
82
2.5. Discussion
87
2.6. Conflict of interest statement
90
2.7. References
90
CAPÍTOL 3/CHAPTER 3
95
3. INHIBITORY EFFECTS OF TOPICAL ADELMIDROL ON ANTIGENINDUICED SKIN WHEAL AND MAST CELL BEHAVIOR IN A CANINE
MODEL OF ALLERGIC DERMATITIS.
3.1. Abstract
97
3.2. Introduction
97
3.3. Material and methods
99
3.3.1. Drugs, Chemicals, and Reagents
99
3.3.2. Animals
100
3.3.3. Experimental protocol
100
3.3.4. Planimetry
101
11
CONTINGUTS
3.3.5. Collection of skin biopsy specimens
101
3.3.6. Histopathology
102
3.3.7. Data analysis
102
3.4. Results
103
3.4.1. Macroscopic results
103
3.4.2. Microscopic results
104
3.5. Discussion
105
3.5.1. Magnitude of the inhibitory effect on skin wheal
106
3.5.2. The purported mechanism involves mast cell control
108
3.5.3. Practical considerations
110
3.6. Conclusions
111
3.7. Competing interests
112
3.8. Authors’ contributions
112
3.9. Acknowledgements
112
3.10. References
112
V. DISCUSSIÓ GENERAL
121
5.1. La PEA, els MCs i el seu mecanisme d’acció
123
5.2. La PEA en el model de dermatitis al·lèrgica en gossos Beagle
129
5.3. Bioseguretat i tolerabilitat de la PEA
132
5.4. L’adelmidrol en el tractament tòpic de la dermatitis al·lèrgica
134
VI. CONCLUSIONS
141
VII. REFERÈNCIES (REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA I DISCUSSIÓ)
145
12
ABREVIACIONS
13
14
Abreviacions
AEA:
anandamida
ALIA:
autocoide antagonista de les lesions locals
AMPc:
fosfat d’adenosina cíclic
CB:
cannabinoide
CB1 i CB2:
receptor cannabinoide 1 i 2
DA:
dermatitis atòpica
eCB:
endocannabinoide
EPR:
fase primerenca
FAAH:
amida hidrolasa d’àcids grassos
FcεRI:
receptor d’alta afinitat de les IgEs
IgE:
immunoglobulina E
IL:
interleuquina
LPR:
fase tardana
LT:
leucotriè
MC:
mastòcit
NAE:
N-acetiletanolamina
NAPE:
N-acilfosfatidiletanolamina
NAT:
N-acetiltransferasa
PAA:
amidasa àcida de les N-acetiletanolamides
PEA:
palmitoiletanolamida
PG:
prostaglandina
PLD:
fosfolipasa D
SCF:
factor de cèl·lules mare
TNFα:
factor de necrosi tumoral alfa
2-AG:
2-araquidonilglicerol
15
16
I. SUMMARY
17
18
I. SUMMARY
The incidence of spontaneous allergic reactions in dogs, e.g. atopic dermatitis, appears
to be increasing. Although management of this kind of diseases combines different
interventions depending on the particular aetiology, the most widespread therapeutic
approach still relies on glucocorticoids, which can lead to a variety of adverse effects,
especially with chronic treatments. Therefore, it is important to develop new effective
therapies for controlling allergic and inflammatory processes associated with a number
of skin diseases in the dog. In this sense, recent studies have shown the existence of
new endogenous lipid mediators (endocannabinoids) with anti-inflammatory and
analgesic properties, e.g. palmitoylethanolamide (PEA).
PEA and its synthetic analogue adelmidrol belong to a group of fatty acid amides called
aliamides which are able to act through the downregulation of mast cell (MC)
degranulation. Although its pharmacological efficacy is well known in skin
inflammatory diseases, the mechanism of action of this family of compounds is still
unclear.
To better understand the cellular effects of aliamides in dogs, canine mast cells freshly
isolated from skin biopsies were incubated with IgE-rich serum and were challenged
with anti-canine IgE. Histamine, prostaglandin D2 (PGD2) and tumour necrosis factoralpha (TNFα) release was measured in the presence and absence of increasing
concentrations of PEA. The results showed a significant inhibition of histamine, PGD2
and TNFα release in the presence of PEA, showing the ability of this aliamide to downmodulate skin MC activation.
Once observed PEA effects in canine MCs, the objective was to evaluate its efficacy on
the cutaneous allergic inflammatory reaction induced in hypersensitive Ascaris suum
dogs. Therefore, the formation of wheals was induced in dogs skin by intradermal
injections of Ascaris extract, substance P and anti-canine IgE, before and after a single
oral administration of PEA at doses of 3, 10 and 30 mg/kg. The results showed a
significant reduction in wheal area induced by both antigen and anti-canine IgE
challenge after PEA administration at two higher doses.
19
Finally, the efficacy of topical adelmidrol treatment during 8 consecutive days was
evaluated on induced early and late inflammatory responses in Ascaris hypersensitive
dogs. Therefore, the formation of wheals was performed by repeated intradermal
injections of antigen extract and two biopsies per dog were obtained from injection
points (adelmidrol-treatment and vehicle-treatment). The results showed a significant
reduction in the antigen-induced wheal areas after 4 and 7 days of adelmidrol
treatment, whereas no effects were observed with vehicle treatment. Moreover, the
cellular recruitment were analysed in biopsies obtained after 8 consecutive days of
topical adelmidrol or vehicle treatment. The results revealed a significant decrease of
mast cell number with adelmidrol treatment in comparison with vehicle treatment.
Therefore, our findings showed that the anti-inflammatory effects of PEA and
adelmidrol observed in dogs could be due, at least in part, to its ability to inhibit the
release of both preformed and newly synthesised MCs mediators and to reduce the
MCs cell numbers. In conclusion, PEA and adelmidrol might constitute a new
therapeutic strategy for the treatment of allergic inflammatory skin diseases in
companion animals.
20
II. REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
21
22
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
II. REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
1. Cannabinoides
1.1. Cànnabis
El cànnabis és un gènere de plantes amb flor que inclou tres espècies (Cannabis
sativa, Cannabis indica i Cannabis ruderalis), totes elles originàries del centre i sud
d’Àsia (figura 1).
Figura 1. Planta del cànnabis (adaptat de Khöler’s Medeizinal Plfanzen, Brandt et al., 1887)
El cànnabis va ser una de les primeres plantes cultivades per l’home i les
primeres evidencies del seu ús daten del 4000 aC a la Xina, on estudis arqueològics
indiquen que es cultivava per a la utilització de les seves fibres (Li i Lin, 1974).
La marihuana i altres derivats de la planta del cànnabis s’han utilitzat com a
planta medicinal des de fa milers d’anys, així com per a finalitats recreatives. No
obstant, les primeres referències de l’ús del cànnabis per les seves qualitats
terapèutiques van ser descrites en la Farmacopea Xinesa al segle I, en base a les
23
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
tradicions orals que es remunten al 2700 aC (Touwn, 1981). A l’Índia, des de l’any 1000
aC, el cànnabis tenia una forta associació amb les pràctiques religioses, i en els textos
sagrats “Vedas” (els textos més antics de la literatura Índia) es refereixen a ella com
"una font de felicitat, donant de l'alegria i la que porta la llibertat" (Touwn, 1981).
Durant els darrers anys, la recerca científica ha permès eliminar les objeccions
ètiques i morals derivades de l’ús del cànnabis com a droga d’abús, que limitaven
l’estudi dels seus possibles usos terapèutics. Els efectes farmacològics del cànnabis i
dels seus derivats avui en dia són ben coneguts i inclouen sedació, efectes analgèsics,
antiinflamatoris i antiemètics, a més d’estimulador de la gana, entre d’altres (Ashton,
2001; Burstein, 1999; Adams i Martin, 1996).
2.2. Cannabinoides
El terme cannabinoide (CB), estrictament, es refereix a un grup de compostos
químics que actuen sobre el receptor cannabinoide 1 o 2 (CB1 i CB2), o sobre tots dos,
i que són activats per varis compostos presents en el cànnabis. No obstant això, hi ha
altres molècules que no activen els receptors CB però que sovint se les inclou dins
d’aquest grup degut a les seves propietats cannabimimètiques.
Els principals tipus de CBs es classifiquen com a fitocannabinoides (produïts de
forma natural per varies plantes), endocannabinoides (produïts de forma natural pel
cos humà i per animals) i CBs sintètics (produïts químicament per l’home).
Històricament, les aplicacions terapèutiques i psicoactives del cànnabis daten
de centenars d’anys, però la recerca del cànnabis va estar restringida a un nombre
reduït de científics fins les darreres dècades. Doncs no va ser fins a principis del segle
XIX, quan Sir W.B. 0’Shaughnessy va experimentar metòdicament les propietats
medicinals del cànnabis (0’Shaughnessy, 1838-1840).
En la dècada del 1940, Jacob i Todd (1940), i Adams et al. (1940), per tal
d’aclarir el paper biològic i fisiològic del cànnabis en els essers humans, van elucidar
l’estructura i síntesis del primer CB de la planta del cànnabis, el cannabinol. Més tard,
24
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
Gaoni i Mechoulam (1964) van elucidar l’estructura del ∆9-tetrahydrocannabinol (THC)
(figura 2), el CB més notable i responsable de l’activitat psicotròpica del cànnabis
(Howlett et al., 2004). Altres CBs presents en la planta del cànnabis són el
cannabicromèn, el cannabidiol, entre d’altres. Fins l’actualitat, s’han identificat més de
60 CBs de la planta del cànnabis (Elsohly i Slade, 2005).
Figura 2. Estructura química del THC.
Malgrat tot, va ser la identificació dels receptors CB1 i CB2 (Matsuda et al.,
1990; Munro et al., 1993) que va permetre l’inci de la comprensió del mecanisme
d’acció dels CBs.
1.3. Endocannabinoides
Els endocannabinoides (eCBs) són molècules lipídiques produïdes de forma
ubiqua a l’organisme i que contenen llargues cadenes de àcids grassos poliinsaturats,
amides, èsters i èters. Una de les característiques més notables dels endocanabinoides
és que no s'emmagatzemen a l’interior de les cèl·lules, sinó que es sintetitzen i
s'alliberen a demanda després de l'estimulació cel·lular (Di Marzo i Deutsch, 1998).
El terme “endocannabinoides” vas ser proposat per Di Marzo i Fontana (1995)
per anomenar els agonistes endògens dels receptors dels CBs, tal i com Guillemin et al.
(1977) van anomenar les endorfines (de endogen i morfina), als compostos capaços
d’agonitzar els receptors endògens activats per la morfina.
25
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
Un cop va ser aïllat el receptor CB1, l’estudi dels CBs es va centrar en la recerca
dels agonistes endògens per aquests receptors, produïts pels teixits dels mamífers. La
hipòtesi d’aquesta línia de recerca era que els receptors dels CBs no havien estat
seleccionats per l’evolució només per ser una diana dels fitocannabinoides. Al 1992,
Devane et al. van identificar el primer eCB al cervell del porc, la Naraquidonoiletanolamida o anandamida (AEA), de la paraula sànscrita ananda, que
significa “portador de pau i felicitat interior”. Tres anys més tard es va descobrir un
segon eCB, el 2-araquidonilglicerol (2-AG) (Mechoulam et al., 1995). Des de llavors,
s’han descobert un gran nombre de lípids endògens amb activitat eCB, també coneguts
com endocannabinoid-like compounds, com per exemple la N-palmitoiletanolamida
(PEA) i la N-oleoiletanolamida (figura 3).
Figura 3. Estructura química de la 2-AG, AEA, OEA i PEA (André i Gonthier,
2010).
1.4. Receptors cannabinoides
Els CBs exerceixen els seus efectes farmacològics a través dels seus receptors.
Els principals subtipus de receptors cannabinoides són el CB1 i CB2. Aquests receptors
contenen una única cadena polipeptídica, amb un C-terminal intracel·lular, un Nterminal extracel·lular i set hèlixs α transmembranals acoblades a proteïna G (Munro
et al., 1993). No obstant això, es troben diferents classes estructurals dels receptors,
que tenen la capacitat única d'activar diferents cascades de senyalització que, al seu
torn, influeixen en l'eficàcia de l’agonista. Entre aquestes vies trobem la inhibició de
l'adenilat ciclasa (Howlett i Mukhopadhyay, 2000), l’estimulació de la proteïna quinasa
26
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
activada per mitogen (Woelkart et al., 2008; Bouaboula et al., 1995) i la
fosfatidilinositol-3-quinasa (Carracedo et al., 2006; Gomez Del Pulgar et al., 2002;
Molina-Holgado et al., 2002), i en el cas de CB1, també la modulació de canals iònics
(Mu et al., 1999; Pertwee, 1997; Mackie i Hille, 1992).
Els eCBs, així com també els fitocannabinoides i els anàlegs sintètics, mostren
diferent grau de selectivitat pels receptors CB1 i CB2, que juntament amb les
diferències considerables en la distribució i localització d’aquests receptors en el cos,
determinen les funcions que desenvolupen (Pertwee et al., 2010).
El receptor CB1 s’expressa tant a nivell del sistema nerviós central com a nivell
perifèric. A nivell central, el CB1 s’expressa de forma abundant en certes regions de
l’encèfal com el cerebel, el hipocamp, el tàlem, el hipotàlem, a més d’altres (Cota et
al., 2003; Tsou et al., 1998; Westlake et al., 1994; Herkenham et al., 1991); i a nivell
perifèric es troba a l’endoteli vascular, a la musculatura llisa, a les sinapsis dels nervis
perifèrics, al tracte gastrointestinal, al fetge, als ulls, als testicles i en cèl·lules del
sistema immune (Croxford, 2003; Pertwee, 1997). Els efectes de l’activació dels CB1 a
nivell central inclouen la reducció de la temperatura corporal i la locomoció, catalèpsia,
alteracions en la memòria, sedació, i eufòria; efectes també observats en l’ús del
cànnabis (Adams i Martin, 1996). A nivell perifèric, l’activació dels receptors CB1 en les
terminacions nervioses produeix analgèsia (Gutiérrez et al., 2007; Calignano et al.,
1998; Jaggar et al., 1998), incrementa la lipogènesi al fetge (Osei-Hyiaman et al., 2005),
redueix la tos (Calignano et al., 2000) i inhibeix el trànsit intestinal (Calignano et al.,
1997).
En canvi, el receptor CB2, al que normalment se l’anomena perifèric perquè es
troba de forma escassa a les cèl·lules neuronals del sistema nerviós central, s’expressa
de forma elevada a les cèl·lules del sistema immunitari (incloent les cèl·lules de la
microglia del sistema nerviós central), al pàncrees i als teixits limfoides com el timus,
amígdales, la medul·la òssia i la melsa (Galiègue et al., 1995; Lynn i Herkenham, 1994;
Munro et al., 1993). Per aquestes raons es considera que els receptors CB1 són
responsables dels efectes psicoactius produïts per certs cannabinoides, metre que els
27
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
receptors CB2 tindrien un paper més rellevant en els processos inflamatoris i
immunològics (Basu et al., 2011; Ashton i Glass, 2007; Munro et al., 1993).
1.5. Sistema endocannabinoide
El sistema d’endocannabinoides és el conjunt de receptors CBs i els seus
lligands endògens (eCBs), a més, dels enzims involucrats en la seva síntesi i degradació.
La identificació dels diferents enzims involucrats en la síntesi i degradació dels
eCBs ha permès una millor comprensió del sistema d’endocannabinoides, a més de la
recerca de nous fàrmacs per modular l’acció d’aquests enzims. Una regla general per a
la ruta de biosíntesi dels eCBs és que es sintetitzen a partir de fosfolípids de la
membrana cel·lular a través d’una fosfolipasa. Els eCBs AEA i 2-AG es sintetitzen
mitjançant dues vies principals de síntesi (figura 4). L’AEA es forma a partir del
precursor fosfatidiletanolamina present a la membrana plasmàtica a través de
l’activació de dos enzims: la N-aciltransferasa (NAT) i la fosfolipasa D (PLD) (Sugiura et
al., 1996; Di Marzo et al., 1994). El fosfat d’adenosina cíclic (AMPc) i Ca2+ poden
modular l'activitat de la NAT i així controlar la quantitat de substrat disponible per a la
síntesi d’AEA (Cadas et al., 1996). En canvi el 2-AG es genera a partir de la fosfolipasa
C, que transforma els lípids de la membrana en diacilglicerol, amb el que la
diacilglicerol lipasa produeix el 2-AG. No obstant això, altres vies poden estar
involucrades en la síntesi d’aquests eCBs (Muccioli, 2010). La degradació dels eCBs es
realitza principalment a través de dos enzims intracel·lulars, l’amida hidrolasa d’àcids
grassos (FAAH) i la monoacilglicerol lipasa, que respectivament hidrolitzen l’AEA i el 2AG, a més d’altres compostos (Dinh et al., 2002a i 2002b, Cravatt et al., 1996).
28
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
Figura 4. Representació de les vies principals de la síntesi i degradació dels
endocannabinoides (adaptat de Hashimotodani et al., 2007).
2. PEA
La PEA presenta propietats cannabimimètiques, és a dir, exerceix accions
farmacològiques semblants als CBs, però presenta una baixa afinitat pels receptors
CB1 i CB2, per això, juntament amb altres compostos endògens, són coneguts com
endocannabinoid-like compounds. La PEA és un compost endogen derivat dels àcids
grassos saturats, químicament coneguda com a N-(2-hidroxietil) hexadecanamida o N-
(2-hidroxietil)-palmitamida, i que també s‘anomena palmidrol a través de la
Denominació Comuna Internacional. És una N-acetiletanolamina (NAE) que es
produeix de forma natural, de manera que es pot trobar a baixes concentracions en la
majoria d’organismes incloent llevats, plantes i mamífers (Muccioli et al., 2009; Ozalp i
Barroso, 2009; Chapman, 2004) i desenvolupa diverses accions que col·lectivament es
considera que tenen uns efectes protectors i homeostàtics, tant en els animals com en
les plantes (Petrosino et al., 2010a; Re et al., 2007; Chapman, 2004).
29
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
La PEA es va descobrir a finals dels 1950, quan es va demostrar que els efectes
antial·lèrgic i antiinflamatori observats en la utilització del rovell de l’ou, l’oli de
cacauet i la lecitina de la soja com a suplements dietètics (Long i Martin, 1956; Coburn
et al., 1954), eren deguts a una fracció lípidica específica que corresponia a la PEA
(Kuehl et al., 1957). Posteriorment, aquest compost es va identificar en els teixits dels
mamífers (Bachur et al., 1965). Malgrat que aquesta descoberta va conduir a la
realització d’estudis clínics amb aquest compost (Masek et al., 1974; Perlik et al., 1971)
i a la seva comercialització a l’antiga Txecoslovàquia, per raons desconegudes, es va
interrompre tant el seu ús com el seu estudi durant més de 20 anys (Lo Verme et al.,
2005).
No va ser fins el descobriment de l’AEA l’any 1992, que va retornar el interès
per la PEA i les seves propietats farmacològiques. Doncs, al 1993, el grup de recerca
liderat per la guanyadora del premi Nobel Rita Levi Montalcini, va realitzar un estudi
on el tractament amb PEA va reduir de forma significativa la degranulació dels MCs
induïda per substancia P a l’orella de rates (Aloe et al., 1993).
2.1. Metabolisme de la PEA: síntesi i degradació
Totes les NAEs es produeixen a demanda, és a dir, no s’emmagatzemen en
vesícules a l’interior de les cèl·lules, sinó que són enzimàticament sintetitzades a partir
dels corresponents fosfolípids de la membrana cel·lular quan les cèl·lules reben un
estímul potencialment perjudicial. Així doncs, la PEA, de la mateixa manera que altres
NAEs, actua localment i els seus nivells tissulars estan fortament regulats a través d’un
balanç entre les vies anabòliques i catabòliques, respectivament mitjançades per un
enzim biosintètic específic per les N-acetilamines, la PLD i un enzim hidrolitzant,
l’amidasa àcida de les N-acetiletanolamines (PAA) (Petrosino et al., 2010b; Petrosino i
Di Marzo, 2009). Per tant, la biosíntesi del PEA es desenvolupa a nivell de la membrana
plasmàtica en dos passos (Lo Verme et al., 2005). El primer és la transferència de l’àcid
palmític de la fosfatidilcolina a la fosfatidiletanolamina per formar la Nacilfosfatidiletanolamina (NAPE) a través de la NAT, per un mecanisme que depèn de
calci i AMPc. En segon lloc, es produeix l’escissió de la NAPE, que allibera la PEA al
30
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
citoplasma a través de l‘enzim PLD. Després de fer el seu efecte, la PEA es degrada a
través de la PAA, encara que també pot ser degrada per la FAAH (figura 5). La PAA és
un enzim que no presenta homologia amb l’enzim FAAH, que originalment es va
identificar com a responsable de la inactivació de les NAEs a àcids grassos i
etanolamina. Per tant, existeixen dues vies que catalitzen la mateixa reacció (Ueda et
al., 2010).
Figura 5. Síntesi i degradació de la PEA (Lo Verme et al., 2005):
fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), N-acetiltransferasa (NAT),
N-acilfosfatidiletanolamina (NAPE), amidasa àcida de les Nacetiletanolamines (PAA), fosoflipasa D (PLD), palmitoiletanolamida (PEA),
amida hidrolasa d’àcids grassos (FAAH), amidasa àcida de les Nacetiletanolamides (PAA).
31
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
Degut a que la PAA i la FAAH són enzims intracel·lulars, la PEA extracel·lular és
transportada a l’interior de la cèl·lula per ser desactivada, tot i que gràcies a les seves
propietats lipòfiles podria penetrar per difusió passiva a l’interior de la cèl·lula. Així
doncs, tant les cèl·lules neuronals com les immunològiques, com per exemple els
mastòcits (MCs), recapten la PEA a través d’un transportador específic (Jacobsson i
Fowler, 2001; Bisogno et al., 1997).
2.2. Aliamides i accions farmacològiques de la PEA
Al 1993, Aloe et al. van observar que la PEA reduïa de forma significativa la
degranulació dels MCs induïda per substancia P a l’orella de rates. Llavors es va
especular que la producció endògena de PEA de forma local, podria ser una resposta
adaptativa per modular l’activació dels MCs i en conseqüència el desenvolupament del
procés inflamatori. Per això, sovint es descriu la PEA com un autocoide local
antagonista de les lesions (en anglès Aucotoid Local Injury Antgonist), d’on sorgeix
l’acrònim ALIA, encunyat pel grup de Levi-Montalcini, per donar nom a la família
d’amides amb aquestes propietats. Els autocoides són molècules reguladores
produïdes de forma local que es sintetitzen en resposta a un estímul que pot ser una
lesió o un procés inflamatori, com per exemple les prostaglandines (PGDs). No obstant,
les aliamides tindrien la funció de contrarestar alguns dels efectes desencadenats per
la lesió com la inflamació i el dolor (Hansen et al., 2000; Moesgaard et al., 2000; Facci
et al., 1995). Diferents estudis corroboren aquesta hipòtesi, per la qual els nivells de
PEA es veuen significativament incrementats després de produir-se una lesió (GarciaOvejero et al., 2009; Franklin et al., 2003; Schäbitz et al., 2002; Epps et al., 1979).
Els principals efectes farmacològics descrits per l’administració de la PEA
comprenen els antiinflamatoris i analgèsics. Aquestes propietats han estat
repetidament demostrades tant in vitro com in vivo i s’ha observat que els MCs tenen
un paper clau tant en la inflamació neurogènica com immunogènica a nivell del teixits
perifèrics (Hsu et al., 2010; Tore i Tuncel, 2009; Brown et al., 2008; Kinet, 2007;
Theoharides et al., 2007). A més a més, la PEA també actua desenvolupant un paper
neuroprotector a nivell del sistema nerviós central i perifèric, i fins i tot, pot actuar
32
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
inhibint la ingesta (Lo Verme et al., 2005; Sheerin et al., 2004; Franklin et al., 2003;
Conti et al., 2002; Lambert et al., 2002; Rodríguez de Fonseca et al., 2001).
Per altra banda, és interessant que els MCs, a més de ser dianes
farmacològiques de la PEA, també tenen la capacitat de sintetitzar-la (Bisogno et al.,
1997). S’ha demostrat que també els macròfags peritoneals, adipòcits, les cèl·lules
beta pancreàtiques, astròcits, neurones i cèl·lules de la microglia produeixen PEA
(Muccioli i Stella, 2008; Matias et al., 2007; Walter et al., 2002; Stella i Piomelli, 2001;
Schmid et al., 1997; Di Marzo et al., 1994). Per tant, diferents tipus cel·lulars que van
des de cèl·lules immunitàries fins a cèl·lules del sistema nerviós central, produeixen
PEA, suggerint una implicació en diversos processos fisiològics i patològics.
Tot i que s’ha demostrat l’eficàcia clínica de la PEA, no esta del tot clar quin
seria el mecanisme d’acció pel qual actuaria aquest compost (Re et al., 2007).
2.3. Anàleg sintètic: adelmidrol
L’adelmidrol és el derivat de la dietanolamida de l'àcid azelaic, que també es
coneix com a N, N'-bis-(2-hidroxietil)-nonandiamida. L’adelmidrol és un anàleg de la
PEA, i com aquest compost, presenta efectes antiinflamatoris i antinociceptius (KeppelHesselink, 2012; Sasso et al., 2012; Scarampella et al., 2001; Luongo et al., 2011; Costa
et al., 2008; Wise et al., 2008; Re et al., 2007; Lo Verme et al., 2005; Conti et al., 2002).
Aquest compost durant molt de temps ha demostrat ser un tractament tòpic eficaç per
trastorns cutanis inflamatoris en persones (Nazzaro-Porro, 1987), i els seus efectes
antiinflamatoris
i
mecanisme
d'acció
han
estat
recentment
investigats
(Mastrofrancesco et al., 2010).
L’adelmidrol, com membre de la família de les aliamides, té propietats
cannabimimètiques, amb capacitat
de controlar la hiperreactivitat dels MCs en
diverses condicions fisiopatològiques (Cantarella et al., 2011; Esposito et al., 2011; De
Filippis et al., 2009; Re et al., 2007; Mazzari et al., 1996). No obstant , a diferència de la
PEA, que és un producte altament lipòfil, l’adelmidrol és més adequat per l’aplicació
33
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
tòpica perquè exhibeix propietats amfipàtiques, que faciliten una absorció més eficaç,
ja que l‘epidermis està composta per capes lipòfiles i capes hidròfiles, disposades
alternativament. A més, en les últimes dècades, l'ús de la teràpies tòpiques ha
augmentat en la dermatologia veterinària, especialment per a les lesions localitzades
que caracteritzen els estadis inicials de certs desordres d’hipersensibilitat en els
gossos. En aquest tipus de processos al·lèrgics, seria preferible l’ús de teràpies
tòpiques, minimitzant la necessitat de tractaments sistèmics (Olivry et al., 2010;
Rosenkrantz, 2006).
3. Inflamació al·lèrgica: resposta primerenca i tardana
EL terme al·lèrgia va ser encunyat per Clemens von Pirquet l’any 1906 per
referir-se als signes i símptomes de reactivitat (reaccions d’hipersensibilitat) que es
manifestaven en certs individus quan s’exposaven a determinades substàncies.
Malgrat que von Pirquet es referia a la malaltia del sèrum (reacció d’hipersensibilitat
tipus III) (Silverstein, 2000), aquest terme actualment s’utilitza per referir-se a totes
aquelles respostes adaptatives anormals del sistema immune dirigides contra
substancies de l’ambient sense un component infecciós (al·lergen), associades tant a la
producció d’immunoglobulines E (IgEs) com també a l’expansió de limfòcits T específics
per a un determinat al·lergen. Malgrat això, hi ha certs tipus d‘al·lèrgies, com la
dermatitis de contacte, on es postula que les IgE específiques no tindrien un paper tan
important (Galli et al., 2008).
Durant un procés al·lèrgic, després de l’exposició d’un individu sensibilitzat amb
un al·lergen específic, és produeix una resposta inflamatòria. Aquesta és una
característica fisiopatològica important en diversos trastorns com l'asma al·lèrgic, la
dermatitis atòpica (DA) o èczema, la febre del fenc (rinitis al·lèrgica), diverses
manifestacions al·lèrgiques oculars i algunes al·lèrgies alimentàries (Holgate et al.,
1999; Kay, 2001; Eder et al., 2006). En alguns individus, les reaccions al·lèrgiques en
front a al·lèrgens del medi ambient, la dieta o determinats medicaments, poden donar
lloc a reccions potencialment mortals anomenades reaccions anafilàctiques (Kay,
2000).
34
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
L’al·lèrgia és una de les malalties més esteses arreu del món occidental. La
predisposició per desenvolupar de forma espontània determinades reaccions
d’hipersensibilitat al·lèrgica és coneguda com atòpia i està lligada tant a factors
genètics com ambientals (Eder et al., 2006; Lawson i Senthilselvan, 2005). De la
mateixa manera que en els humans, la incidència de reaccions al·lèrgiques espontànies
en els gossos, com per exemple la DA, sembla anar en augment (Nødtvedt et al., 2006).
3.1. Sensibilització
El desenvolupament d’una resposta al·lèrgica requereix el contacte previ de
l’individu amb un determinat al·lergen. En aquest procés, un cop l’al·lergen ha
penetrat dins l’organisme, és reconegut i processat per les cèl·lules presentadores
d’antigen, que en la pell s’anomenen cèl·lules de Langerhans (Wollenberg i Bieber,
2000). Aquestes cèl·lules migren cap als nòduls limfàtics, on presenten l’al·lergen als
limfòcits T, que en presència de l’interleuquina 4 (IL-4) adquireixen les característiques
dels limfòcits TH2. Aquest limfòcits, a través de la producció de les IL-4 i IL-13, i de la
interacció directa amb els limfòcits B dirigeixen la producció i la síntesi de IgEs
específiques per l’al·lergen. Les IgEs produïdes pels limfòcits B, es distribueixen
sistèmicament a través de la circulació limfàtica i sanguínia, de manera que acaben
unint-se als receptors d’alta afinitat de les IgE (FcεRI) dels MCs en els teixits on
resideixen. D’aquesta manera, els MCs es sensibilitzen, i així, en els subsegüents
contactes amb l’al·lergen s’indueix la resposta al·lèrgica (Akdis i Akdis, 2007; Larché et
al., 2006; Geha et al., 2003; Kay, 2001).
3.2. Fase primerenca o aguda
La fase primerenca (EPR) de la reacció al·lèrgica (hipersensibilitat tipus I) es
desenvolupa en els subsegüents contactes amb l’al·lergen. L’al·lergen interacciona
amb les IgEs específiques unides a la membrana dels MCs, provocant l’agregació i
l’entrecreuament dels receptors FcεRI, que en darrera instància indueixen la seva
35
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
activació (Holgate i Church, 1995). Els següents esdeveniments intracel·lulars
indueixen la secreció de diferents mediadors proinflamatoris, tant preformats com de
nova síntesi, que acaben orquestrant la EPR de la reacció al·lèrgica (Williams i Galli,
2000) (Figura 5). Així doncs, els MCs alliberen tres tipus de compostos bioactius
procedents de la degranulació dels grànuls citoplasmàtics (histamina, heparina,
proteoglicans, proteases i algunes citoquines), del metabolisme dels fosfolípids de
membrana (PGDs, leucotriens -LTs- i el factor plaquetari activador de les plaquetes) i
de la transcripció gènica (citoquines, quimiocines i factors de creixement) (Kraft i Kinet,
2007; Rivera i Gilfillan, 2006; Marshall, 2004).
La secreció dels mediadors preformats es produeix quan els grànuls
citoplasmàtics es fusionen amb la membrana plasmàtica en un procés anomenat
degranulació (Dvorak, 2005). Per altra banda, l’activació dels receptors FcεRI presents
a la membrana dels MCs també indueix la síntesi i secreció de PGDs i LTs a través de la
metabolització de l’àcid araquidònic per les vies de la cicloxigenasa i lipoxigenasa
(Boyce, 2007). Aquest dos tipus de mediadors (preformarts i derivats lipídics)
contribueixen al desenvolupament dels signes clínics i dels símptomes aguts de la EPR
de la reacció al·lèrgica (Kay 2001; Galli et al., 2005). Aquests signes i símptomes varien
en funció del teixit on es produeix la resposta, que en la pell inclouen la vasodilatació,
reflectint l’acció dels mediadors sobre les terminals nervioses i donant lloc a la
formació d’eritema, la formació d’edema per el increment de la permeabilitat vascular,
i la pruïja per l’estimulació dels nociceptors dels nervis sensorials perifèrics (Cevikbas
et al., 2007).
3.3. Fase tardana o crònica
La fase tardana (LPR) d’una reacció al·lèrgica es desenvolupa hores després del
contacte amb l’al·lergen i sempre està precedida per la EPR. Els MCs, en resposta a les
IgEs i els al·lergens, alliberen un ampli ventall de citoquines, quimiocines i factors de
creixement de nova síntesi, però aquesta secreció es produeix d’una forma més lenta
que la dels mediadors preformats. Els mediadors de nova síntesi són majoritàriament
els responsables del desenvolupament de la LPR de la reacció inflamatòria amb el
36
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
reclutament cel·lular (Kraft i Kinet, 2007; Gilfillan i Tkaczyk, 2006) (Figura 5). A la pell
les principals manifestacions clíniques de fase tardana són la persistència de l’edema i
l’eritema (vermellor), dolor, escalfor i induració de la regió afectada. Aquests efectes
reflecteixen el procés desenvolupat, on es produeix el reclutament local i l’activació de
cèl·lules inflamatòries (com per exemple limfòcits, eosinòfils, monòcits, neutròfils i
basòfils) i com també la producció persistent de mediadors proinflamatoris per part
dels MCs del teixit (Galli et al., 2008).
En aquesta fase, quan l’estímul al·lergènic persisteix durant el temps, la
inflamació al·lèrgica desenvolupada pot esdevenir crònica (Holgate et al., 1993; Olivry
et al., 1996; Galli, 1997).
Figura 5. Fases de la reacció al·lèrgica cutània (adaptat de De Mora et al.,
2006): antigen (Ag), cèl·lula de Langerhans (LC), mastòcit (MC), limfòcit T
(T), limfòcit B (B), immunoglobulines E (IgEs), resposta primerenca (EPR) i
tardana (LPR) de la inflamació al·lèrgica.
37
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
4. Mastòcits
Els MCs tenen un paper central en el desenvolupament de la resposta
inflamatòria com a cèl·lules immunoreguladores. En el gos, els MCs estan involucrats
en la patogènesis d’una gran varietat de malalties al·lèrgiques de la pell, com la
dermatitis atòpica i l’hipersensibilitat a la picada de puça (Hammerberg et al., 2001;
von Ruedorffer et al., 2003).
Els MCs van ser identificats per primera vegada al finals del segle XIX, pel Dr.
von Recklinghausen (von Recklinghausen, 1863) i Paul Ehrlich (Ehrlich, 1877) a través
de tècniques bàsiques de tinció, gràcies a l’observació microscòpica dels seus
nombrosos grànuls citoplasmàtics. Però va ser Ehrlich qui va encunyar el terme
“Mastzellen” (en alemany Mast fa referència al “engreix del bestiar”), ja que segons
ell, aquest grànuls tenien la funció de nodrir el teixit circumdant. Posteriorment, amb
el descobriment dels mecanismes que provoquen la seva activació i l’alliberació de
mediadors cel·lulars, van ser considerades cèl·lules crítiques en la patogènia dels
processos d’hipersensibilitat tipus I (Galli, 1993).
Els MCs deriven de diferents cèl·lules precursores de la medul·la òssia i altres
teixits hematopoiètics. Algunes cèl·lules d’aquest llinatge es troben en circulació en
forma de progenitors immadurs i s’estableixen en els teixits perifèrics on acaben de
madurar sota la influència del microambient local, a través de diverses citoquines com
per exemple el factor de cèl·lules mare (SCF) (Chen et al., 2005; Kitamura i Ito, 2005). A
més, els MCs són cèl·lules que presenten un llarg període vital, de manera que poden
tornar a entrar en un cicle cel·lular i proliferar després de rebre els estímuls concrets.
Per altra banda, també poden incrementar el seu número de forma local, ja sigui per
un increment en la proliferació, el reclutament cel·lular i/o maduració (Galli i Tsai,
2010).
En els vertebrats, els MCs estan distribuïts àmpliament en teixits vascularitzats,
sobretot en zones exposades a l’ambient, per sota dels epitelis, formant part del teixit
connectiu, com per exemple a la pell, a les vies respiratòries i al tracte digestiu (Galli et
al., 2005). No obstant això, també es poden trobar MCs als nòduls limfàtics, al cor,
vasos sanguinis i a la uretra (Kube et al., 1998).
38
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
En el gos, el nombre de MCs està altament correlacionat amb els nivells de
triptasa als teixitis, així doncs, els nivells més alts s’han trobat als intestins, encara que
també s’han trobat MCs a la pell (Becker et al., 1985), vies respiratòries (Peeters et al.,
2005; Su et al., 1993), a la medul·la òssia on s’originen (Bookbinder et al., 1992; Shull
et al., 1992), al tracte gastrointestinal (Szabó et al., 1997; Soll et al., 1988), als testicles
(Auchampach et al., 1997; Ennis et al., 1989), al cor (Frangogiannis et al., 1998), al
cervell (Matsumoto et al., 2001) i al fetge (Morimoto et al., 1998). A la pell, els MCs es
troben majoritàriament al voltant de les vènules i en la unió dermo-epidèrmica, a prop
de la base dels fol·licles pilosos i en la dermis més profunda, al voltant dels vasos
sanguinis (Kube et al., 1998; Becker et al., 1985).
La població de MCs en humans, rates i ratolins, compren diferents
subpoblacions i un alt grau d’heterogeneïtat. També en el gos podem trobar aquestes
característiques (De Mora et al, 2006). Així doncs, les tincions metacromàtiques
basades en la sensibilitat dels MCs a la formalina, han revelat que en el gos hi ha dos
subpoblacions de MCs, els MCs del teixit connectiu i els MCs de la mucosa (Becker et
al., 1985; Osborne et al., 1989). Per altra banda, en funció del contingut en proteases
s’han establit 3 poblacions diferents: MCs que només contenen quimasa, MCs que
només contenen triptasa i MCs que contenen quimasa i triptasa (Noviana et al., 2004).
Així doncs, donat que els MCs poden madurar a diferents teixits, la heterogeneïtat dels
MCs podria ser conseqüència del microambient tissular que dirigeix l’expressió gènica i
per tant el seu fenotip. Malgrat tot, sembla que la heterogeneïtat dels MCs és molt
més elevada que la corresponent a les diferents subpoblacions descrites, ja que s’ha
suggerit que el fenotip dels MCs podria canviar de forma dinàmica en funció de les
condicions del microambient (nivell de citoquines, hormones, interaccions amb altres
cèl·lules, etc.) (Moon et al., 2009).
4.1. Funcions dels mastòcits
Durant gran part del segle XX, la implicació dels MCs en el desenvolupament dels
trastorns al·lèrgics mediats per IgE, va ser l’única funció coneguda, encara que
semblava improbable que l’evolució seleccionés els MCs per respondre únicament
39
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
contra antígens externs. Ara sabem que els MCs també estan implicats en altres
processos fisiològics (Moon et al., 2009).
i)
Al·lèrgia: com anteriorment s’ha vist, els MCs són les principals cèl·lules
efectores en les reaccions al·lèrgiques inflamatòries d’hipersensibilitat tipus I.
Aquestes reaccions es desencadenen principalment per la unió dels antígens a
les IgEs lligades als MCs a través del receptor FcεRI, provocant l’alliberació de
diferents mediadors. Cal dir també que el control de l’activació dels MCs a
través del antigen-IgE-FcεRI no és l’única via, sinó que també hi ha altres
mecanismes reguladors. Per exemple, s’ha observat que el sistema nerviós
central i el sistema nerviós perifèric poden modular les reaccions al·lèrgiques
(Hakim-Rad et al., 2009). Una via moduladora alternativa és l’activació del
receptor ST2 a través de la IL-33, que pot activar els MCs en absència dels
antígens, però necessita que els MCs estiguin sensibilitzats amb IgEs. A més,
aquesta via produeix una exacerbació de l’activació dels MCs en presència de
l’antigen i s’ha observat un increment dels nivells de IL-33 en pacients amb DA
(Pushparaj et al., 2009).
ii)
Homeòstasi: els MCs contribueixen al manteniment i regulació de diversos
processos fisiològics. En primer lloc, s’ha observat que els MCs participen en les
diferents fases de la cicatrització de les ferides (inflamació, proliferació i
remodelació) secretant diferents factors com l’heparina, la triptasa, la quimasa,
el factor de creixement fibroblàstic, el factor de creixement de l’endoteli
vascular, el factor de creixement derivat de les plaquetes, el factor de
creixement neuronal, que indueixen la formació de nous vasos sanguinis i la
proliferació de cèl·lules epitelials i fibroblasts (Rao i Brown, 2008; Weller et al.,
2006; Egozi et al., 2003; Maurer et al., 2003; Noli i Miolo, 2001; Muramatsu et
al., 2000; Blair et al., 1997, Azizkha, et al. 1980). A més, els mediadors dels MCs
també influencien el flux sanguini i la permeabilitat vascular, la secreció de
diverses glàndules. Per altra banda, els MCs a través de la histamina, el factor
de necrosi tumoral alfa (TNFα) i la substancia P, també estarien implicats en el
cicle del fol·licle pilós (Maurer et al., 2003; Cindik et al., 2000; Maurer et al.,
1997). Una altra funció dels MCs és la contribució a la remodelació del teixit
40
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
ossi (Nagasaka et al., 2008; Chiappetta i Gruber, 2006). Finalment, s’ha
observat que els MCs, sorprenentment, també actuen limitant la inflamació
al·lèrgica a través de la secreció de IL-10 (Grimbaldeston et al., 2007).
iii)
Immunitat innata i adquirida: a més del paper que els MCs desenvolupen en
l’al·lèrgia i l’homeòstasi, els MCs també són en gran mesura responsables del
sistema immunològic innat i de la defensa de l’organisme en front patògens
(virus, bacteris, fongs, paràsits), ja que es distribueixen i localitzen en la primera
línia de defensa. Diferents patògens, i així com també alguns dels seus
productes, poden activar els MCs a través de diferents receptors com per
exemple els receptors Toll-like, el receptor del complement, i els FcεRI
(Marshall, 2004). Així doncs, un cop activats els MCs, els diferents mediadors
que alliberen contribueixen en el reclutament de les cèl·lules efectores com els
neutròfils que inicien el procés d’eliminació dels patògens. Els MCs també
dirigeixen el desenvolupament de les respostes de la immunitat adquirida, a
través de l’activació de les cèl·lules dendrítiques i les cèl·lules T, i de la seva
migració cap als nòduls limfàtics (Galli et al., 2008). A més a més, hi ha certes
evidències que proposen que els MCs també serien capaços de ser cèl·lules
presentadores d’antigen per vies directes o indirectes (Kambayashi et al., 2009;
Gaudenzio et al., 2009; Kambayashi et al., 2008).
4.2. Els mastòcits i la dermatitis atòpica en el gos
La DA és la malaltia inflamatòria crònica de la pell més comuna en el gos.
S’estima que afecta al 15% de la població i en més del 27% del casos, esta associada a
pruïja (Hillier i Griffin, 2001). L'etiologia d'aquesta malaltia no està completament
compresa, però està acceptat que és multifactorial i es manifesta per complexes
interaccions entre factors genètics i ambientals, incloent canvis en la barrera
epidèrmica i del sistema immunitari innat i adaptatiu. Aquest trastorn majoritàriament
s’associa a una reacció d’hipersensibilitat tipus I dirigida per IgEs en front a al·lèrgens
específics (Halliwell, 2006), encara que hi ha certs casos on no s’observa una associació
amb les IgEs.
41
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
La DA en el gos és molt similar a la seva homòloga humana. Clínicament, pel
que fa referència al tipus i distribució de les lesions, consisteixen en màcules
eritematoses, un eritema generalitzat i vesícules petites i supurants en les primeres
fases, que afecten principalment les regions de la cara i on la pell presenta plecs. Tant
en els homes com en els gossos aquest trastorn es caracteritza per una predisposició
genètica, una edat primerenca d’aparició, dermatitis i pruïja, nivells elevats d’IgEs als
al·lèrgens ambientals i una predisposició a les infeccions secundàries recurrents amb
bacteris i llevats (DeBoer i Marsella, 2001; Griffin i DeBoer, 2001).
En l'actualitat, hi ha dues hipòtesis per explicar la patogènia d'aquesta malaltia,
que probablement són complementàries: (I) hi ha un defecte primari que produeix una
desregulació del sistema immunològic que causa una sensibilització i inflamació davant
al·lèrgens ambientals mitjançada per IgEs. (II) existeix un defecte intrínsec en la pell
(probablement els individus estan genèticament predisposats) que pertorba la funció
de barrera de la pell i que permet la penetració dels al·lèrgens i patògens (Kawakami et
al., 2009; Elias i Schmuth, 2009).
En la DA es desencadena una resposta aberrant del sistema immunitari que
condueix a un increment inapropiat en la producció de IgEs específiques pels
al·lèrgens. Aquestes IgEs s’uneixen als seus receptors en els MCs de la dermis i en les
subsegüents exposicions a l’al·lergen indueixen la degranulació dels diferents
mediadors, com per exemple la histamina, responsables dels signes clínics de la DA. A
més, en el gos també s’ha observat una hiperplàsia de les cèl·lules de Lagnerhans,
responsables de la presentació de l’antigen (Olivry et al., 1996 i 1997).
La resposta humoral normal més comuna del sistema immunològic davant
l’exposició a la majoria d’antígens estranys és la producció de IgGs més que no pas
IgEs, i ve determinada pel tipus de limfòcits T-helper (TH1 o TH2), predominants.
L’activació i predomini dels limfòcit TH1 o TH2 comporta un predomini de les IgGs o
IgEs, respectivament. Aquests dos tipus de respostes es caracteritzen per diferents
perfils de citoquines alliberades després de l’activació dels limfòcits (Tizard, 2000) i en
la DA canina s’ha observat un resposta predominant tipus TH2 (Nuttall et al., 2002). Els
42
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
factors que determinen els tipus de resposta predominant són complexes i inclouen
influències genètiques i ambientals.
Els MCs exerceixen varies funcions en la DA ja que són les principals cèl·lules
efectores durant la EPR i la LPR de la reacció inflamatòria i tenen un paper important
en el procés de sensibilització i la inflamació crònica. En aquest trastorn s’ha observat
que el número de MCs es troba incrementat i que aquests són hiperreactius (Olivry et
al., 1997). Doncs, l’activació dels MCs desencadena l’alliberació d’una gran quantitat
de mediadors proinflamatoris tant preformats com de nova síntesi, entre els que
s’inclouen la histamina, els LTs, les PGDs, la triptasa, la quimasa, a més de molts altres.
Així doncs, els MCs tenen un paper essencial en el desenvolupament de la pruïja a
través de mediadors com la histamina, la triptasa, les IL-6 i IL-8 i el GMCSF. En aquest
sentit, l’associació dels MCs amb les terminacions nervioses té un paper clau en el
desenvolupament de la pruïja, ja que aquestes terminacions es poden activar a través
de neuropèptids presents en els MCs, com per exemple la substància P i la
neuroquinina A que activen el receptor activat per proteinasa PAR-2 de les
terminacions. L’expressió d’aquest receptors es troba incrementada en al DA, així com
també els nivells de triptasa, que en darrera instancia és la responsable de l’alliberació
de la substancia P i neuroquinina A (Kawakami et al., 2009). L’estrès pot agreujar
també la pruïja a través de l’amplificació de la inflamació mitjançada pels limfòcits T
(Elenkov, 2002).
Els MCs també poden contribuir a la fase de sensibilització als al·lèrgens,
modulant les funcions de la barrera epidèrmica o interaccionant amb les cèl·lules de
Langerhans. A més, les infeccions secundàries en la pell dels gossos amb DA i entre les
que majoritàriament trobem el Staphylococus i la Malassezia, són cofactors importants
en la patogènia de la DA i en la hiperreactivitat dels MCs (DeBoer i Marsella, 2001).
Finalment, els MCs també alliberen una gran quantitat de citoquines,
responsables del reclutament cel·lular en la LPR, que s’inicia a les 6-12h després de
l’activació dels MCs. L’infiltrat cel·lular inflamatori pot persistir durant dies (Olivry et
al., 2001). La LPR manté la pell inflamada més enllà de l’activació dels MCs contribuint
a canvis inflamatoris crònics en la pell dels pacients amb DA (DeBoer, 2004).
43
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
4.3. Els mastòcits com a diana terapèutica
Donat el paper essencial dels MCs en l’al·lèrgia i altres malalties inflamatòries,
s’han desenvolupat diferents estratègies terapèutiques per modular o inhibir les
funcions dels MCs o bé les accions desenvolupades pels seus mediadors alliberats
(Moon et al., 2009):
i)
inhibidors del desenvolupament i supervivència dels MCs: es pensa que els
esteroides no tenen efectes directes sobre l’alliberació de mediadors, sinó
que actuarien induint l’apoptosi, el reclutament, la diferenciació, modificant
el fenotip, o reduint el número de MCs en el teixit (Smith et al., 2002;
Johnson, 1998; Fuller et al., 1995; Irani et al., 1995; Pipkorn et al., 1989;
King et al., 1985).
ii)
inhibidors i antagonistes dels mediadors dels MCs: aquests fàrmacs
inhibeixen l’activació de diferents tipus cel·lulars amb receptors pels
mediadors alliberats pels MCs com la histamina, la PGD2, o els LTs. Els
principals fàrmacs d’aquest grup són els antihistamínics clàssics,
antagonistes del receptor H1 de la histamina (Akdis et al., 2008); els
antagonistes del receptor CysLT1, receptor dels LTs (Kanaoka and Boyce,
2004); els antagonistes del receptor CRTh2, receptor de la PGD2 (Ishizuka et
al., 2004), que indueix la migració i activació dels eosinòfils, basòfils i
cèl·lules Th2, i que contribueix a la LPR i al dany cel·lular (Hirai et al., 2001); i
per últim els anticossos contra el TNFα (Wallis, 2008; Pache et al., 2009),
malgrat que els MCs probablement no són la única font TNFα en
nombrosos processos inflamatoris.
iii)
inhibidors de la síntesis dels mediadors dels MCs: els fàrmacs
antiinflamatoris no esteroïdals tenen efectes antiinflamatoris, antipirètics i
analgèsics. Malgrat que es suposa que actuen inhibint la síntesis d’alguns
dels mediadors dels MCs, com per exemple les PGDs, probablement aquest
no és el seu principal mecanisme d’acció (Moon et al., 2009).
iv)
inhibidors de l’activació del mastòcit o de l’alliberació de mediadors: dins
aquest grup de fàrmacs trobem el cromoglicat disòdic, molt utilitzat en el
passat com a estabilitzador dels MCs (Patalano i Ruggieri, 1989), encara que
44
REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA
també actuaria sobre eosinòfils i neutròfils (Moqbel et al., 1986) i que no és
efectiu per tots els fenotips de MCs (Befus et al., 1987; Pearce et al.,1982);
la sulfasalazina malgrat que no es coneix molt el seu mecanisme d’acció,
s’ha observat que inhibeix la secreció dels MCs (Bissonnette and Befus,
1997); l’Omalizumab, un anticòs monoclonal que s’uneix al domini Fc de la
IgE, prevenint l’activació del MC i reduint els nivells de IgE circulants
(Milgrom et al., 1999); l’Imatinib, un inhibidor del receptor SCF dels MCs
(Hungness i Akin, 2007); inhibidors de la calcineurina (ciclosporina,
tacrolimus, pimecrloimus) que actuen inhibint l’alliberació de mediadors
dels MCs (Kovalik et al., 2012; Grassberger et al., 2004; Liu et al., 1991); per
últim trobem la PEA, un endocannabinoide que modularia l’activació dels
MCs i inhibiria l’alliberament de mediadors. Explicar el mecanisme d’acció
de la PEA serà un dels objectius d’aquesta tesi doctoral.
45
46
III. HIPÒTESI I OBJECTIUS
47
48
HIPÒTESI I OBJECTIUS
III. HIPÒTESI I OBJECTIUS
Els antecedents bibliogràfics anteriorment exposats ens permeten formular la següent
hipòtesi general:
“L’efecte antiinflamatori dels cannabinoides podria ser el resultat, almenys en part,
de la seva acció inhibitòria sobre la degranulació dels mastòcits. Per tant, els
cannabinoides i els seus anàlegs sintètics podrien ser un bon tractament dels
processos al·lèrgics de la pell en el gos.”
A continuació s’exposen les hipòtesis específiques per cada un dels diferents estudis
així com també els objectius marcats per tal de verificar-les.
Hipòtesi 1:
La PEA inhibeix la degranulació dels MCs canins immunològicament induïts.
Objectiu 1.1
•
determinar els efectes de diferents concentracions de PEA sobre la resposta
secretora (alliberament d’histamina, PGD2 i TNFα) dels mastòcits aïllats de
la pell de gos i estimulats amb anti-IgE canina.
Hipòtesi 2:
La PEA administrada a una dosis única a gossos Beagle espontàniament
hipersensibles a Ascaris suum pot reduir la resposta inflamatòria cutània
desenvolupada després de la injecció intradèrmica de diferents estímuls
immunològics i no immunològics (anti-IgE canina, antigen i substancia P).
49
HIPÒTESI I OBJECTIUS
Objectiu 2.1
•
estudiar l’efecte modulador del PEA, administrada per via oral, sobre la
resposta inflamatòria induïda per diferents estímuls immunològics i no
immunològics en un model d’al·lèrgia cutània en gossos Beagle conscients.
Hipòtesi 3:
L’aplicació crònica d’adelmidrol pot reduir tant la resposta inflamatòria
primerenca com la tardana induïda per la injecció intradèrmica de l’antigen en
gossos Beagle espontàniament hipersensibles a Ascaris suum.
Objectiu 3.1
•
avaluar l’efecte modulador de l’adelmidrol (anàleg sintètic de la PEA)
administrat tòpicament, sobre la resposta inflamatòria primerenca induïda
per antigen en gossos hipersensibles.
Objectiu 3.2
•
avaluar l’efecte de l’adelmidrol administrat tòpicament sobre la resposta
inflamatòria tardana, caracteritzant l’infiltrat cel·lular en la pell dels gossos
24 h desprès de la injecció intradèrmica d’antigen.
50
IV. CAPÍTOLS
51
52
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1:
Effects of palmitoyethanolamide on immunologically
induced histamine, PGD2 and TNF alpha release from
canine skin mast cells.
Santiago Cerrato, Pilar Brazís, Maria Federica della Valle, Alda Miolo and
Anna Puigdemont.
Veterinary Immunology and Immunopathology 133, 9-15 (2010).
53
54
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
1. Effects of palmitoyethanolamide on immunologically induced histamine, PGD2 and
TNF alpha release from canine skin mast cells.
1.1. Abstract
Palmitoylethanolamide (PEA) is an endocannabinoid-like compound and the
parent molecule of the aliamide family, a group of fatty acid amides able to act
through the downregulation of mast cell (MC) degranulation. PEA has been proven to
exert both analgesic and anti-inflammatory activity, and recent studies have shown its
ability in reducing clinical symptoms of inflammatory skin diseases, both in humans
and in animals. Although its pharmacological efficacy is well known, the mechanism of
action of this family of compounds is still unclear. To better understand the cellular
effects of aliamides in dogs, canine MCs freshly isolated from skin biopsies were
incubated with IgE-rich serum and were challenged with anti-canine IgE. Histamine,
prostaglandin D2 (PGD2) and tumour necrosis factor-alpha (TNFα) release was
measured in the presence and absence of increasing concentrations of PEA, ranging
from 10-8 M to 10-5 M. Histamine, PGD2 and TNFα release, immunologically induced by
canine anti-IgE, were significantly inhibited in the presence of PEA. The maximum
inhibitory effect on histamine release was observed at 3 x 10-6 M PEA concentration
achieving an inhibition of 54.3 ± 5.2%. PGD2 release was significantly inhibited at 10-5
M and 10-6 M PEA oncentrations with 25.5 ± 10.2% and 14.6 ± 5.6% of inhibition,
respectively. Finally, PEA inhibited TNFα release to 29.2 ± 2.0% and 22.1 ± 7.2%, at
concentrations of 10-5 M and 3 x 10-6 M, respectively. The results obtained in the
present study showed the ability of the aliamide PEA to down-modulate skin MC
activation. Therefore, our findings suggest that the beneficial effect of PEA, observed
in inflammation and pain clinical studies, could be due, at least in part, to its ability to
inhibit the release of both preformed and newly synthesised MC mediators.
1.2. Introduction
The function of MCs has been widely studied and their central role as
immunoregulatory cells, in allergic and non-allergic reactions, is well known (De Mora
55
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
et al., 2006). Cutaneous MC hyper-releasability has been involved in the pathogenesis
of a vast array of canine skin diseases, like atopic dermatitis (Hammemberg et al.,
2001) and flea bite hypersensitivity (von Ruedorffer et al., 2003; Wuersch et al., 2006).
MC contains granule-associated preformed mediators that can be rapidly released
after cell activation, together with newly synthesised compounds like lipid-derived
eicosanoids and cytokines. Histamine plays a central role in the early phase of the
inflammatory processes; moreover, other inflammatory mediators like prostaglandins
(PG), leukotrienes (LT) or cytokines like TNFα present a slower release and a more
relevant role in the late phase reactions. These bioactive substances contribute to the
initial symptoms of atopic or allergic diseases and induce the transcription of
inflammatory cytokines and chemokines, which are in part responsible for the late
phase reaction associated with an inflammatory process that can become chronic
(Galli, 1997; Holgate et al., 1993).
In the last years, pharmaceutical research has been focused on the inhibition of
MC degranulation to control allergic and inflammatory processes. Aliamides (autocoid
local injury antagonist amides) and endocannabinoids are considered as an emerging
class of regulators of MC behaviour (De Filippis et al., 2008; Aloe et al., 1993).
Palmitoylethanolamide (PEA) is an endocannabinoid-like compound isolated from
mammalian and vegetable tissues that is considered to be the parent molecule of the
aliamide family (Lambert et al., 2002; Jack, 1996). PEA levels increase in inflamed
tissues, particularly the skin (Petrosino et al., 2008a, b), and accumulating evidence
suggests that this response serves to reduce the severity of signs and symptoms or
even to oppose disease progression, supporting the hypothesis of an ‘‘autoprotective’’
role of PEA (Di Marzo, 2006; Darmani et al., 2005). Moreover, PEA has been repeatedly
shown to suppress inflammatory hyperalgesia and oedema in a wide range of animal
models (Costa et al., 2008; Wise et al., 2008; D’Agostino et al., 2007; Iuvone et al.,
2007). In human pilot studies, PEA has been proved to reduce the clinical symptoms of
atopic dermatitis in children (Pulvirenti et al., 2007) and atopic eczema in adults
(Eberlein et al., 2008). Regarding companion animals, a clinical study in cats with
eosinophilic granuloma and eosinophilic plaque showed that one-month treatment
with PEA resulted in a clinical improvement of signs and lesions (Scarampella et al.
56
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
2001). Moreover, a 7 day treatment with PEA was able to delay but not to prevent
development of clinical signs in an experimental model of canine atopic dermatitis
(Marsella et al., 2005).
Despite its proven clinical efficacy, the mechanism of action of PEA is still
debated (Re et al., 2007). The main objective of the present study was to assess the
potential ability of PEA to modulate the histamine, PGD2 and TNFα release induced by
anti-canine IgE in sensitized canine skin MCs.
1.3. Material and methods
1.3.1. Reagents
PEA was purchased from Innovet (Milano, Italy). Hyaluronidase (type I-S),
protease (pronase E, type XIV), DNase (type I) and bovine albumin (Cohn fraction V)
were purchased from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). Bacterial collagenase (type
I), A23187 calcium ionophore, MEM, phosphate saline buffers and penicillin–
streptomycin were purchased from Gibco (Rockville, MD, USA). Polyclonal goat anticanine IgE was purchased from Bethyl Laboratories (Montgomery, TX, USA).
Recombinant canine stem cell factor (SCF) was purchased from RD Systems
(Minneapolis, MN, USA).
1.3.2. PEA dissolution
PEA was stored as stock solution in ethanol (10-2 M) and was serially diluted in
PBS with Ca2+ 0.9 mM and Mg2+ 0.49 mM (PBS+/+) to the desired concentrations for
dose–response experiments. The final concentration of ethanol contained in the
highest concentration of PEA tested was lower than 0.7% (v/v).
57
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
1.3.3. Isolation and culture of canine skin MCs
Skin biopsies were obtained from the abdominal area of 18 dogs euthanized in
the Clinical Veterinary Hospital of the Universitat Autònoma de Barcelona. Cutaneous
cells were isolated by a procedure developed in our laboratory (Brazis et al., 2002).
Briefly, skin samples were chopped into 0.5–1 mm3 fragments, after removal of the
subcutaneous fat tissue. The skin fragments were washed twice by centrifugation (400
rcf, 10 min) and then were enzymatically digested for 180 min in 15 mL of Eagle’s
minimum essential medium (MEM) per gram of skin containing 22.3 mg of bacterial
collagenase, 18 mg of hyaluronidase, 12 mg of protease and 1.5 mg of DNAse
supplemented with bovine albumin and antibiotics. After digestion, the cutaneous cells
were filtered, washed once with MEM and twice in phosphate buffered saline without
Ca2+ and Mg2+ (PBS-/-). MCs were counted by staining with Kimura’s methachromatic
stain (Kimura et al., 1979). Cells were stimulated either immediately after the digestion
process (histamine and PGD2) or after 4 days (TNFα) of culturing with exogenous SCF (6
ng/mL).
1.3.4. Sensitization and activation of cutaneous MCs
Before stimulation, cells were sensitized in MEM (37 °C, 2 h) containing a 10%
of IgE-rich serum from atopic or Ascaris suum-sensitive dogs to achieve maximal
occupancy of IgE receptors in MC membrane. MCs were washed twice in PBS-/- and
resuspended in PBS+/+. Then, the cell suspension was distributed in aliquots at a
concentration 7.5 x 104 MC/mL for histamine and PGD2 experiments and 2 x 105
MC/mL for TNFα determination. Prior to stimulation cells were incubated for 15 min at
37 °C with PEA at decreasing concentrations (10-5 M, 10-6 M, 10-7 M and 10-8 M).
Activation was performed in duplicate by incubating the cells with 1 mg/mL of anticanine IgE during 15 min (for histamine and PGD2) and 4 h (for TNFα) at 37 °C. Then,
activation was stopped at 0 °C and samples were centrifuged at 836 rcf, 10 min at 4 °C
to separate cell pellet and supernatant. As positive control, cells were incubated with 1
mM of A23187 calcium ionophore and 1 mg/mL of anti-canine IgE, in the absence of
PEA, for 15 min at 37 °C. And as negative control, PBS was used as stimulus.
58
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
Total histamine per MC was calculated by measuring the histamine content
remaining in the pellet of negative control, after centrifuging.
To determine the potential cytotoxicity of PEA in ethanol, cells were incubated
at the same time periods with increasing concentrations of PEA in ethanol. Negative
control was performed with PBS+/+. Cell viability was assessed by trypan blue dye.
Control tubes containing 0.7% of ethanol alone were tested in all the
experiments.
1.3.5. Determination of histamine release from canine skin MCs
Histamine concentration was assessed with a commercially competitive ELISA
kit (Immunotech, Marseille, France). Briefly, supernatants from samples and standards
were acylated and added to labelled histamine-specific antibody coated wells.
Concomitantly, histamine–alkaline phosphatase was added to compete for the limiting
number of antibody binding sites. The bound enzymatic activity was then measured by
the addition of a chromogenic substance and colour was read at 405 nm. Histamine
release was expressed as the net result of subtracting spontaneously released
histamine from the histamine secreted after stimulation with either, canine anti-IgE
antigen or A23187 calcium ionophore.
1.3.6. Determination of PGD2 release from canine skin MCs
To study PGD2, a commercially available ELISA test cross-reacting with canine
PGD2 was used (Gueck et al., 2002). Supernatants were collected and immediately
stored at -80 °C until they were measured with a PGD2 acetylcholinesterase (AChE)
enzyme immunoassay (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). This assay
was based on the competition between PGD2 and PGD2–AChE conjugate for a limited
number of PGD2 monoclonal antibody binding sites. The product of the enzymatic
reaction was read at 405 nm.
59
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
1.3.7. Determination of TNFα release from canine skin MCs
TNFα was measured using an ELISA kit (R&D Systems,Minneapolis, MN, USA).
Samples were pipetted into wells coated with a monoclonal antibody specific for TNFα.
TNFα antigen and a biotinylated monoclonal antibody specific for TNFα were
incubated simultaneously. After washing, the enzyme (streptavidin–peroxydase) was
added.
After
incubation
a
substrate
solution
(hydrogen
peroxide
and
tetramethylbenzidine) was added to induce a coloured reaction product that was read
at 450 nm.
1.3.8. Statistical analyses
The results were expressed as mean ± standard error (mean ± SEM) of six
experiments. Differences between means of PEA treatment and anti-canine IgE control
were tested for significance by Student’s t-test for paired data at a level of significance
of 0.05.
Percentage of inhibition (I%) of different cellular mediator was calculated as
follows:
I%
mediator control mediator treatment
mediator control
100
where mediator control was the mediator (histamine, PGD2 or TNFα) released
in the absence of drug treatment, and mediator treatment was the mediator released
in the presence of PEA.
1.4. Results
1.4.1. Effects of ethanol and PEA on cellular viability
The number of canine cutaneous MCs yielded per gram of skin represented 3%
of the total cutaneous cells (Fig.1). Ethanol was selected as PEA solvent. Cells were
60
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
incubated in the presence of different dilutions of ethanol in PBS, either with or
without PEA. A good viability was observed with ethanol dilutions, under 0.7% of
ethanol (96.1 ± 2.0%). When PEA was added, the viability was also acceptable (94.0 ±
1.9%). However, it is well known that organic solvents can also affect MC
degranulation at very low concentrations. The effects of different dilutions of ethanol
on histamine release from canine MCs were tested. The more concentrated ethanol
dilution (0.7%) used in PEA 10-5 M concentration induced a histamine release of 10%.
However, the 0.07% dilution of ethanol (used in PEA 10-6 M) did not cause significant
histamine release.
Figure 1. Freshly isolated MCs obtained from dog skin (arrows). (a) 100x scale bar: 100 µM and
(b) 400x scale bar: 25 µM.
61
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
1.4.2. Effects of PEA on anti-IgE-induced histamine release
The mean total histamine content was 4.82 ± 0.45 pg/MC. Spontaneous
histamine release measured in dispersed skin cells in the absence of any stimulus was
less than 7% in all the experiments.
Regarding positive controls the maximum histamine release achieved was
29.3% for A23187 (1 mM) and 19.1% for anti-canine IgE (1 mg/mL) stimulation. Figure
2 shows the inhibitory effects of PEA on anti-IgE induced histamine release from
isolated canine skin MCs in a concentration-dependent manner. The maximum
inhibitory effect was observed at the PEA 3 x 10-6 M concentration achieving an
inhibition of 54.3 ± 5.2%.
At the PEA 10-5 M concentration, the histamine released induced by ethanol did
not allow to observe the inhibitory effects of PEA.
Histamine release inhibition
(% of anti-IgE control)
100
80
*
**
60
*
**
**
40
20
*
0
10-8
10-7
10-6
[PEA] (M)
Figure 2. Histamine release inhibition induced by increasing PEA concentrations in freshly
dispersed skin MCs after a 15 min challenge with anti-IgE (n = 6). *P < 0.05 and **P < 0.01 by
comparison with PEA treatment to anti-IgE control.
62
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
1.4.3. Effects of PEA on anti-IgE-induced PGD2 release
Anti-canine IgE induced the synthesis and release of PGD2 (6.9 x 10-2 pg/MC)
from sensitized skin MCs. The inhibitory effects of PEA on PGD2 synthesis and release
are shown in Fig. 3, as is observed, a dose–response curve was obtained when cells
were incubated with increasing concentrations of PEA. At the higher PEA
concentrations (10-5 M and 10-6 M), significant results were observed, with 25.5 ±
10.2% and 14.6 ± 5.6% of inhibition, respectively.
100
PGD2 release inhibition
(% of anti-IgE control)
80
60
40
**
20
*
0
10-8
10-7
10-6
10-5
[PEA] (M)
Figure 3. PGD2 release inhibition induced by increasing PEA concentrations in freshly dispersed
skin MCs after a 15 min challenge with anti-IgE (n = 6). *P < 0.05 and **P < 0.01 by comparison
with PEA treatment to anti-IgE control.
1.4.4. Effects of PEA on anti-IgE-induced TNFα release
Freshly isolated and cultured canine MCs were also tested for their ability to
synthesise and release TNFα. MCs freshly isolated and stimulated with anti-IgE under
63
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
the same stimulation conditions described for other mediators, released very low
levels of TNFα (4–5 pg/mL) and the inhibitory effects of PEA were not observed.
However, when MCs were cultured for 4 days in the presence of exogenous SCF, 18.8 ±
1.8 pg/mL of TNFα was produced after 4 h of stimulation with anti-IgE.
The production of TNFα in these cells was four times higher in comparison with
cytokine production in MCs non-cultured in a supplemented medium.
Figure 4 shows the inhibitory effects of PEA on TNFα release. As observed, PEA
inhibited TNFα secretion in a concentration-dependent manner, with an inhibitory
effect of 22.1 ± 7.2% and 29.2 ± 2.0% at 10-5 M and 10-6 M PEA concentrations,
respectively.
TNF-alpha release inhibition
(% of anti-IgE control)
100
80
60
*
40
**
20
0
10-7
10-6
10-5
[PEA] (M)
Figure 4. TNFα release inhibition induced by increasing concentrations of PEA in skin MCs after
4 days of culture with exogenous SCF and after a 4 h challenge with anti-IgE (n = 6). *P < 0.05
and **P < 0.01 by comparison with PEA treatment to anti-IgE control.
64
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
1.5. Discussion
In the present study, freshly isolated canine skin MCs were used, for the first
time, to evaluate the PEA effect on the release of preformed and newly synthesised
mediators. Histamine, PGD2 and TNFα release, immunologically induced by anti-canine
IgE, were significantly and dose–dependently inhibited in the presence of 10-5 M and
10-6 M concentrations of PEA. The results strongly support the hypothesis that the
effects of PEA, described in clinical studies in humans and companion animals, are
exerted, at least in part, through the modulation of MC degranulation.
Several studies have discussed the mechanism of action of PEA and different
hypotheses have been postulated to explain the in vivo anti-inflammatory and antinociceptive effects of this aliamide (Re et al., 2007). The original hypothesis suggests
the existence of an autacoid local injury antagonism (ALIA) process, through which PEA
down-modulates MC degranulation (Mazzari et al., 1996; Facci et al., 1995; Aloe et al.,
1993). Although recent evidence seems to corroborate this hypothesis (Costa et al.,
2008; Iuvone et al., 2007; Scarampella et al., 2001), different studies argued that PEA
does not affect the function of MCs (Jonsson et al., 2006; Stempelj et al., 2006; Lau and
Chow, 2003; Granberg et al., 2001). Another hypothesis on the mechanism of action of
PEA suggests a direct agonism on cannabinoid receptors (Farquhar-Smith and Rice,
2003; Conti et al., 2002; Calignano et al., 2001). However, PEA exhibits poor affinity for
the traditional cannabinoid receptors (Lo Verme et al., 2005; De Petrocellis et al., 2002;
Griffin et al., 2000; Showalter et al., 1996). In order to explain some of the apparent
discrepancies between in vitro and in vivo data on PEA action, a further hypothesis was
proposed, i.e., the ‘‘entourage effect’’ (Lambert and Di Marzo, 1999; Ben-Shabat et al.,
1998). According to this hypothesis, PEA acts by enhancing the anti-inflammatory and
anti-nociceptive actions of endogenous compounds, able to activate cannabinoid
receptors (CB1 and CB2) or the transient receptor potential vanilloid receptor type 1
(TRPV1) channel. This hypothesis is corroborated by recent evidence indicating that
CB1 and TRPV1 receptors mediate the PEA-induced anti-nociception in a model of
neuropathic pain (Costa et al., 2008). Finally, PEA has been shown to act as an
endogenous ligand for newly discovered receptors, i.e., the nuclear peroxisome
proliferator-activated receptor-alpha, PPAR-α (Lo Verme et al., 2005) and the orphan G
65
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
protein-coupled receptor, GPR55 (Ryberg et al., 2007). Actually, MCs express some of
the direct or indirect molecular targets of PEA, like the cannabinoid (Stander et al.,
2005; Samson et al., 2003; Facci et al., 1995) vanilloid (Stander et al., 2004; Biro et al.,
1998) and PPAR-γ receptors (Maeyama et al., 2005). Therefore, it might be argued that
the three aforesaid hypotheses on the mechanism of action of PEA are much more
interconnected than previously thought, with the MC being the unifying element (Re
et al., 2007). The results of the present study strongly corroborate this hypothesis.
In canine mature MCs, histamine release induced by anti-canine IgE was
significantly reduced (50%) at 10-6 M concentration of PEA. This is a low effective
compound concentration compared to other compounds tested in dog MC release
studies. Years ago, in our laboratory Garcia et al. (1998) showed that sodium
cromoglycate, a MC stabilizer, and dexamethasone, a glucocorticoid, failed to inhibit
histamine release from isolated canine skin MCs following both IgE-dependent and independent stimulation. Only cyclosporin A, a potent immunosuppressor, salbutamol,
a β-adrenergic agonist, and rolipram, a selective phosphodiesterase IV inhibitor, were
able to inhibit histamine release mediated by the IgE high affinity receptor (FcεRI).
However, the higher inhibitory effects for CsA and for salbutamol (67.3% and 46.0%,
respectively) were observed at 10-5 M concentration and rolipram produced a weak
inhibition (19.2%), just at the higher concentration (10-4 M). Since histamine is known
to play a crucial role in skin inflammation and hyperalgesia (Gschwandtner et al., 2008;
Zuo et al., 2003) the modulation of its release by PEA might have important
therapeutic implications in skin diseases.
When PEA effects on PGD2 synthesis and release were analysed, a clear and
significant inhibitory effect was observed at the higher PEA concentrations studied.
These results could explain the involvement of aliamides in the control of
inflammatory responses, in view of the complex and dual role played by PGD2 in
inflammatory reactions (Sandig et al., 2007). Several studies supported the protective
anti-inflammatory, anti-oedema and analgesic properties of PEA in a wide range of
animal models (Costa et al., 2008; Wise et al., 2008; D’Agostino et al., 2007; Lo Verme
et al., 2005), our results indicated the role in MC down-modulation of ethanolamines.
66
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
Finally, TNFα production, in immunologically challenged freshly isolated skin
MCs, was studied. The low levels of TNFα released after stimulation by canine anti-IgE
made not possible to investigate the inhibitory effects of PEA. The expression of this
cytokine is usually very low. Brazis et al. (2000) demonstrated that no preformed TNFα
was found in the granules of skin MCs, suggesting that most of the cytokine released
into the medium was newly synthesised upon stimulation. The role of SCF, a cell
growth promoter, is crucial in the culture and stimulation of MCs to obtain measurable
amount of this cytokine. When cells were cultured from 2 to 4 days in the presence of
SCF, increasing levels of TNFα were released and clear inhibitory effects by PEA were
observed. The powerful effect of SCF, as a supplementary factor added to the culture
medium, on TNFα production, could reflect an overall MC recovery affecting
particularly late phase signaling mechanisms. In the present study PEA showed a dose–
effect relationship, this result disagrees with that found by Granberg et al. (2001) that
did not notice any significant effect of PEA upon TNFα secretion in an immunologically
challenged MC line. The discrepancy may depend on the different cell lines used and
different experimental conditions. The inhibitory effect exerted by PEA on TNFα
release from canine MCs is particularly suggestive in view of the emerging role of this
cytokine in skin inflammation. MC-derived TNFα recruits neutrophils (von Stebut et al.,
2003), enhances T cell activation (Nakae et al., 2005), and dendritic cell migration
during acquired immune response in the skin (Suto et al., 2006). Moreover, TNFα has
been shown to promote the elongation of cutaneous nerve fibres during a model of
contact hypersensitivity (Kakurai et al., 2006). These data clearly demonstrate that MCderived TNF may contribute to the expression of immune responses in skin
inflammatory and allergic disorders and suggest that the down-modulation of its
release may provide a therapeutic benefit in these conditions.
In conclusion, our results suggest that the anti-inflammatory and antinociceptive effects previously shown for PEA could be due, at least in part, to its ability
to down-modulate MC release of preformed and newly synthesised mediators.
Therefore, PEA may have a therapeutic potential in treating, not only acute or chronic
inflammatory skin diseases, but also other dermatological diseases involving MC
67
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
hyperactivity. More preclinical and clinical studies in dogs are needed to confirm this
promising activity observed in skin MCs.
1.6. Acknowledgements
The authors are grateful to Tamara Rivero for her excellent technical assistance.
This work was partially supported by a grant of Agency for Management of University
and Research of the Catalan Ministry for Innovation, Universities and Enterprise, Spain.
1.7. References
Aloe, L., Leon, A., Levi-Montalcini, R., 1993. A proposed autacoid mechanism
controlling mastocyte behaviour. Agents Actions 39 (Spec. No. C),145–147.
Ben-Shabat, S., Fride, E., Sheskin, T., Tamiri, T., Rhee, M.H., Vogel, Z., Bisogno, T., De
Petrocellis, L., Di Marzo, V., Mechoulam, R., 1998. An entourage effect: inactive
endogenous fatty acid glycerol esters enhance 2-arachidonoyl-glycerol cannabinoid
activity. European Journal of Pharmacology 353, 23–31.
Biro, T., Maurer, M., Modarres, S., Lewin, N.E., Brodie, C., Acs, G., Acs, P., Paus, R.,
Blumberg, P.M., 1998. Characterization of functional vanilloid receptors expressed by
mast cells. Blood 91, 1332–1340.
Brazis, P., Torres, R., Queralt, M., de Mora, F., Ferrer, L., Puigdemont, A., 2002.
Evaluation of cell-surface IgE receptors on the canine mastocytoma cell line C2
maintained in continuous culture. American Journal of Veterinary Research 63, 763–
766.
Brazis, P., Queralt, M., de Mora, F., Ferrer, L., Puigdemont, A., 2000. Stem cell factor
enhances IgE-mediated histamine and TNF-alpha release from dispersed canine
cutaneous mast cell. Veterinary Immunology and Immunopatholology 75, 97–108.
Calignano, A., La Rana, G., Piomelli, D., 2001. Antinociceptive activity of the
endogenous fatty acid amide, palmitoylethanolamide. European Journal of
Pharmacology 419, 191–198.
Conti, S., Costa, B., Colleoni, M., Parolaro, D., Giagnoni, G., 2002. Antiinflammatory
action of endocannabinoid palmitoylethanolamide and the synthetic cannabinoid
nabilone in a model of acute inflammation in the rat. British Journal of Pharmacology
135, 181–187.
68
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
Costa, B., Comelli, F., Bettoni, I., Colleoni, M.P., Giagnoni, G., 2008. The endogenous
fatty acid amide, palmitoylethanolamide, has anti-allodynic and anti-hyperalgesic
effects in a murine model of neuropathic pain: involvement of CB1. TRPV1 and
PPARgamma receptors and neurotrophic factors. Pain 139, 541–550.
D’Agostino, G., La Rana, G., Russo, R., Sasso, O., Iacono, A., Esposito, E., Mattace Raso,
G., Cuzzocrea, S., Lo Verme, J., Pomelli, D., Meli, R., Malignano, A., 2007. Acute
intracerebroventricular administration of palmitoylethanolamide, an endogenous
PPAR-{alpha} agonist, modulates carrageenan-induced paw edema in mice. The
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 322, 1137–1143.
Darmani, N.A., Izzo, A.A., Degenhardt, B., Valenti, M., Scaglione, G., Papasso, F.,
Sorrentini, I., Di Marzo, V., 2005. Involvement of the cannabimimetic compound, Npalmitoylethanolamine, in inflammatory and neuropathic conditions. A review of the
available pre-clinical data and first human studies. Neuropharmacology 48, 1154–
1163.
De Filippis, D., D’Amico, A., Iuvone, T., 2008. Cannabinomimetic control of mast cell
mediator release: new perspective in chronic inflammation. Journal of
Neuroendrocrinology 20 (Suppl. 1), 20–25.
De Mora, F., Puigdemont, A., Torres, R., 2006. The role of mast cells in atopy: what can
we learn from canine models? A thorough review of the biology of mast cells in canine
and human systems. The British Journal of Dermatology 155, 1109–1123.
De Petrocellis, L., Bisogno, T., Ligresti, A., Bifulco, M., Melck, D., Di Marzo, V., 2002.
Effect on cancer cell proliferation of palmitoylethanolamide, a fatty acid amide
interacting with both the cannabinoid and vanilloid signalling systems. Fundamental
and Clinical Pharmacology 16, 297–302.
Di Marzo, V., 2006. Biochemistry and pharmacology of fatty acid amides-effects on
inflammation, pain and pruritus and new perspectives in veterinary medicine. Journal
of Veterinary Pharmacology and Therapeutics 29 (Suppl. 1), 2–4.
Eberlein, B., Eicke, C., Reinhardt, H.W., Ring, J., 2008. Adjuvant treatment of atopic
eczema: assessment of an emollient containing N-palmitoylethanola mine (ATOPA
study). Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 22, 73–82.
Facci, L., Dal Toso, R., Romanello, S., Buriani, A., Skaper, S.D., Leon, A., 1995. Mast cells
express a peripheral cannabinoid receptor with differential sensitivity to anandamide
and palmitoylethanolamide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 92, 3376–3380.
Farquhar-Smith, W.P., Rice, A.S., 2003. A novel neuroimmune mechanism in
cannabinoid-mediated attenuation of nerve growth factor-induced hyperalgesia.
Anesthesiology 99, 1391–1401.
69
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
Garcia, G., Ferrer, L., de Mora, F., Puigdemont, A., 1998. Inhibition of histamine release
from dispersed canine skin mast cells by cyclosporine A, rolipram and salbutamol, but
not by dexamethasone or sodium cromoglycate. Veterinary Dermatology 9, 81–86.
Galli, S.J., 1997. The mast cell: a versatile effectors cell for a challenging world.
International Archives of Allergy and Immunology 113, 14–22.
Granberg, M., Fowler, C.J., Jacobsson, S.O., 2001. Effects of the cannabimimetic fatty
acid derivatives 2-arachidonoylglycerol, anandamide, palmitoylethanolamide and
methanandamide upon IgE-dependent antigen-induced beta-hexosaminidase,
serotonin and TNF alpha release from rat RBL-2H3 basophilic leukaemic cells. NaunynSchmiedeberg’s Archives of Pharmacology 364, 66–73.
Griffin, G., Tao, Q., Abood, M.E., 2000. Cloning and pharmacological characterization of
the rat CB(2) cannabinoid receptor. Journal of the Pharmacology and Experimental
Therapeutics 292, 886–894.
Gschwandtner, M., Purwar, R., Wittmann, M., Ba¨umer, W., Kietzmann, M., Werfel, T.,
Gutzmer, R., 2008. Histamine upregulates keratinocyte MMP-9 production via the
histamine H1 receptor. The Journal of Investigative Dermatology 128, 2783–2791.
Gueck, T., Aschenbach, J.R., Fuhrmann, H., 2002. Influence of vitamin E on mast cell
mediator release. Veterinary Dermatology 13, 301–305.
Hammerberg, B., Olivry, T., Orton, S.M., 2001. Skin mast cell histamine release
following stem cell factor and high-affinity immunoglobulin E receptor cross-linking in
dogs with atopic dermatitis. Veterinary Dermatology 12, 339–346.
Holgate, S.T., Robinson, C., Church, M.K., 1993. Mediators of immediate
hypersensitivity. In: Middleton, E., Reed, C.E., Ellis, E.F., Adkinson, N.F., Yungigner,
J.W., Busse, W.W. (Eds.), Allergy: Principles and Practice, fourth Ed. Mosby-Year Book,
St. Louis, Missouri, USA, pp. 267–301
Iuvone, T., De Filippis, D., D’Amico, A., Petrosino, S., Di Marzo, V., 2007. Protective role
of aliamides and endocannabinoid system during lambda-carrageenan-induced
granuloma formation. In: Proceedings 3rd International Conference on ‘‘Phospholipase
A2 and Lipid Mediators’’, Sorrento, Italy, p. 143.
Jack, D.B., 1996. Aliamides: A new approach to the treatment of inflammation. Drug
News and Perspectives 9, 93–98.
Jonsson, K.O., Persson, E., Fowler, C.J., 2006. The cannabinoid CB(2) receptor selective
agonist JWH133 reduces mast cell oedema in response to compound 48/80 in vivo but
not the release of betahexosaminidase from skin slices in vitro. Life Sciencies 78, 598–
606.
70
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
Kakurai, M., Monteforte, R., Suto, H., Tsai, M., Nakae, S., Galli, S.J., 2006. Mast cellderived tumor necrosis factor can promote nerve fiber elongation in the skin during
contact hypersensitivity in mice. The American Journal of Pathology 169, 1713–1721.
Kimura, I., Moritani, Y., Tanizaki, Y., 1979. Basophils in bronchial asthma with reference
to reagin-type allergy. Clinical Allergy 3, 195–202.
Lambert, D.M., Di Marzo, V., 1999. The palmitoylethanolamide and oleamide enigmas:
Are these two fatty acid amides cannabimimetic? Current Medicinal Chemistry 6, 757–
773.
Lambert, D.M., Vandevoorde, S., Jonsson, K.O., Fowler, C.J., 2002. The
palmitoylethanolamide family: A new class of anti-inflammatory agents? Current
Medicinal Chemistry 9, 663–674.
Lau, A.H., Chow, S.S., 2003. Effects of cannabinoids receptor agonist on
immunologically induced histamine release from rat peritoneal mast cells. European
Journal of Pharmacology 464, 229–235.
Lo Verme, J., Fu, J., Astarita, G., La Rana, G., Russo, R., Calignano, A., Piomelli, D., 2005.
The nuclear receptor PPAR-a mediates the anti-inflammatory actions of
palmitoylethanolamide. Molecular Pharmacology 67, 15–19.
Maeyama, K., Emi, M., Tachibana, M., 2005. Nuclear receptors as targets for drug
development: peroxisome proliferator-activated receptor gamma in mast cells: its
roles in proliferation and differentiation. Journal of Pharmacological Sciences 97, 190–
194.
Marsella, R., Joyce, J., Nicklin, C., Lopez, J., 2005. Evaluation of the effects of
palmitoylethanolamide on clinical signs in house dust mite allergic high IgE Beagle dogs
using a randomized, double blinded, placebo controlled design. Veterinary
Dermatology 16, 202 (Abstract from the ACVD/ASVD Congress, 2005, Saratosa,
Florida).
Mazzari, S., Canella, R., Petrelli, L., Marcolongo, G., Leon, A., 1996. N-(2- hydroxyethyl)
hexadecanamide is orally active in reducing edema formation and inflammatory
hyperalgesia by down-modulating mast cell activation. European Journal of
Pharmacology 300, 227–236.
Nakae, S., Suto, H., Kakurai, M., Sedgwick, J.D., Tsai, M., Galli, S.J., 2005. Mast cells
enhance T cell activation: Importance of mast cell-derived TNF. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 102, 6467–6472.
Petrosino, S., Karsak, M., Cristino, L., Gaffal, E., Tu¨ tting, T., Ueda, N., Zimmer, A.,
Bisogno, T., Di Marzo, V., 2008a. Protective role of palmitoylethanolamide in
keratinocytes and its involvement in contact allergic dermatitis.In: 18th Annual
71
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
Symposium on the Cannabinoids, International Cannabinoid Research Society,
Burlington, Vermont, p. 10.
Petrosino, S., Albanese, F., Abramo, F., Di Marzo, V., 2008b. Increased skin levels of the
aliamide palmitoylethanolamide and other endogenous fatty acid amides in dogs with
atopic dermatitis. In: 33rd Annual WSAVA/FECAVA Congress, Dublin, Ireland, p. 707.
Pulvirenti, N., Nasca, M.R., Micali, G., 2007. Topical adelmidrol 2% emulsion, a novel
aliamide, in the treatment of mild atopic dermatitis in pediatric subjects: a pilot study.
Acta Dermatovenerologica Croata 15, 80–83.
Re, G., Barbero, R., Miolo, A., Di Marzo, V., 2007. Palmitoylethanolamide,
endocannabinoids and related cannabimimetic compounds in protection against tissue
inflammation and pain: Potential use in companion animals. The Veterinary Journal
173, 23–32.
Ryberg, E., Larsson, N., Sjögren, S., Hermansson, N.-O., Leonova, J., Elebrig, T., Nilsson,
K., Drmota, T., Greasley, P.J., 2007. The orphan receptor GPR55 is a novel cannabinoid
receptor. British Journal of Pharmacology 152, 1092–1101.
Samson, M.T., Small-Howard, A., Shimoda, L.M., Koblan-Huberson, M., Stokes, A.J.,
Turner, H., 2003. Differential roles of CB1 and CB2 cannabinoid receptors in mast cells.
Journal of Immunology 170, 4953–4962.
Sandig, H., Pease, J.E., Sabroe, I., 2007. Contrary prostaglandins: the opposing roles of
PGD2 and its metabolites in leukocyte function. Journal of Leukocyte Biology 81, 372–
382.
Scarampella, F., Abramo, F., Noli, C., 2001. Clinical and histological evaluation of an
analogue of palmitoylethanolamide, PRL 120 (comicronized Palmdirol INN) in cats with
eosinophilic granuloma and eosinophilic plaque: A pilot study. Veterinary Dermatology
12, 29–39.
Showalter, V.M., Compton, D.R., Martin, B.R., Abood, M.E., 1996. Evaluation of binding
in a transfected cell line expressing a peripheral cannabinoid receptor (CB2):
identification of cannabinoid receptor subtype selective ligands. The Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics 278, 989–999.
Stander, S., Moormann, C., Schumacher, M., Buddenkotte, J., Artuc, M., Shpacovitch,
V., Brzoska, T., Lippert, U., Henz, B.M., Luger, T.A., Metze, D., Steinhoff, M., 2004.
Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers, mast
cells, and epithelial cells of appendage structures. Experimental Dermatology 13, 129–
139.
Stander, S., Schmelz, M., Metze, D., Luger, T., Rukwied, R., 2005. Distribution of
cannabinoid receptor 1 (CB1) and 2 (CB2) on sensory nerve fibers and adnexal
structures in human skin. Journal of Dermatological Science 38, 177–188.
72
CAPÍTOL 1 / CHAPTER 1
Stempelj, M., Bavec, A., Ferjan, L., 2006. Regulation of nerve growth factor induced
histamine and arachidonic acid release from rat mast cells by cannabinoids.
Inflammation Research 55 (Suppl. 1), S09–S10.
Suto, H., Nakae, S., Kakurai, M., Sedgwick, J.D., Tsai, M., Galli, S.J., 2006. Mast cellassociated TNF promotes dendritic cell migration. Journal of Immunology 176, 4102–
4112.
von Ruedorffer, U., Fisch, R., Peel, J., Roosje, P., Griot-Wenk, M., Welle, M., 2003. Flea
bite hypersensitivity: new aspects on the involvement of mast cells. Veterinary Journal
165, 149–156.
von Stebut, E., Metz, M., Milon, G., Knop, J., Maurer, M., 2003. Early macrophage
influx to sites of cutaneous granuloma formation is dependent on MIP-1alpha/beta
released from neutrophils recruited by mast cell-derived TNFalpha. Blood 101, 210–
215.
Wise, L.E., Cannavacciulo, R., Cravatt, B.F., Marun, B.F., Lichtman, A.H., 2008.
Evaluation of fatty acid amides in the carrageenan-induced paw edema model.
Neuropharmacology 54, 181–188.
Wuersch, K., Brachelente, C., Doherr, M., Reist, M., Sattler, U., Forster, U., Bertoni, G.,
Peel, J.E., Welle, M., 2006. Immune dysregulation in flea allergy dermatitis – A model
for the immunopathogenesis of allergic dermatitis. Veterinary Immunology and
Immunopathology 110, 311–323.
Zuo, Y., Perkins, N.M., Tracey, D.J., Geczy, C.L., 2003. Inflammation and hyperalgesia
induced by nerve injury in the rat: a key role of mast cells. Pain 105, 467–479.
73
74
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2:
Effects of palmitoylethanolamide on the cutaneous
allergic inflammatory response in Ascaris hypersensitive
Beagle dogs.
Santiago Cerrato, Pilar Brazís, Maria Federica della Valle, Alda Miolo,
Stefania Petrosino, Vicenzo Di Marzo and Anna Puigdemont.
Veterinary Journal 191, 377-382 (2012).
75
76
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
2. Effects of palmitoylethanolamide on the cutaneous allergic inflammatory response
in Ascaris hypersensitive Beagle dogs.
2.1. Abstract
Palmitoylethanolamide (PEA) is an endogenous lipid mediator with antiinflammatory and anti-hyperalgesic properties. The main objective of the present
study was to evaluate the effects of PEA on the cutaneous allergic inflammatory
reaction induced by different immunological and non-immunological stimuli in
hypersensitive dogs. Six spontaneously Ascaris hypersensitive Beagle dogs were
challenged with intradermal injections of Ascaris suum extract, substance P and anticanine IgE, before and after a single oral administration of PEA at doses of 3, 10 and 30
mg/kg. A significant reduction in wheal area induced by both antigen and anti-canine
IgE challenge was observed after PEA administration. No significant differences were
observed between the two higher doses studied, suggesting that the 10 mg/kg dose
had exerted the maximum inhibitory effect. When blood levels of PEA were compared
with the effects at different times, an evident correlation was obtained. However, the
anti-inflammatory effects of PEA were more long-lasting than their plasma
concentrations. The intradermal injection of substance P did not reveal any skin
reaction (wheal or erythema formation) at any of the concentrations tested. In
conclusion, PEA might constitute a new therapeutic strategy for the treatment of
allergic inflammatory skin diseases in companion animals.
2.2. Introduction
The incidence of spontaneous allergic reactions in dogs (atopic dermatitis)
appears to be increasing (Nødtvedt et al., 2006). Although management combines
different interventions depending on the particular aetiology, the most widespread
therapeutic approach still relies on glucocorticoids, which can lead to a variety of
adverse effects especially with chronic treatments (Blois et al., 2009). Therefore, it is
important to develop new effective mechanism-oriented approaches for controlling
77
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
allergic and inflammatory processes associated with a number of skin diseases in the
dog and cat.
The skin mast cell (MC) plays a pivotal role in both innate and allergic immune
responses through the release of bioactive mediators in response to a wide range of
biological, chemical, microbial and physical stimuli, (Hershko and Rivera, 2009;
Hofmann and Abraham, 2009; Metz and Maurer, 2009; Metz et al., 2008; De Mora et
al., 2006; Wuersch et al., 2006; von Ruedorffer et al., 2003; Hammerberg et al., 2001).
MC degranulation leads to an initial early phase reaction with the subsequent
induction of transcription of inflammatory cytokines and chemokines, which
contribute to the late phase reactions through the recruitment of inflammatory cells,
such as lymphocytes and eosinophils, and may ultimately result in chronic skin
inflammation (Galli, 1997; Olivry et al., 1996; Holgate et al., 1993). The modulation of
the early phase allergic reaction can thus become an effective mechanism-based
strategy to reduce the development of the inflammatory mediator cascade and to
control the more damaging chronic phase.
Recent studies have shown the existence of new endogenous lipid mediators
with anti-inflammatory and antinociceptive properties (Re et al., 2007; Lambert et al.,
2002). Palmitoylethanolamide (PEA) is one of these lipids and belongs to the autacoid
local injury antagonist (ALIA) amide family (Lambert et al., 2002; Jack, 1996). PEA is a
long chain N-acylethanolamine that can be found in low concentrations in most
organisms, including yeasts, plants and mammals (Muccioli et al., 2009; Ozalp and
Barroso, 2009; Chapman et al., 2004). It is produced on demand during inflammatory
and degenerative processes (Sagar et al., 2009) and its local elevation is considered to
exert protective roles (Re et al., 2007).
In cats with eosinophilic granuloma, Scarampella et al. (2001) showed an
improvement of clinical signs and lesions after 1 month of treatment with PEA.
Another study carried out by Marsella et al. (2005) demonstrated that after 7 days of
treatment, PEA was able to delay but not prevent the development of clinical signs of
atopic dermatitis in a canine experimental model. More recently, PEA was found to
counteract dinitrofluorobenzene (DNFB)-induced dermatitis in rats (Petrosino et al.,
78
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
2010). These anti-inflammatory and anti-allergic effects may be due, at least in part, to
the ability of PEA to down-modulate mediator release from canine skin MCs (Cerrato
et al., 2010). Despite these encouraging in vitro results, so far no studies have
investigated the in vivo effect of PEA on acute cutaneous reactions in dogs.
The main objective of the present study was to evaluate the potential inhibitory
effects of PEA, administered orally in a single dose, on the skin reaction induced by
different immunological and non-immunological stimuli (anti-canine IgE, Ascaris suum
antigen and substance P) in hypersensitive Beagle dogs. In addition, we correlated the
anti-inflammatory activity of PEA with its plasma levels at different times after oral
treatment.
2.3. Material and methods
2.3.1. Drugs, chemicals, and reagents
PEA was supplied by Innovet in the ultramicronized form (Milano, Italy). Ascaris
suum extract was purchased from Greer Laboratories (Lenoir, NC, United States). Anticanine IgE was purchased from Bethyl Laboratories (Montgomery, TX, USA). Evans blue
dye, substance P acetate salt hydrate and histamine diphosphate salt were obtained
from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA).
2.3.2. Animals
Six spontaneously hypersensitive Beagle dogs with mean body weights of 14.0 ±
0.6 kg were used. The animals were fasted overnight before oral administration of the
tested drug. All experiments and procedures were performed in accordance with
European regulations governing the care and treatment of laboratory animals and
were approved by the Animal Care and Use Committee of the Universitat Autònoma
de Barcelona.
79
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
2.3.3. Experimental protocol
The method used was based on the measurement of the wheal area induced by
intradermal injections of A. suum extract solution, substance P (SP) and anti-canine IgE
in the skin before and after oral administration of an aqueous suspension of PEA in
carboxymethylcellulose (0.5%) at three different doses (3, 10, 30 mg PEA/kg).
2.3.4. Intradermal challenge
Before any treatment administration, intradermal injections were performed to
determine basal conditions (baseline values). In order to better visualize wheal areas, a
2% w/v Evans blue dye solution in saline was given IV (0.4 mL/kg) 30 min before the
first intradermal injections of stimuli. Then 40 µL of A. suum extract (0.1 mg/mL), SP
(0.1, 1 and 10 nM) and anti-canine IgE (1 µg/mL) were administered using a Hamilton
syringe (type 701LT) (Hamilton Company, Reno, NV, United States) in the shaved
lateral thoracic area of the awaken dogs. Wheal areas were measured 10 min after
each injection by applying an acetate sheet over the reaction site, thus allowing us to
draw an outline of the wheal with indelible ink. Histamine (0.01 mg/mL) and saline
were also injected as positive and negative controls, respectively.
Each dog was then given a single dose of PEA with a flexible oesophageal tube
with a washout period of 1 week between different PEA doses (3, 10, 30 mg/kg). A.
suum extract, anti-canine IgE, SP, saline and histamine were injected again 1, 2, 4, 8
and 24 h after PEA administration. Wheal areas were measured with an image analyzer
MIP 4 ADVANCED (Digital Image System, Barcelona, Spain) and the percentage of
inhibition was calculated for each dog, each time and each dose.
A control study was also conducted in each dog without treatment to
determine whether cutaneous wheal responses induced by successive stimuli
intradermal injections were maintained uniform over time (8 h). To guarantee test
80
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
reproducibility all experiments were performed by the same investigator blinded to
treatment.
2.3.5. PEA extraction and detection by high-pressure liquid chromatography (HPLC)
Plasma levels study was performed after the completion of the efficacy study.
The objective was to evaluate whether PEA levels were quantifiable and
whether metabolites were produced. The higher dose of PEA was selected and only
the male dogs (n = 4) were used to avoid possible hormone-dependent variability.
Determination of PEA plasma levels was performed after 0, 1, 2, 4 and 8 h of
oral PEA administration (30 mg/kg dosing). Blood samples were obtained through a
catheter inserted into a cephalic vein. The samples were collected at pre-established
times. To determine PEA plasma levels, blood samples were collected and placed into
spray-coated lithium-heparin tubes (BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, United States).
Afterwards, blood samples were centrifuged at 1881 g for 10 min and the collected
plasma was stored at -80 °C until analysis using HPLC. Plasma was Dounce
homogenized and extracted with chloroform/methanol/Tris HCl 50 mM pH 7.5 (2:1:1,
v/v) containing internal standards. The lipid extract was pre-purified by open-bed
chromatography on silica columns eluted with increasing concentrations of methanol
in chloroform. After extraction and purification, PEA-containing fractions were
subjected to isotope-dilution liquid chromatography–atmospheric pressure chemical
ionizationmass spectrometric analysis (LC–APCI-MS) by using a Shimadzu HPLC
apparatus (LC-10ADVP) coupled to a Shimadzu (LCMS-2010) quadruple MS via a
Shimadzu APCI interface as described previously (Matias et al., 2002). The
concentrations of PEA are given as pmol/mL blood.
2.3.6. Data analysis
Wheal areas are expressed in mm2 as means ± standard deviation (mean ± SD)
from six experiments. Results are expressed as the percentage of inhibition observed
81
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
at any time (tn area) in comparison with the area obtained in the same dog before
starting the treatment (baseline area).
Wheal inhibition was calculated with the following formula,
%
100
Plasma levels of PEA (30 mg/kg) are expressed in pmol/mL as means ± SD from
four experiments.
Statistical analysis was performed using SAS v9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC,
United States). Statistical significance level was set at 0.05. Response variables were
summarized using mean, SD, coefficient of variation (CV) and sample size when
necessary. Multiple comparisons correction was performed using Dunnett’s correction
when comparisons were performed to a control level or Tukey’s correction for pair
wise comparisons.
2.4. Results
The expected side effects of the oral administration of PEA at the established
doses (3, 10, 30 mg/kg) were excitation and anxiety or sedation and drowsiness. The
veterinary control confirmed that PEA did not produce any side effects.
Mean wheal areas induced by successive histamine, anti-canine IgE and A.
suum extract injections in untreated dogs were measured to assess the repeatability of
the wheal area over time. Despite the differences observed between dogs (CV > 10%),
no differences were observed within-dogs (CV < 5%). For this reason the inhibitory
effects in each dog were calculated from they own basal value. Table 1 showed the
wheal areas obtained with all stimuli in each animal at different times.
82
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Table 1. Cutaneous wheal areas obtained with repeated intradermal injections of
histamine, anti-IgE and Ascaris suum during 8 h without treatment.
AREA (mm2)
Animal
Histamine
Mean ± SD
Anti-IgE
Mean ± SD
Ascaris suum
Mean ± SD
A
B
C
D
E
F
68.3 ± 2.3
57.5 ± 1.3
65.2 ± 2.3
91.5 ± 3.7
66.0 ± 2.0
70.1 ± 1.8
45.9 ± 1.0
49.3 ± 1.0
46.9 ± 1.4
63.0 ± 1.4
45.8 ± 1.1
56.0 ± 1.0
42.9 ± 1.0
45.3 ± 2.3
58.9 ± 1.3
40.7 ± 1.0
56.8 ± 1.4
66.0 ± 1.3
The intradermal injection of SP did not develop any skin reaction at the tested
concentrations (0.1, 1 and 10 nM), even when the evaluation was performed at
different times after challenge (5, 10 and 20 min). Therefore, the inhibitory effect of
PEA after SP challenge was not evaluated.
Fig. 1a and b show the percentage inhibition observed after a single oral PEA
administration (3, 10 and 30 mg/kg) on wheal areas induced by A. suum antigen and
anti-canine IgE, respectively. Wheal areas induced by A. suum antigen were evaluated.
The higher studied doses of PEA significantly reduced the antigen-induced skin
reaction 1, 2 and 4 h after PEA administration. The maximum inhibitory effects (29.3 ±
8.7 and 32.3 ± 10.5%) were observed at the 10 and 30 mg/kg doses and at 1 h and 2 h
after compound administration, respectively (P < 0.01; Fig. 1a).
83
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
60
a
**
Wheal inhibiton (%)
40
**
**
**
**
*
*
3 mg/kg
10 mg/kg
30 mg/kg
20
0
0
5
10
15
20
25
time (h)
60
Wheal inhibition (%)
b
**
**
40
**
**
**
**
3 mg/kg
10 mg/kg
30 mg/kg
*
20
0
0
5
10
15
20
25
time (h)
Figure 1. Mean inhibition percentage (±SD) (n = 6) of wheal areas induced in conscious
hypersensitive Beagle dogs by Ascaris suum extract (a) and anti-canine IgE (b) at several times
after oral administration of palmitoylethanolamide (PEA) at 3, 10 and 30 mg/kg. *P < 0.05 and
**P < 0.01 vs. baseline values.
84
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Similar results were found when intradermal challenge was performed with
anti-canine-IgE. The higher tested doses of PEA resulted in a significant reduction of
wheal areas 1, 2 and 4 h after PEA administration, but the most effective inhibition was
reached 2 h after treatment at the 10 and 30 mg/kg doses, with significant mean
inhibition percentages of 32.4 ± 9.4% and 31.7 ± 14.9%, respectively (P < 0.01; Fig. 1b).
Table 2 provides the concentration of PEA observed in blood samples obtained
after a single oral dose of PEA (30 mg/kg) in the four Beagle dogs evaluated. Blood
samples were collected before and 1, 2, 4 and 8 h after treatment. As shown in Table
2, PEA returned to basal values 4 h after treatment.
Table 2. Plasma concentrations of palmitoylethanolamide (PEA) after oral
administration at 30 mg/kg (n = 4).
PEA plasma levels (pmol/mL)
Time (h)
0
1
2
4
8
Dog
Mean ± SD
A
B
C
D
9.5
76.5
76.0
11.6
14.4
5.2
37.9
55.1
8.4
9.1
10.8
52.5
72.4
10.0
15.4
18.9
50.6
32.6
10.8
9.7
11.1 ± 5.7
54.4 ± 16.1*
59.0 ± 18.9*
10.2 ± 1.4
12.2 ± 3.2
* P < 0.01.
Fig.2 shows the average PEA plasma levels measured after a single oral dose of
30 mg/kg. The highest concentrations of PEA in plasma (54.4 ± 16.1 pmol/mL and 59.0
± 19.8 pmol/mL) were found 1 h and 2 h after dosing and these concentrations were
statistically different from basal values (10 pmol/mL).
85
100
100
80
80
**
anti-canine IgE (%)
A. suum (%)
PEA [pmol/ml]
**
60
60
**
**
40
**
**
40
**
**
20
pmol/ml
Wheal inhibition (%)
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
20
0
0
0
2
4
6
8
time (h)
Figure 2. Mean plasma levels (±SD) of palmitoylethanolamide (PEA) (n = 4) and mean inhibition
percentage (± SEM) of wheal areas (n = 6) induced in conscious hypersensitive Beagle dogs by
Ascaris suum extract and anti-canine IgE at several times after oral administration of PEA at 30
mg/kg. **P < 0.01 vs. baseline values.
Fig 3. shows the wheal areas induced by different stimuli and controls in
hypersensitive Beagle dogs skin. Inhibitory effects observed at these times (0, 1, 2, 4
and 8 h) are also represented to obtain a pharmacokinetic–pharmacodynamic
correlation.
86
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Figure 3. Skin wheals induced in hypersensitive Beagle
Beagle dogs 20 min after an intradermal
injection of 40 µL of Ascaris suum extract, anti-canine IgE, histamine, substance P and saline
solution.
2.5. Discussion
In the present study the anti-allergic and anti-inflammatory properties of PEA,
an endogenous lipid mediator belonging to the ALIAmide family, were evaluated after
a single oral treatment in A. suum hypersensitive Beagle dogs. This is the first time that
the efficacy of ultramicronized PEA in reducing immediate skin reaction in this canine
model of skin allergy is reported. Spontaneous hypersensitivity to A. suum antigens in
Beagle dogs provides an established model of allergic dermatitis (De Mora et al.,
2006). Following intradermal exposure to A. suum extract, an immediate MC-mediated
wheal and pruritus develops (Brazís et al., 2006; De Mora et al., 2006; Torres et al.,
2006; Brazís et al., 1998; Queralt et al., 1998).
1998). Afterwards, a marked cutaneous
eosinophilia is observed, indicative of the development of a late phase allergic reaction
(Torres et al., 2003).
87
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Treatment of A. suum hypersensitive Beagle dogs with a single dose of
ultramicronized PEA resulted in significant reduction of skin wheal areas induced by A.
suum extract and anti-IgE antibody. These data are in agreement with an earlier
experimental study, showing that PEA inhibits skin inflammation in a model of atopic
dermatitis in mice, i.e. the allergic dermatitis induced by DNFB (Petrosino et al., 2010).
Moreover, that study also reported that PEA down-regulates the expression and levels
of the inflammatory cytokine MCP-2 (monocyte chemotactic protein-2), a chemokine
produced by challenged keratinocytes (Petrosino et al., 2010) and responsible for the
recruitment of MCs (Romagnani, 2002).
In a previous study performed in our laboratory, PEA was found to reduce the
release of histamine, prostaglandin (PG) D2 and tumour necrosis factor (TNF)-α from
immunologically challenged canine skin MCs (Cerrato et al., 2010). Interestingly, TNFα
was also reduced by PEA treatment in a dose-dependent manner in an experimental
model of chronic skin inflammation (α-carrageenin-induced granuloma) in rats (De
Filippis et al., 2010). It can thus be speculated that the effect of PEA relies on its ability
to down-modulate the degranulation of skin MCs and the consequent release of
inflammatory mediators and vasoactive amines, with histamine being deeply involved
in the wheal and flare reaction in dogs (Roßbach et al., 2009).
The maximal inhibition of anti-canine IgE-induced wheal was achieved 2 h after
oral treatment with a single dose of 3, 10 or 30 mg/kg PEA, with the mean inhibitory
effects of the two higher doses being 32.4 ± 9.4% and 31.7 ± 14.9%, respectively.
Similar results were found when an intradermal challenge was performed with A. suum
extract. Although significant inhibition was observed with the two higher doses of PEA,
no differences were observed between them, both in the anti-IgE and the A. suum
experiments. This suggests the existence of a plateau at the 10 mg/kg dose, which
could explain the maximum effects of PEA achieved at this concentration. These
results are in agreement with those observed in a recent study in an acute
inflammation model (carrageenin-induced paw oedema) in rats (Wise et al., 2008). A
significant anti-inflammatory effect of PEA was observed after systemic treatment at
12.5, 25 and 50 mg/kg, but no differences were observed among the doses studied.
Moreover, this optimal dose for PEA to exert anti-inflammatory effects (i.e. 10 mg/kg),
88
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
irrespective of the route of administration, has also been shown in previous studies
(Conti et al., 2002; Costa et al., 2002; Mazzari et al., 1996).
The intradermal injection of SP did not induce any skin reaction (wheal or
erythema formation). Several experiments were conducted to confirm the lack of
cutaneous reaction following SP challenge (Fig. 3). Moreover, the skin reaction was
evaluated 5, 10 and 20 min after challenge. These results are in disagreement with a
previous study in healthy and atopic dogs where inflammatory reactions were
observed using lower concentrations of SP (0.1, 0.5 and 1 nM) (Marsella and Nicklin,
2001). In that study, however, no significant difference was detected in the wheal
areas between the three tested concentrations of SP and, more importantly, lower
responses were reported to occur in atopic dogs compared with clinically normal dogs.
A possible explanation for the apparent discrepancy between these results and our
findings could reside in the postulated increase in cutaneous SP concentrations in the
skin of hypersensitive Beagle dogs used in the present study and the consequent
decrease in reactivity to SP injections. According to Marsella and Nicklin (2001), this
would suggest a similarity between the model used and naturally occurring atopic
disease.
In order to correlate the observed anti-allergic activity of PEA with its blood
levels, plasma samples were taken during 24 h after oral treatment. The absorption of
PEA was very fast and the peak plasma concentration was found between 1 and 2 h
after administration. Blood levels of PEA decreased rapidly and returned to basal levels
4 h after administration. Plasma concentration of PEA and anti-inflammatory effects
exhibited a parallel time-course during the 8 h following oral treatment. It is
interesting to note that although PEA plasma levels returned to basal value 4 h after
administration, the inhibitory effects lasted up to 8 h after treatment. The rapid return
to basal levels may be due to amidases that are known to rapidly inactivate PEA to
palmitic acid and ethanolamine (Ueda et al., 2001; Cravatt et al., 1996). On the other
hand, differences between the rapid elimination of PEA and the slower decrease of the
inhibitory effects may be related to the ability of PEA to up-regulate the levels or
enhance the action of other endogenous bioactive compounds, as has been suggested
previously (Hoareau et al., 2009; Lambert and Di Marzo, 1999).
89
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
In conclusion, treatment of hypersensitive dogs with a single oral dose of
ultramicronized PEA resulted in a significant reduction of allergic wheal reactions in the
skin. The dose of PEA exerting the maximum anti-allergic effect was 10 mg/kg. The
anti-inflammatory effect of PEA outlasted its plasma levels. Further studies are needed
to understand better the long-lasting mechanisms involved in the anti-inflammatory
and anti-allergic effects of PEA. Clinical studies comparing PEA treatment with other
classic therapeutic agents, such as glucocorticoids, are necessary to confirm the
efficacy of this treatment in allergic dogs.
2.6. Conflict of interest statement
Alda Miolo is an employee of CeDIS (Science Information and Documentation
Centre), Innovet Italia srl. Maria Federica dellaValle is a science consultant for Innovet
Italia srl. This work was supported in part by Innovet Italia srl.
2.7. References
Blois, S.L., Caron, I., Mitchell, C., 2009. Diagnosis and outcome of a dog with iatrogenic
hyperadrenocorticism and secondary pulmonary mineralization. Canadian Veterinary
Journal 50, 397–400.
Brazis, P., Queralt, M., de Mora, F., Ferrer, L., Puigdemont, A., 1998. Comparative study
of histamine release from skin mast cells dispersed from atopic, ascarissensitive and
healthy dogs. Veterinary Immunology and Immunopatholology 66, 43–51.
Brazís, P., Barandica, L., García, F., Clough, G.F., Church, M.K., Puigdemont, A., 2006.
Dermal microdialysis in the dog: In vivo assessment of the effect of cyclosporin A on
cutaneous histamine and prostaglandin D2 release. Veterinary Dermatology 17, 169–
174.
Cerrato, S., Brazis, P., della Valle, M.F., Miolo, A., Puigdemont, A., 2010. Effects of
palmitoylethanolamide on immunologically induced histamine, PGD2 and TNFa release
from canine skin mast cells. Veterinary Immunology and Immunopathology 133, 9–15.
Conti, S., Costa, B., Colleoni, M., Parolaro, D., Giagnoni, G., 2002. Antiinflammatory
action of endocannabinoid palmitoylethanolamide and the synthetic cannabinoid
nabilone in a model of acute inflammation in the rat. British Journal of Pharmacology
135, 181–187.
90
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Costa, B., Conti, S., Giagnoni, G., Colleoni, M., 2002. Therapeutic effect of the
endogenous fatty acid amide, palmitoylethanolamide, in rat acute inflammation:
Inhibition of nitric oxide and cyclo-oxygenase systems. British Journal of Pharmacology
137, 413–420.
Chapman, K.D., 2004. Occurrence, metabolism, and prospective functions of
Nacylethanolamines in plants. Progress in Lipid Research 43, 302–327.
Cravatt, B.F., Giang, D.K., Mayfield, S.P., Boger, D.L., Lerner, R.A., Gilula, N.B., 1996.
Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fattyacid
amides. Nature 384, 83–87.
De Filippis, D., D’Amico, A., Cipriano, M., Petrosino, S., Orlando, P., Di Marzo, V.,
Iuvone, T., 2010. Levels of endocannabinoids and palmitoylethanolamide and their
pharmacological manipulation in chronic granulomatous inflammation in rats.
Pharmacological Research 61, 321–328.
De Mora, F., Puigdemont, A., Torres, R., 2006. The role of mast cells in atopy: What can
we learn from canine models? A thorough review of the biology of mast cells in canine
and human systems. The British Journal of Dermatology 155, 1109–1123.
Galli, S.J., 1997. The mast cell: A versatile effectors cell for a challenging world.
International Archives of Allergy and Immunology 113, 14–22.
Hammerberg, B., Olivry, T., Orton, S.M., 2001. Skin mast cell histamine release
following stem cell factor and high-affinity immunoglobulin E receptor crosslinking in
dogs with atopic dermatitis. Veterinary Dermatology 12, 339–346.
Hershko, A.Y., Rivera, J., 2009. Mast cell and T cell communication; amplification and
control of adaptive immunity. Immunology Letters 128, 98–128.
Hoareau, L., Buyse, M., Festy, F., Ravanan, P., Gonthier, M.P., Matias, I., Petrosino, S.,
Tallet, F., d’Hellencourt, C.L., Cesari, M., Di Marzo, V., Roche, R., 2009.
Antiinflammatory effect of palmitoylethanolamide on human adipocytes. Obesity
(Silver Spring, MD) 17, 431–438.
Hofmann, A.M., Abraham, S.N., 2009. New roles for mast cells in modulating allergic
reactions and immunity against pathogens. Current Opinion in Immunology 21, 679–
686.
Holgate, S.T., Robinson, C., Church, M.K., 1993. Mediators of immediate
hypersensitivity. In: Middleton, E., Reed, C.E., Ellis, E.F., Adkinson, N.F., Yungigner,
J.W., Busse, W.W. (Eds.), Allergy: Principles and Practice, fourth Ed. Mosby-Year Book,
St. Louis, Missouri, USA, pp. 267–301.
91
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Jack, D.B., 1996. Aliamides: A new approach to the treatment of inflammation. Drug
News and Perspectives 9, 93–98.
Lambert, D.M., Di Marzo, V., 1999. The palmitoylethanolamide and oleamide enigmas:
Are these two fatty acid amides cannabimimetic? Current Medicinal Chemistry 6, 757–
773.
Lambert, D.M., Vandevoorde, S., Jonsson, K.O., Fowler, C.J., 2002. The
palmitoylethanolamide family: A new class of anti-inflammatory agents? Current
Medicinal Chemistry 9, 663–674.
Marsella, R., Nicklin, C.F., 2001. Intradermal skin test reactivity to histamine and
substance P is blunted in dogs with atopic dermatitis. Veterinary Dermatology 12, 149–
154.
Marsella, R., Joyce, J., Nicklin, C., Lopez, J., 2005. Evaluation of the effects of
palmitoylethanolamide on clinical signs in house dust mite allergic high IgE Beagle dogs
using a randomized, double blinded, placebo controlled design. Veterinary
Dermatology 16, 202 (Abstract from the ACVD/ASVD Congress, 2005, Saratosa,
Florida).
Matias, I., Pochard, P., Orlando, P., Salzet, M., Pestel, J., Di Marzo, V., 2002. Presence
and regulation of the endocannabinoid system in human dendritic cells. European
Journal of Biochemistry / FEBS 269, 3771–3778.
Mazzari, S., Canella, R., Petrelli, L., Marcolongo, G., Leon, A., 1996. N-(2- hydroxyethyl)
hexadecanamide is orally active in reducing edema formation and inflammatory
hyperalgesia by down-modulating mast cell activation. European Journal of
Pharmacology 300, 227–236.
Metz, M., Siebenhaar, F., Maurer, M., 2008. Mast cell functions in the innate skin
immune system. Immunobiology 213, 251–260.
Metz, M., Maurer, M., 2009. Innate immunity and allergy in the skin. Current Opinion
in Immunology 21, 687–693.
Muccioli, G.G., Sia, A., Muchowski, P.J., Stella, N., 2009. Genetic manipulation of
palmitoylethanolamide: Production and inactivation in Saccharomyces cerevisiae. PLoS
ONE 4, e5942.
Nødtvedt, A., Bergvall, K., Emanuelson, U., Egenvall, A., 2006. Canine atopic dermatitis:
Validation of recorded diagnosis against practice records in 335 insured Swedish dogs.
Acta Veterinaria Scandinavica 48, 8.
Olivry, T., Moore, P.F., Affolter, V.K., Naydan, D.K., 1996. Langerhans cell hyperplasia
and IgE expression in canine atopic dermatitis. Archives of Dermatological Research
288, 579–585.
92
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Ozalp, A., Barroso, B., 2009. Simultaneous quantitative analysis of Nacylethanolamides
in clinical samples. Analytical Biochemistry 395, 68–76.
Petrosino, S., Cristino, L., Karsak, M., Gaffal, E., Ueda, N., Tüting, T., Bisogno, T., De
Filippis, D., D’Amico, A., Saturnino, C., Orlando, P., Zimmer, A., Iuvone, T., Di Marzo, V.,
2010. Protective role of palmitoylethanolamide in contact allergic dermatitis. Allergy
65, 698–711.
Queralt, M., Brazis, P., Merlos, M., Puigdemont, A., 1998. Inhibitory effects of
rupatadine on mast cell histamine release and skin wheal development induced by
Ascaris suum in hypersensitive dogs. Drug Development Research 44, 49–55.
Re, G., Barbero, R., Miolo, A., Di Marzo, V., 2007. Palmitoylethanolamide,
endocannabinoids and related cannabimimetic compounds in protection against tissue
inflammation and pain: Potential use in companion animals. The Veterinary Journal
173, 23–32.
Roßbach, K., Stark, H., Sander, K., Leurs, R., Kietzmann, M., Baümer, W., 2009. The
histamine H4 receptor as a new target for treatment of canine inflammatory skin
diseases. Veterinary Dermatology 20, 555–561.
Romagnani, S., 2002. Cytokines and chemoattractants in allergic inflammation.
Molecular Immunology 38, 881–885.
von Ruedorffer, U., Fisch, R., Peel, J., Roosje, P., Griot-Wenk, M., Welle, M., 2003. Flea
bite hypersensitivity: New aspects on the involvement of mast cells. The Veterinary
Journal 165, 149–156.
Sagar, D.R., Gaw, A.G., Okine, B.N., Woodhams, S.G., Wong, A., Kendall, D.A.,
Chapman, V., 2009. Dynamic regulation of the endocannabinoid system: Implications
for analgesia. Molecular Pain 5, 59.
Scarampella, F., Abramo, F., Noli, C., 2001. Clinical and histological evaluation of an
analogue of palmitoylethanolamide, PRL 120 (comicronized Palmdirol INN) in cats with
eosinophilic granuloma and eosinophilic plaque: A pilot study. Veterinary Dermatology
12, 29–39.
Torres, R., Grifols, J., Fondevila, D., de Mora, F., 2003. Dermal exposure to Ag induces
sensitization and inflammation, in addition to the immediate response, in the Ascaris
suum-hypersensitive dog model of skin allergy. Allergy 58, 262 (Abstract from XXII
EAACI Congress, 2003, Paris, France).
Torres, R., Grifols, J., Marco, A., de Mora, F., 2006. Sensitization of naive beagles by
intradermal injection of an ascaris antigen: Induction of a model of skin allergy.
Immunopharmacology and Immunotoxicology 28, 697–702.
93
CAPÍTOL 2 / CHAPTER 2
Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S., 2001. Purification and characterization of an
acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous antiinflammatory substance. The Journal of Biological Chemistry 276, 35552–35557.
Wise, L.E., Cannavacciulo, R., Cravatt, B.F., Marun, B.F., Lichtman, A.H., 2008.
Evaluation of fatty acid amides in the carrageenan-induced paw edema model.
Neuropharmacology 54, 181–188.
Wuersch, K., Brachelente, C., Doherr, M., Reist, M., Sattler, U., Forster, U., Bertoni, G.,
Peel, J.E., Welle, M., 2006. Immune dysregulation in flea allergy dermatitis – A model
for the immunopathogenesis of allergic dermatitis. Veterinary Immunology and
Immunopathology 110, 311–323.
94
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3:
Inhibitory effects of topical adelmidrol on antigeninduced skin wheal and mast cell behavior in a canine
model of allergic dermatitis.
Santiago Cerrato, Pilar Brazís, Maria Federica della Valle, Alda Miolo and
Anna Puigdemont.
BMC Veterinary Research 8, 230 (2012).
95
96
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
3. Inhibitory effects of topical adelmidrol on antigen-induced skin wheal and mast
cell behavior in a canine model of allergic dermatitis.
3.1. Abstract
Adelmidrol is a semisynthetic derivative of azelaic acid and analogue of the
anti-inflammatory
compound
palmitoylethanolamide
(PEA).
Based
upon
its
physicochemical properties, adelmidrol is suitable for topical application. The main
objective of the present study was to evaluate the efficacy of a topical adelmidrol
emulsion on early and late inflammatory responses in hypersensitive dogs.
Repeated intradermal injections of Ascaris suum extract were performed in
both lateral thoracic areas of six conscious hypersensitive Beagle dogs, topically
treated during 8 consecutive days. Adelmidrol (2%) was applied to one side and vehicle
to the other. Twenty-four hours after the last antigen challenge, two biopsies
(adelmidrol- and vehicle-treated side) were obtained for each dog at the antigen
injection site.
A significant reduction in the antigen-induced wheal areas was observed on the
4th and 7th day of adelmidrol treatment. Moreover, cutaneous mast cell numbers were
significantly decreased in biopsies obtained after 8 consecutive days of topical
adelmidrol treatment.
The results obtained in the present study show that topical treatment with
adelmidrol might represent a new therapeutic tool in controlling the early and late
allergic inflammatory skin responses in companion animals.
3.2. Introduction
Adelmidrol is the diethanolamide derivative of azelaic acid, i.e., naturally
occurring dicarboxylic acid that has long proven to be an effective topical treatment
for human inflammatory skin disorders (Nazzaro-Porro, 1987), and whose mechanism
of action has been extensively investigated (Mastrofrancesco et al., 2010). Similar to
97
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
the anti-inflammatory and anti-nociceptive compound palmitoylethanolamide (PEA)
(Keppel et al., 2012; Sasso et al., 2012; De Filippis et al., 2011; Luongo et al. 2011;
Truini et al., 2011; Costa et al., 2008; Genovese et al. 2008; Wise et al., 2008; Re et al.,
2007; Lo Verme et al., 2005), adelmidrol belongs to the aliamide family (Aloe et al.,
1993; Jack, 1996), a group of fatty acid derivatives with cannabimimetic properties,
able to control mast cell (MC) hyper-reactivity in several pathophysiological and
pathological conditions (Cantarella et al., 2011; De Filippis et al., 2011; Esposito et al.,
2011; De Filippis et al., 2008; Re et al., 2007). We have recently found that PEA downmodulates the release of both preformed and newly-synthesized mediators from
canine skin MCs challenged with immunologic stimuli (Cerrato et al., 2010). Moreover,
the PEA analogue adelmidrol has been shown to negatively control the behavior of
canine skin MCs during pathophysiological conditions (i.e. healing of experimental
wounds) (Abramo et al., 2008). In particular, a statistically significant increase of
intracytoplasmic granular content of dermal MCs was shown in adelmidrol (2%)treated wounds compared to control, thus suggesting the compound is effectively able
to down-modulate skin MC degranulation in dogs (Abramo et al., 2008). Furthermore,
the local application of adelmidrol confirmed the reduction in MC responses during
chronic experimental inflammation, as shown by the significant decrease of mediators
such as chymase which are selectively expressed by MCs and intimately involved in
skin inflammation (De Filippis et al., 2009).
Mast cell hyperactivity is involved in the pathobiology of several canine
disorders (Woldemeskel and Rajeev, 2010; Kleinschmidt et al., 2008; Su et al., 1993),
including those of a dermatological nature (De Mora et al., 2006; von Ruedorffer et al.,
2003). In a canine model of allergic dermatitis, i.e., spontaneous hypersensitivity to the
parasite Ascaris suum, the intradermal antigen exposure triggers the immediate
degranulation of MCs, resulting in an early phase reaction (EPR), clinically manifested
as skin wheals (De Mora et al., 2006; Brazís et al., 2006; Torres et al., 2006; Torres et
al., 2003; Brazís et al., 1998; Queralt et al., 1998). The combined actions of newlysynthesized and preformed mediators released by MCs results in the subsequent
transcription of inflammatory cytokines and chemokines that ultimately drive the
recruitment of inflammatory cells to the site of antigen injection. This process is known
98
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
as the late phase reaction (LPR) and can become chronic (Metz et al., 2008; Olivry et
al., 2001). We have recently found that a single oral dose of PEA (10 mg/kg) reduced
significantly the antigen-induced skin wheal reaction in hypersensitive Beagle dogs
(Cerrato et al., 2012). Moreover, the repeated administration of PEA (5 and 10 mg/kg,
intraperitoneal) has been shown to play a protective role against inflammation in
experimental allergic dermatitis (Petrosino et al., 2010). Unlike PEA, which is a highly
lipophilic compound, adelmidrol is more suited to topical application, because exhibits
both hydrophilic and lipophilic features (i.e., amphipathic properties), which facilitates
its absorbtion into the skin, whose epidermis is composed of alternating lipophilic and
hydrophilic layers. A 4-week topical treatment with adelmidrol 2% emulsion in children
affected by mild atopic dermatitis resulted in complete resolution in 80% of cases, with
no side effects and no relapses at 8-week follow up (Pulvirenti et al., 2007). In the last
decades, the use of topical therapy in veterinary dermatology has increased and is
especially recommended for localized allergic skin lesions, where it is currently
regarded as a sole therapy or an adjunctive therapy minimizing the need for systemic
treatments (Olivry et al., 2010; Rosenkrantz, 2006). Based on the aforementioned
background, the aim of the present study was to investigate whether, similar to PEA
(Cerrato et al., 2012), adelmidrol was able to limit the inflammatory allergic response
upon topical application.
3.3. Material and methods
3.3.1. Drugs, Chemicals, and Reagents
Adelmidrol (2%) and vehicle emulsions were purchased by Innovet (Milano,
Italy). A. suum extract was purchased from Greer Laboratories (Lenoir, NC, United
States). Evans blue dye and histamine diphosphate salt were obtained from SigmaAldrich (St. Louis, MD, United States).
99
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
3.3.2. Animals
Six spontaneously hypersensitive Beagle dogs (four females and two males)
with mean body weights of 15.2 ± 0.7 kg were used in this study. No drugs or
additional treatments were given during the study, except sedatives, administered
prior to obtaining the biopsies. All experiments and procedures were performed in
accordance with European regulations governing the care and treatment of laboratory
animals and were approved by the Animal Care and Use Committee of the Universitat
Autònoma de Barcelona.
3.3.3. Experimental protocol
The method used was based on measurement of the inhibition of the wheal
area induced, in the right and left shaved lateral thoracic areas (25 cm2 per area) of
dogs, by intradermal injections of an A. suum extract solution (0.01% w/v), before and
after treatments. Topical solutions (4 mL) of adelmidrol 2% and vehicle were applied
three times a day for 8 consecutive days in the injected areas. In order to better
visualize wheal areas, a 2% w/v Evans blue dye solution in saline was given
intravenously (0.4 mL/kg) 30 min before each antigen injection. Three challenges were
performed, before (first challenge), on the 4th day (second challenge) and the 7th day
(third challenge) of treatment, using a Hamilton syringe (type 701LT) (Hamilton
Company, Reno, NV, United States). The results from the first challenge (i.e.,
performed prior to treatment) were taken as the baseline response. Each intradermal
antigen challenge was performed 10 minutes before the second daily treatment
application (Fig. 1). Histamine (0.001% w/v) and saline were also injected, as positive
and negative controls, respectively.
100
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Figure 1. Schematic representation of the study timeline.
3.3.4 Planimetry
Ten minutes after intradermal challenge with A. suum extract solution, wheal
areas were traced on an acetate sheet over the reaction site with indelible ink. Areas
were then analyzed with an image analyzer MIP 4 ADVANCED (Digital Image System,
Barcelona, Spain).
3.3.5. Collection of skin biopsy specimens
Twenty-four hours after the third challenge, dogs received a local anaesthesia
consisting of a subcutaneous injection of lidocaine (2%) without adrenaline, and two 6mm punch skin biopsies (i.e., adelmidrol- and vehicle-treated side) were collected at
injection sites.
101
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
3.3.6. Histopathology
All biopsy specimens were fixed in neutral buffered formalin and embedded in
paraffin for routine processing. Five μm sections were stained with haematoxylin-eosin
and toluidine blue (to visualize MC metachromatic granules). Dermis oedema and cell
recruitment were graded semiquantitatively on an arbitrary scale [i.e., -/+ (0-1 cell); ++
(1-3 cells); +++ (3-6 cells); ++++ (>6 cells)], on a x400 total magnification microscope. In
particular, MC counts (per unit area) were determined on six randomly selected
sections for each of the 3 different dermal layers, identified according to the known
vascular plexuses subdivision in the skin, i.e., superficial (just beneath the epidermis),
middle (around middle portions of hair follicles and sebaceous glands) and deep
dermis (around the inferior portion of hair follicles and dermis/subcutis interface).
Histological slides were read blindly with respect to treatment.
3.3.7. Data analysis
To guarantee test reproducibility all experiments were performed by the same
investigator blinded to the animal’s treatment. Wheal areas were expressed in mm2 as
means ± standard error of the mean (mean ± SEM). Response variability in wheal areas
was analyzed using the coefficient of variation (CV) before starting the treatments.
Results were expressed as the percentage of inhibition observed for each challenge,
comparing the antigen wheal area obtained in the same dog in the adelmidrol-treated
side or vehicle-treated side versus the areas obtained at baseline (t0). Wheal inhibition
was calculated with the following formula,
%
100
where t0 area corresponds to baseline value and tn area is the area after adelmidrol or
vehicle application, at a given time.
102
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Differences between means were analyzed using an ANOVA test for paired measures
and a Tukey’s multiple comparison post-hoc test. Statistical significance was set at
P<0.05 and P<0.01.
Differences between MC numbers were compared using the Student’s t-test for paired
data with a level of significance of P< 0.05 and P< 0.01.
Compliance with conditions for applying the aforementioned tests was verified with
the Kolmogorov-Smirnov normality test.
3.4. Results
3.4.1. Macroscopic findings
In order to assess the repeatability of wheal area measure over time, wheal
areas induced by subsequent A. suum extract injections in each dog were studied.
Despite the differences observed between dogs (CV > 10%), no within-dog differences
were observed (CV < 5%). For this reason, the adelmidrol inhibitory effect in each dog
was calculated from its own basal value.
Figure 2 shows the mean inhibition percentage of wheal areas induced in
hypersensitve Beagle dogs by A. suum extract before and after 3 and 6 consecutive
days of topical treatment of adelmidrol or vehicle, in comparison with baseline wheal
areas. After 3 and 6 days of topical adelmidrol treatment, a statistically significant
reduction in wheal areas was observed (p = 0.001 and p = 0.003), reaching an inhibition
of 19.9 ± 2.5 and 36.8 ± 3.5%, respectively. The difference between the adelmidrol
inhibitory effect observed on day 4 and 7 was statistically significant (p = 0.025).
Conversely, the vehicle did not exert any significant effect on the wheal formation at
any time (p = 0.054 and p = 0.3, at the the two observation times respectively) (Fig. 2).
103
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Wheal Inhibition (%)
50
VEHICLE
ADELMIDROL
40
**
30
**
20
10
0
0
2
4
6
8
time (days)
Figure 2. Mean inhibition percentage (± SEM) (n=6) of wheal areas induced in conscious
hypersensitive Beagle dogs by A. suum extract observed before, on the 4th and 7th day of
treatment with adelmidrol 2% or vehicle. **P<0.01
3.4.2. Microscopic findings
Twenty-four hours after the third intradermal allergen challenge (i.e., 8 days
after starting treatment) a skin biopsy from each treatment side was obtained and the
inflammatory reaction was histologically evaluated. The analysis revealed that oedema
was evident within the vehicle-treated area in all 6 cases, while only 2 out of 6 dogs
presented oedema in the adelmidrol-treated side. Furthermore, in the adelmidroltreated side a slight, albeit not statistically significant, reduction in the recruitment of
eosinophils, lymphocytes, monocytes and neutrophils was observed compared to the
vehicle-treated side. Mast cell numbers decreased in almost all biopsies after
treatment and for this reason a more accurately quantification was performed.
Using toluidine blue staining for dermal MC counts, a highly significant
reduction was observed in the adelmidrol-treated side (p = 0.0003) (Fig. 3).
Quantitative evaluation of MCs in the three different dermal layers that were studied
104
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
(i.e., superficial, middle and deep dermis)
dermis) revealed a significant decrease in MC
numbers in the adelmidrol-treated side compared to the vehicle-treated side (Table 1).
Figure 3. Mast cells obtained from Beagle skin biopsies after toluidine blue staining (black
arrows). Histological sections from the vehicle-treated side (a) and adelmidrol-treated side (b).
Table 1. Quantification of mast cells (3 fields of 400X) in biopsies collected after topical
vehicle and 2% adelmidrol treatment.
Mast cell number
Vehicle
Adelmidrol
(Mean ± SEM)
(Mean ± SEM)
Superficial
6.6 ± 1.1
3.8 ± 0.6
0.03
Middle
2.9 ± 0.6
1.1 ± 0.3
0.02
Deep
1.3 ± 0.3
0.4 ± 0.2
0.01
P-value
Area observed
3.5. Discussion
The present study shows, for the first time, that adelmidrol effects are evident
in both the EPR and LPR in spontaneous hypersensitive Beagle dogs after intradermal
antigen challenge. Topical treatment with adelmidrol (2%) for 3 and 6 consecutive days
resulted in a significantly reduced skin wheal response compared to baseline values.
Conversely, the vehicle-treated side did not show any significant wheal reduction at
105
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
any treatment time, thus confirming, albeit indirectly, the lack of systemic absorption
of adelmidrol after topical application.
3.5.1. Magnitude of the inhibitory effect on skin wheal
Adelmidrol topical application inhibited wheal formation by about 20 and 37%,
after 3 and 6 days of treatment, respectively. Results were of about the same
magnitude as those observed in a previous study performed with a single oral dose of
the aliamide parent molecule PEA in hypersensitive Beagle dogs (Cerrato et al., 2012).
The administration of PEA before intradermal antigen challenge resulted in a
significant 29 and 32% reduction in wheal area, respectively, with doses of 10 and 30
mg/Kg (Cerrato et al., 2012).
A number of studies on the inhibitory effects of different drugs on skin wheal
response in dogs have been published. The key findings are summarized in Table 2.
The effect of corticosteroids (both oral or topical) on intradermally-induced skin wheal
ranges from lack of effect (Pucheu-Hatson et al., 2006; Thomas et al., 1999) up to 45%
inhibition (Temizel et al., 2011; Ginel et al., 2007; DeBoer and Cooley, 2000; Rivierre et
al., 2000), with the only exception of one single study (72% inhibition rate) (Bizikova et
al., 2010). Interestingly, similar results are observed in allergic human patients (i.e., 3040% inhibition) (Andersson and Pipkorn, 1987), and better outcomes are known to
occur with longer treatment (Pipkorn et al., 1989). The inhibitory effect of oral
antihistamines on antigen-induced skin wheal in dogs is on average 50% (Temizel et al.,
2011; Queralt et al., 1998), with obviously better results with histamine challenge
(Merlos et al., 1997; Queralt et al., 1996) (Table 2). Interestingly, topically applied
sodium cromoglycate (i.e., a MC stabilizer agent) inhibits the skin wheal in atopic
human patients by only 27% (Edwards et al., 2011).
106
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Table 2. Main studies on the inhibition of skin wheal response in dogs - key findings.
Administration
route
Treatment
time
Wheal
inhibition
vs baseline
Oral
Twice daily
for 3 days
No effect
(PucheuHaston et al.,
2006)
Topical
(conditioner)
Twice
weekly for 6
weeks
No effect
(Thomas et al.,
1999)
Corticosteroids
(betamethasone)
Topical
(otic preparation)
Twice daily
for 2 weeks
5.9%
(Ginel et al.,
2007)
D. farinae
Corticosteroids
(betamethasone)
Topical
(otic preparation)
Twice daily
for 2 weeks
9%
(Ginel et al.,
2007)
Healthy Beagle
dogs
Cynodon
dactylon
Corticosteroids
(betamethasone)
Topical
(otic preparation)
Twice daily
for 2 weeks
9.8%
(Ginel et al.,
2007)
Healthy Beagle
dogs
Anti-canine
IgE
Corticosteroids
(hydrocortisone 1%)
Topical
(conditioner)
3 days
14% (*)
(Rivierre et al.,
2000)
Healthy dogs
Anti-canine
IgE
(different
dilutions)
Corticosteroids
(triamcinolone)
Topical (solution)
7 days
24-45% (§)
depending on
the stimulus
concentration
(DeBoer and
Cooley, 2000)
Healthy mixed
breed dogs
D. farinae
Corticosteroids
(prednisone)
Oral
7 days
41%
(Temizel et al.,
2011)
Atopic MalteseBeagle crossbreed dogs
Anti-canine
IgE
Corticosteroids
(hydrocortisone
aceponate)
Topical
(spray)
7 days
72%
(Bizikova et al.,
2010)
Healthy mixed
breed dogs
D. farinae
Antihistamines
(cetrizine)
Oral
14 days
Spontaneously
Ascaris
hypersensitive
Beagle dogs
Ascaris
suum
Antihistamines
(rupatadine)
Oral
Spontaneously
Ascaris
hypersensitive
Beagle dogs
Ascaris
suum
Antihistamines
(loratadine)
Oral
Subjects
Intradermal
challenge
Healthy Beagle
dogs
Anti-canine
IgE
Corticosteroids
(prednisolone)
Dogs with pruritic
dermatitis
Histamine
(5 different
dilutions)
Corticosteroids
(hydrocortisone 1%)
Healthy Beagle
dogs
Histamine
Healthy Beagle
dogs
Drug
107
Ref
49%
(Temizel et al.,
2011)
Single pretreatment
dose
35, 67 and
84% (#)
(Queralt et al.,
1998)
Single pretreatment
dose
34, 61 and
66% (#)
(Queralt et al.,
1998)
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Healthy Beagle
dogs
PAF
Antihistamines
(rupatadine)
Oral
Single pretreatment
dose
30% to 45%
(¥)
(Merlos et al.,
1997)
Healthy Beagle
dogs
Histamine
Antihistamines
(rupatadine)
Oral
Single pretreatment
dose
50% to 80%
(¥)
(Merlos et al.,
1997)
Histamine
Antihistamines
(cetrizine, loratadine,
rupatadine,
levocabastine)
Oral
Single pretreatment
dose
70% to 80%
(**)
(Queralt et al.,
1996)
Histamine
Antihistamines
(cetrizine, loratadine,
rupatadine,
levocabastine)
Oral
Single pretreatment
dose
70% to 80%
(**)
(Queralt et al.,
1996)
Healthy Beagle
dogs
Healthy Beagle
dogs
(*) versus placebo group; (§) versus vehicle-treated side; (#) peak activity at 0.1, 1 and 10 mg/Kg respectively, 2 to
4h after administration; (¥) peak activity, 4h after administration, depending on the dose; (**) peak activity, 4h after
administration, depending on the compound and the dose.
On the whole, one may consider wheal inhibition by topically applied
adelmidrol to be almost the same order of magnitude as that of topical corticosteroids
and lower than the value achieved after oral administration of antihistamines, whose
clinical validity and utility remain doubtful (Olivry et al., 2010). Moreover, similarly to
corticosteroids, treatment time could be a crucial factor (Pipkorn et al., 1989) and
longer treatment with topical adelmidrol (i.e., over 7 days) could increase the effect
size.
3.5.2. The purported mechanism involves mast cell control
Mast cells are considered to be major players of EPR (Galli and Tsai, 2010 ; Metz
and Maurer, 2009; Brown et al., 2008). Within minutes of antigen exposure, they
rapidly secrete performed mediators (e.g., histamine, tryptase, chymase) and
membrane-derived eicosanoids leading to the so-called ‘wheal and flare’ reaction of
the skin (Galli and Tsai, 2012; Bischoff, 2007). The ability of aliamides (to whose family
the tested compound belongs) to down-modulate the release of bioactive mediators
108
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
from MCs (Cerrato et al., 2010; De Filippis et al., 2009; Abramo et al., 2008) may thus
represent the mechanism of the inhibitory effect on wheal areas, observed in the
present study. Indeed, adelmidrol can down-modulate skin MC degranulation both
during pathophysiological canine conditions (Abramo et al., 2008) and in experimental
chronic inflammation (De Filippis et al., 2009). Moreover, the significant increase in the
percentage inhibition of wheal area observed from the 4th to 7th day of treatment
(from about 20 to 37% inhibition) may depend on the purported mechanism of action
of the compound, i.e. the down-modulation of hyperactive skin MCs (De Filippis et al.,
2009; Abramo et al., 2008), which represents an endogenous tuning mechanism - and
thus a gradual, progressive phenomenon - rather than an immediate ‘pharmacological’
switch-off effect (Levi-Montalcini et al., 1996).
The present study also demonstrates the inhibitory effect of adelmidrol on the
increased MC number observed 24 h after the last antigen challenge (corresponding to
the end of the 8-day-treatment). Indeed, the adelmidrol-treated side showed 42%,
62% and 69% less MCs in the superficial, middle and deep dermis respectively,
compared to the vehicle-treated side. Although the baseline data are missing (the
study was not designed to have t0 biopsies), this finding suggests that adelmidrol
limited the LPR by decreasing skin MC hyperplasia following antigen challenge. Thus,
both the functional and quantitative control of MCs might explain the observed antiallergic effect of the topical treatment with adelmidrol. Indeed, similar findings
emerged from a study on a model of chronic inflammation, where the local
administration of adelmidrol both down-modulated MC degranulation and also
prevented numerical increase of MC numbers (De Filippis et al., 2009). Interestingly,
topical corticosteroids decrease MC numbers in humans (Cole et al., 2001), without
any apparent effect on dogs (Bizikova et al., 2010).
Whether the effect on MC number observed in the present study depends on
the inhibition of MC proliferation or maturation from progenitors, both resident and
recruited from circulation, could not be tested by the techniques used in here. Both
hypotheses may be possible, since the adelmidrol analogue PEA has been shown to (i)
down-modulate keratinocyte production of the inflammatory cytokines (Petrosino et
109
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
al., 2010), responsible for the recruitment of MCs (Romagnani et al., 2002); and (ii)
limit MC release of nerve growth factor (Cantarella et al., 2011), a neurotrophin that
promotes chemotaxis of MCs as well as their maturation and degranulation
(Kawamoto et al., 2002; Sawada et al., 2000; Levi-Monalcini et al., 1996). Moreover, a
recent study has shown the existence of an inhibitory ‘‘endocannabinoid tone’’ of skin
MC biology, with skin MCs utilizing endocannabinoid signaling to limit not only their
own activation/degranulation but also their maturation from resident progenitor cells
(Sugawara et al., 2012). This finding is particularly interesting since aliamides share
several aspects of their biochemistry, metabolism and pharmacology with
endocannabinoids
and
have
been
referred
to
as
endocannabinoid-like,
cannabimimetic compounds, or even indirect endocannabinoids (De Petrocellis and Di
Marzo, 2010; Bradshaw and Walker, 2005). Moreover, endocannabinoid receptors
(i.e., CB1 and CB2) have been discovered in the canine skin and found to increase in
diseased conditions, such as atopic dermatitis (Campora et al., 2012). Finally, one
should also consider that adelmidrol is a lipid amide and epidermal cells express the
respective degrading enzymes (e.g., fatty acid amide hydrolase) (Biro et al., 2009).
Thus topically applied adelmidrol can partially undergo enzymatic cleavage to release
azelaic acid, which in turn might contribute to the observed effect, lessening the
inflammatory phenotype of keratinocytes (Mastrofrancesco et al., 2010). Importantly,
no sign of irritation or any adverse effect was noticed during the present study.
3.5.3. Practical considerations
From a practical point of view, the present findings suggest that adelmidrol
could find a place in the management of hypersensitive skin disorders in the dog,
where topical treatments are currently preferred to systemic ones for localized lesions
characterizing the less severe stages of the disease. Alternatively, adelmidrol could be
applied as an adjunct to systemic treatments for a “dual-site action” in selected cases,
as suggested for more classical topical tools (Olivry et al., 2010). The most frequently
used topical treatments for canine allergic skin diseases are glucocorticoid
110
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
formulations and tacrolimus oinment. Both approaches are effective, even though
tacrolimus has a slow onset of action, and both exert adverse effects (i.e., mild
irritation, cutaneous atrophy, superficial follicular cysts, and increased susceptibility to
skin infection) that, although mild, can prejudice owner compliance and lengthen
recovery (Olivry et al., 2010).
3.6. Conclusions
Intradermal injection of allergic-inflammatory stimuli, with measurement of
immediate wheal reaction and later dermal cellular infiltrates has been considered a
useful technique for objectively documenting the anti-inflammatory effect of topical
preparations in dogs (DeBoer and Cooley, 2000). The present study evaluated the
effect of the topical daily application of the aliamide adelmidrol on the canine skin
response to intradermal allergen challenge and confirmed its anti-inflammatory effect.
In particular, the tested aliamide significantly reduced both EPR and LPR in
hypersensitive dogs. A significant decrease in acute inflammation response and MC
numbers was observed, without any sign of irritation or adverse effect. Even though
further and more detailed molecular studies are needed to confirm the results and
broaden knowledge on the mechanisms involved, the present findings suggest that
adelmidrol emulsion could represent a valuable and safe tool in the armamentarium
for canine inflammatory allergic skin disorders. The effects on wheal and MC numbers
provide a sound basis for an anti-inflammatory drug sparing effect, and predict
adelmidrol to be profitable combined with oral treatments for an optimal dual site
therapy, i.e. outside-inside approach, currently the most preferred route for managing
canine hypersensitive skin disorders (Olivry et al., 2010).
111
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
3.7. Competing interests
Alda Miolo is an employee of CeDIS (Science Information and Documentation
Centre), Innovet Italia srl. Maria Federica della Valle is a scientific consultant for the
same company. None of the other authors declare a conflict of interest.
3.8. Authors' contributions
SC and AP carried out the experiments and analyzed the data. AM and MFdV
participated in the design of the study and helped to draft the manuscript. AP and PB
conceived of the study, and participated in its design and coordination and helped to
draft the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.
3.9. Acknowledgements
This work was supported by Innovet Italia srl. The Authors are grateful to Dr.
Stephen D. Skaper (Dipartimento di Scienze del Farmaco, Università degli Studi di
Padova) for his valuable help in English-language editing, critical comments and greatly
appreciated scientific advice.
3.10. References
Abramo, F., Salluzzi, D., Leotta, R., Auxilia, S., Noli, C., Miolo, A., Mantis, P., Lloyd, D.H.;
2008. Mast Cell Morphometry and Densitometry in Experimental Skin Wounds Treated
With a Gel Containing Adelmidrol: A Placebo Controlled Study. Wounds 20, 149-157.
Aloe, L., Leon, A., Levi-Montalcini, R., 1993. A proposed autacoid mechanism
controlling mastocyte behaviour. Agents Actions 39 (Spec. No. C), 145–147.
Andersson, M., Pipkorn, U., 1987. Inhibition of the dermal immediate allergic reaction
through prolonged treatment with topical glucocorticosteroids. The Journal of Allergy
and Clinical Immunology 79, 345-349.
112
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Biro T, Toth BI, Hasko G, Paus R, Pacher P., 2009. The endocannabinoid system of the
skin in health and disease: novel perspectives and therapeutic opportunities. Trends in
Pharmacological Sciencis 30, 411-420.
Bischoff, S.C., 2007. Role of mast cells in allergic and non-allergic immune responses:
comparison of human and murine data. Nature Reviews. Immunology 7, 93-104.
Bizikova, P., Linder, K.E., Paps, J., Olivry, T., 2010. Effect of a novel topical diester
glucocorticoid spray on immediate- and late-phase cutaneous allergic reactions in
Maltese-beagle atopic dogs: a placebo-controlled study. Veterinary Dermatology 21,
70-79.
Bradshaw, H.B., Walker, J.M., 2005. The expanding field of cannabimimetic and related
lipid mediators. British Journal of Pharmacologoy 144, 459-465.
Brazís, P., Barandica, L., García, F., Clough, G.F., Church, M.K., Puigdemont, A., 2006.
Dermal microdialysis in the dog: in vivo assessment of the effect of cyclosporin A on
cutaneous histamine and prostaglandin D2 release. Veterinary Dermatology 17, 169174.
Brazis, P., Queralt, M., de Mora, F., Ferrer, L., Puigdemont, A., 1998. Comparative study
of histamine release from skin mast cells dispersed from atopic, ascaris-sensitive and
healthy dogs. Veterinary Immunology and Immunopatholology 66, 43-51.
Brown, J.M., Wilson, T.M., Metcalfe, D.D., 2008. The mast cell and allergic diseases:
role in pathogenesis and implications for therapy. Clinical and Experimental Allergy 38,
4-18.
Campora, L., Miragliotta, V., Ricci, E., Cristino, L., Di Marzo, V., Albanese, F., della Valle,
M.F., Abramo, F., 2012. Cannabinoid receptor type 1 and 2 expression in the skin of
healthy dogs and dogs with atopic dermatitis. American Journal of Veterinary Research
73, 988-995.
Cantarella, G., Scollo, M., Lempereur, L., Saccani-Jotti, G., Basile, F., Bernardini, R.,
2011. Endocannabinoids inhibit release of nerve growth factor by inflammationactivated mast cells. Biochemical Pharmacology 4:380-388.
Cerrato, S., Brazis, P., della Valle, M.F., Miolo, A., Petrosino, S., Marzo, V.D.,
Puigdemont, A., 2012. Effects of palmitoyethanolamide on the cutaneous allergic
inflammatory response in Ascaris hypersensitive Beagle dogs. Veterinary Journal 191,
377-382.
113
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Cerrato, S., Brazis, P., della Valle, M.F., Miolo, A., Puigdemont, A., 2010. Effects of
palmitoylethanolamide on immunologically induced histamine, PGD2 and TNFα release
from canine skin mast cells. Veterinary Immunolology and Immunopathology 133, 915.
Cole, Z.A., Clough, G.F., Church, M.K., 2001. Inhibition by glucocorticoids of the mast
cell-dependent weal and flare response in human skin in vivo. British Journal of
Pharmacology 132, 286-292.
Costa, B., Comelli, F., Bettoni, I., Colleoni, M.P., Giagnoni, G., 2008. The endogenous
fatty acid amide, palmitoylethanolamide, has anti-allodynic and anti-hyperalgesic
effects in a murine model of neuropathic pain: involvement of CB1, TRPV1 and
PPARgamma receptors and neurotrophic factors. Pain 139, 541-550.
DeBoer, D.J., Cooley, A.J., 2000. Use of induced cutaneous immediate-type
hypersensitivity reactions to evaluate anti-inflammatory effects of triamcinolone
topical solution in three dogs. Veterinary Dermatology 11, 25-33.
De Filippis, D., Luongo, L., Cipriano, M., Palazzo, E., Cinelli, M.P., de Novellis, V.,
Maione, S., Iuvone, T., 2011. Palmitoylethanolamide reduces granuloma-induced
hyperalgesia by modulation of mast cell activation in rats. Molecular Pain 7, 3.
De Filippis, D., D’Amico, A., Cinelli, M.P., Esposito, G., Di Marzo, V., Iuvone, T., 2009.
Adelmidrol, a palmitoyethanolamide analogue, reduces chronic inflammation in a
carrageenin-granuloma model in rats. Journal of Cellular and Molecular Medecine 13,
1086-1095.
De Filippis, D., D’Amico, A., Iuvone, T., 2008. Cannabinomimetic control of mast cell
mediator release: new perspective in chronic inflammation. Journal of
Neuroendrocrinology 20 (Suppl.1), 20–25.
De Mora, F., Puigdemont, A., Torres, R., 2006. The role of mast cells in atopy: what can
we learn from canine models? A thorough review of the biology of mast cells in canine
and human systems. The British Journal of Dermatology 155, 1109-1123.
De Petrocellis, L., Di Marzo, V., 2010. Non-CB(1), Non-CB(2) Receptors for
Endocannabinoids, Plant Cannabinoids, and Synthetic Cannabimimetics: Focus on Gprotein-coupled Receptors and Transient Receptor Potential Channels. Journal of
Neuroimmune Pharmacology 5, 103-21.
Edwards, A.M., Stevens, M.T., Church, M.K., 2011. The effects of topical sodium
cromoglicate on itch and flare in human skin induced by intradermal histamine: a
114
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
randomised double-blind vehicle controlled intra-subject design trial. BMC Research
Notes 4, 47.
Esposito, E., Paterniti, I., Mazzon, E., Genovese, T., Di Paola, R., Galuppo, M.,
Cuzzocrea, S., 2011. Effects of palmitoylethanolamide on release of mast cell
peptidases and neurotrophic factors after spinal cord injury. Brain, Behavior, and
Immunty 6, 1099-1112.
Galli, S.J., Tsai, M., 2012. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medecine 18,
693-704.
Galli, S.J., Tsai, M., 2010. Mast cells in allergy and infection: Versatile effector and
regulatory cells in innate and adaptive immunity. European Journal of Immunology 40,
1843-1851.
Genovese, T., Esposito, E., Mazzon, E., Di Paola, R., Meli, R., Bramanti, P., Piomeli, D.,
Calignano, A., Cuzzocrea, S. Effects of palmitoylethanolamide on signaling pathways
implicated in the development of spinal cord injury. The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics 326, 12-23.
Ginel, P.J., Garrido, C., Lucena, R., 2007. Effects of otic betamethasone on intradermal
testing in normal dogs. Veterinary Dermatology 18, 205-210.
Jack, D.B., 1996. Aliamides: a new approach to the treatment of inflammation. Drug
News and Perspectives 9, 93–98.
Kawamoto, K., Aoki, J., Tanaka, A., Itakura, A., Hosono, H., Arai, H., Kiso, Y., Matsuda,
H., 2002. Nerve growth factor activates mast cells through the collaborative interaction
with lysophosphatidylserine expressed on the membrane surface of activated
platelets. Journal of Immunology 168, 6412-9.
Keppel Hesselink, J.M., 2012. New Targets in pain, non-neuronal cells, and the role of
palmitoylethanolamide. Mini-Review.The Open Pain Journal 5, 12-23.
Kleinschmidt, S., Meneses, F., Nolte, I., Hewicker-Trautwein, M., 2008. Distribution of
mast cell subtypes and immune cell populations in canine intestines: Evidence for agerelated decline in T cells and macrophages and increase of IgA-positive plasma cells.
Research in Veterinary Science 84, 41-48.
Levi-Montalcini, R., Skaper, S.D., Dal Toso, R., Petrelli, L., Leon, A., 1996. Nerve growth
factor: from neurotrophin to neurokine. Trends in Neurosciencis 19, 514-520.
115
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Lo Verme, J., Fu, J., Astarita, G., La Rana, G., Russo, R., Calignano, A., Piomelli, D., 2005.
The nuclear receptor PPAR-a mediates the antiinflammatory actions of
palmitoylethanolamide. Molecular Pharmacology 67, 15–19.
Luongo, L., Guida, F., Gatta, L., de Novellis, V., Maione, S., 2011.
Palmitoylethanolamide systemic treatment reduces spinal and supraspinal formalininduced neuroinflammation and allodynia. Shock 36(suppl1), 22.
Mastrofrancesco, A., Ottaviani, M., Aspite, N., Cardinali, G., Izzo, E., Graupe, K.,
Zouboulis, C.C., Camera, E., Picardo, M., 2010. Azelaic acid modulates the
inflammatory response in normal human keratinocytes through PPARgamma
activation. Experimental Dermatology 19, 813-820.
Merlos, M., Giral, M., Balsa, D., Ferrando, R., Queralt, M., Puigdemont, A., GarciaRafanell, J., Forn, J., 1997. Rupatadine, a new potent, orally active dual antagonist of
histamine and platelet-activating factor (PAF). The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics 280, 114-121.
Metz, M., Maurer, M., 2009. Innate immunity and allergy in the skin. Current Opinion
in Immunology 21, 1-7.
Metz, M., Siebenhaar, F., Maurer, M., 2008. Mast cell functions in the innate skin
immune system. Immunobiology 213, 251-260.
Nazzaro-Porro, M., 1987. Azelaic acid. Journal of the American Academy of
Dermatology 17, 1033-1041.
Olivry T, DeBoer DJ, Favrot C, Jackson HA, Mueller RS, Nuttall T, Prélaud P;
International Task Force on Canine Atopic Dermatitis., 2010. Treatment of canine
atopic dermatitis: 2010 clinical practice guidelines from the International Task Force on
Canine Atopic Dermatitis. Veterinary Dermatology 21, 233-48.
Olivry, T., Dunston, S.M., Murphy, K.M., Moore, P.F., 2001. Characterization of the
inflammatory infiltrate during IgE-mediated late phase reactions in the skin of normal
and atopic dogs. Veterinary Dermatology 12, 49-58.
Petrosino, S., Cristino, L., Karsak, M., Gaffal, E., Udea, N., Tüting, T., Bisogno, T., De
Filippis, D., D’Amico, A., Saturnino, C., Orlando, P., Zimmer, A., Iuvone, T., Di Marzo, V.,
2010. Protective role of palmitoylethanolamide in contact allergic dermatitis. Allergy
65, 698-711.
Pipkorn, U., Hammarlund, A., Enerback, L., 1989. Prolonged treatment with topical
glucocorticoids results in an inhibition of the allergen-induced weal-and-flare response
116
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
and a reduction in skin mast cell numbers and histamine content. Clinical and
Experimental Allergy 19, 19-25.
Pucheu-Haston, C.M., Shuster, D., Olivry, T., Brianceau, P., Lockwood, P., McClanahan,
T., de Waal Malefyt, R., Mattson, J.D., Hammerberg, B., 2006. A canine model of
cutaneous late-phase reactions: prednisolone inhibition of cellular and cytokine
responses. Immunology 117, 177-187.
Pulvirenti, N., Nasca, M.R., Micali, G. 2007. Topical adelmidrol 2% emulsion, a novel
aliamide, in the treatment of mild atopic dermatitis in pediatric subjects: a pilot study.
Acta Dermatovenerologica Croatica, 15, 80-83.
Queralt, M., Brazis, P., Merlos, M., Puigdemont, A., 1998. Inhibitory effects of
rupatadine on mast cell histamine release and skin wheal development induced by
Ascaris suum in hypersensitive dogs. Drug Development Research 44, 49-55.
Queralt, M., Merlos, M., Giral, M., Puigdemont, A., 1996. Dual effect of a new
compound, rupatadine, on edema induced by platelet-activating factor and histamine
in dogs: comparison with antihistamines and PAF antagonists. Drugs Development
Research 39, 12-18
Re, G., Barbero, R., Miolo, A., Di Marzo, V., 2007. Palmitoylethanolamide,
endocannabinoids and related cannabimimetic compounds in protection against tissue
inflammation and pain: potential use in companion animals. Veterinary Journal 173,
23-32.
Rivierre C, Dunston SM, Olivry T: Effects of a 1 per cent hydrocortisone conditioner on
the prevention of immediate and late-phase reactions in canine skin. Vet Rec 2000,
147:739-742.
Romagnani, S., 2002. Cytokines and chemoattractants in allergic inflammation.
Molecular Immunology 38, 881-885.
Rosenkrantz, W., 2006. Practical applications of topical therapy for allergic, infectious,
and seborrheic disorders. Clinical Techniques in Small Animal Practice 21, 106-116.
Sasso, O., Russo, R., Vitiello, S., Mattace Raso G., D'Agostino, G., Iacono, A., La Rana, G.,
Vallée, M., Cuzzocrea, S., Piazza, P.V., Meli, R., Calignano, A., 2012. Implication of
allopregnanolone in the antinociceptive effect of N-palmitoylethanolamide in acute or
persisten pain. Pain 153, 33-41.
117
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Sawada, J., A. Itakura, A. Tanaka, T. Furusaka, Matsuda, H., 2000. Nervegrowth factor
functions as a chemoattractant for mast cells through both mitogenactivated protein
kinase and phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathways. Blood 95, 2052–2058.
Su, M., Chi, E.Y., Bishop, M.J., Henderson, W.R. Jr., 1993. Lung mast cells increase in
number and degranulate during pulmonary artery occlusion/reperfusion injury in dogs.
The American Review of Respiratory Disease 147, 448-456.
Sugawara, K., Biró, T., Tsuruta, D., Tóth, B.I., Kromminga, A., Zákány, N., Zimmer, A.,
Funk, W., Gibbs, B.F., Zimmer, A., Paus, R., 2012. Endocannabinoids limit excessive
mast cell maturation and activation in human skin. The Journal of Allergy and Clinical
Immunology 129, 726-738.
Temizel, E.M., Cihan, H., Akhtardanesh, B., Aytug, N., 2011. Effect of prednisolone and
cetirizine on D. farinae and histamine-induced wheal and flare response in healthy
dogs. Tierärztliche Praxis Kleintiere. Ausgabe K, Kleintiere/Heimtiere 39, 25-30.
Thomas, R.C., Logas, D., Radosta, L., Harrison, J. Effects of a 1% hydrocortisone
conditioner on haematological and biochemical parameters, adrenal function testing
and cutaneous reactivity to histamine in normal and pruritic dogs. Veterinary
Dermatology 10, 109-116.
Torres, R., Grifols, J., Fondevila, D., de Mora, F., 2003. Dermal exposure to Ag induces
sensitization and inflammation, in addition to the immediate response, in the Ascaris
suum-hypersensitive dog model of skin allergy. Allergy 58 (Suppl. 74), 262. (Abstract
from XXII EAACI Congress, 2003, Paris, France).
Torres, R., Grifols, J., Marco, A., de Mora, F., 2006. Sensitization of naive beagles by
intradermal injection of an ascaris antigen: induction of a model of skin allergy.
Immunopharmacology and Immunotoxicology 28, 697-702.
Truini, A., Biasiotta, A., Di Stefano, G., Cesa, S.L., Leone, C., Cartoni, C., Federico, V.,
Petrucci, M.T., Cruccu, G., 2011. Palmitoylethanolamide Restores Myelinated-Fibre
Function in Patients with Chemotherapy-Induced Painful Neuropathy. CNS and
Neurological Disorders and Drug Targets 10, 916-920.
von Ruedorffer, U., Fisch, R., Peel, J., Roosje, P., Griot-Wenk, M., Welle, M., 2003. Flea
bite hypersensitivity: new aspects on the involvement of mast cells. Veterinary Journal
165, 149-156.
Wise, L.E., Cannavacciulo, R., Cravatt, B.F., Marun, B.F., Lichtman, A.H., 2008.
Evaluation of fatty acid amides in the carrageenan-induced paw edema model.
Neuropharmacology 54, 181-188.
118
CAPÍTOL 3 / CHAPTER 3
Woldemeskel, M., Rajeev, S., 2010. Mast cells in canine cutaneous hemangioma,
hemangiosarcoma and mammary tumors. Veterinary Research Communications 34,
153-160.
119
120
V. DISCUSSIÓ GENERAL
121
122
DISCUSSIÓ GENERAL
V. DISCUSSIÓ GENERAL
5.1. La PEA, els MCs i el seu mecanisme d’acció
El paper que desenvolupen els MCs en l’orquestració tant de les reaccions
al·lèrgiques com dels processos inflamatoris crònics és ben conegut. Un dels principals
objectius de la recerca farmacològica és el control d’aquest procés. Entre els
tractaments clàssics dels trastorns al·lèrgics podem trobar el cromoglicat disòdic, que
actua inhibint la degranulació dels MCs, els antihistamínics i els antileucotriens, que
contrarestant els efectes biològics de certs mediadors alliberats. També els
glucocorticoides són efectius en el control dels efectes biològics produïts pel
mediadors alliberats pels MCs, però presenten un gran nombre d’efectes secundaris
adversos, i en el cas d’aquests últims, fins i tot, poden comportar un risc
d’immunosupressió del individu. Per tant, actualment la recerca farmacològica es
centra en el desenvolupament de nous fàrmacs que actuïn modulant l’activitat dels
MCs més que no pas blocant-la, ja que els MCs desenvolupen a més, un paper
fisiològic i homeostàtic (De Filippis et al., 2013).
En aquest sentit, la identificació l’any 1992 de l’AEA com el primer eCB va
reviure el interès sobre una família de compostos lipídics amb activitat antiinflamatòria
que es coneixien ja des dels anys 1950 i a la qual pertany: les NAEs. Aquests
compostos, entre els que trobem la PEA, es suggereix que representen una via de
senyalització cel·lular evolutivament conservada, ja que els seus processos de síntesi i
degradació apareixen funcionalment tant en animals com en plantes (Chapman, 2004;
Schmid i Berdyshev, 2002). Per tant, això demostra la importància d’aquest tipus de
compostos en les vies de regulació cel·lular tal i com per exemple diferents estudis
consideren la PEA com un modulador endogen de l’activació dels MCs.
Aquest fet està en consonància amb els resultats obtinguts amb el primer
estudi (Cerrato et al., 2010), on diferents concentracions de PEA entre 10-5 M i 10-6 M
van inhibir de forma significativa l’alliberació d’histamina (54%), PGD2 (26%) i TNFα
(29%), després de l’activació immunològica de MCs cutanis canins amb anti-IgE.
123
DISCUSSIÓ GENERAL
En la mateixa línia, el primer estudi in vitro que demostrava la capacitat de la
PEA per modular l’activació dels MCs es va publicar per Facci et al. (1995). Aquest
estudi mostrava que la PEA, a una concentració de 2.7 x 10-4 M, inhibia un 50% la
degranulació de serotonina en la línia cel·lular RHL-2H3, després d’estimular-la amb IgE
contra l’haptè de dinitrofenol. El mateix grup en un segon estudi, va corroborar
l’efecte de la PEA sobre l’activació del MCs. Així doncs, la PEA, a una concentració de 3
x 10-2 M, va ser capaç de reduir la mort neuronal causada per l’activació dels MCs, en
cultius mixtes de neurones del hipocamp i MCs peritoneals de rata, mentre no es va
observar efecte sobre la mort neuronal causada per l’activació dels astròcits en
absència dels MCs (Skaper et al., 1996).
No obstant, altres estudis indiquen que la PEA no té efectes sobre la modulació
en l’activació del MCs. Així, Maccarrone et al. (2000) van mostrar que la PEA, a la
concentració de 10-2 M, no tenia cap efecte sobre la degranulació espontània de
triptasa o induïda a través del ionòfor A23187, en la línia cel·lular de mastòcits humans
HMC-1.
Per altra banda, un altre estudi amb cèl·lules RBL-2H3 immunològicament
estimulades amb IgE contra l’haptè de dinitrofenol, va mostrar com la PEA a la
concentració de 0.1 M només produïda una lleugera inhibició de l’alliberació de
serotonina i β-hexosaminidasa, mentre que no tenia efecte sobre l’alliberació de TNFα
(Granberg et al., 2001). Resultats similars es van obtenir amb MCs peritoneals de rata,
on la PEA a les concentracions entre 10-5 i 10-8 M no van alterar l’alliberació espontània
d’histamina o induïda per anit-IgE (Lau i Chow, 2003).
Contràriament a les observacions realitzades en les cèl·lules HMC-1, un estudi
recent ha mostrat que la PEA a les concentracions entre 4 x 10-3 i 4 x 10-5 M inhibien
l’alliberació del NGF en més d’un 50% després d’estimular els MCs durant 24h amb
miristat acetat de forbol (Cantarella et al., 2011).
Aquestes discrepàncies es poden explicar en part per limitacions existents en la
caracterització funcional de les diferents línies cel·lulars i dels MCs aïllats de diferents
teixits, més que no pas de les limitacions existents en els estudis in vitro en front dels
estudis amb models animals. Doncs per exemple, la línia cel·lular de MCs humans
124
DISCUSSIÓ GENERAL
HMC-1, no expressa receptors CBs funcionals, mentre que els MCs de rata sí, cosa que
en certa mesura podria condicionar la seva resposta davant estímuls concrets durant
els tractaments amb PEA. Per altra banda, existeix un cert grau d’heterogeneïtat entre
els MCs aïllats de diferents teixits respecte a la morfologia, expressió de proteïnes
(com per exemple la triptasa i quimasa), i un diferent grau de sensibilitat en front
diferents estímuls immunològics i no immunològics, com per exemple s’ha observat en
humans, en que els MCs aïllats de la pell poden ser activats per antigen, compost
48/80 i substància P, mentre que els MCs aïllats del sinus nassals només són activats
per estímuls antigènics (Galli et al., 1993).
Malgrat les discrepàncies observades en els estudis in vitro on s’ha estudiat
l’acció farmacològica de la PEA, els resultats obtinguts han estat una eina clau en el
desenvolupament del coneixement del mecanisme d’acció que hi ha darrera de les ben
conegudes propietats de la PEA contra la inflamació i el dolor. Així doncs en els darrers
anys s’han proposat diferents mecanismes per explicar els efectes antiinflamatoris i
analgèsics de la PEA (Re et al., 2007).
La primera hipòtesi del mecanisme d’acció del PEA, el mecanisme ALIA, va ser
proposada per Aloe et al. (1993), grup dirigit per la premi Nobel del 1996 Rita LeviMontalcini. Concretament, es va observar que realitzant un tractament previ amb PEA,
es va reduir de forma significativa la degranulació dels MCs induïts per substància P a
l’orella de rates (Aloe et al., 1993). Per tant, es va hipotitzar que la producció local de
PEA observada en diversos processos inflamatoris, podria ser una resposta adaptativa
per tal de regular l’activació dels MCs i en conseqüència prevenir o limitar el procés
inflamatori. D’aquesta manera, es postula que la PEA actua com autocoide local
modulant de forma negativa l’activació dels MCs. D’aquest treball va sorgir l’acrònim
ALIA (Autocoid Local Inflammation Antagonism), encara que més tard, després
d’observar que la PEA també protegia les cèl·lules neuronals contra la toxicitat del
glutamat, es va redimensionar el paper protector del PEA, atorgant-li un major abast
en front diversos danys. D’aquesta manera l’acrònim ALIA va passar a tenir un sentit
més ampli (Autocoid Local Injury Antagonism) (Skaper et al., 1996). Així doncs, els
efectes antiinflamatoris de la PEA observats en diversos estudis, suggereixen un efecte
modulador en l’activació dels MCs (Facci et al., 1996; Scarampella et al., 2001; Iuvone
125
DISCUSSIÓ GENERAL
et al., 2007; Costa et al., 2008; Cerrato et al., 2010). D’aquesta manera la PEA i altres
NAEs s’han caracteritzat funcionalment com aliamides
Aquest fet també ha estat observat en l’estudi dels MCs cutanis canins induïts
amb anti-IgE i tractats amb PEA, on es va produir una inhibició significativa tant de
mediadors preformats com de nova síntesi. No obstant, els percentatges més alts
d’inhibició (54%) es van obtenir per la histamina, mentre que pels mediadors de nova
síntesi (PGD2 i TNFα) els percentatges varen ser menors (26% i 29%, respectivament)
(Cerrato et al., 2010). Aquest fet podria ser degut en part per les condicions
experimentals de l’estudi, el tipus d’estímul immunològic i l’heterogeneïtat en la
resposta dels MCs, com anteriorment s’ha esmentat. En aquest sentit, diferents
estudis in vitro amb antihistamínics també mostren una gran variabilitat dels efectes
farmacològics sobre la degranulació dels MCs, inclús els mateixos fàrmacs mostren
diferents magnituds d’inhibició, a més de necessitar diferents concentracions per
assolir percentatges d’inhibició significatius (Cuss, 1999). Church et al., en diferents
estudis utilitzant MCs humans de la pell, del pulmó i de l’amígdala, també van mostrar
diferents magnituds d’inhibició per la histamina i la PGD2 en funció del fàrmac i del
tipus de MCs utilitzats (Church et al., 1997).
La segona hipòtesi sobre el mecanisme d’acció de la PEA és l’anomenat, efecte
del “seguici” (entourage effect). Alguns mediadors del tipus endocannabinoid-like com
la PEA podrien actuar com moduladors al·lostèrics d’altres compostos endògens.
D’aquesta manera incrementarien l’activitat d’altres eCBs sobre els seus receptors.
Complementàriament, també podrien actuar inhibint la degradació de certs eCBs.
D’aquesta manera, la PEA exerciria un control precís sobre l’activitat d’altres lligands
endògens, actuant indirectament sobre les seves dianes moleculars (Re et al., 2007).
Així doncs, s’ha observat que la PEA inhibeix l’expressió de la FAAH de manera
que perllonga la vida mitjana i les accions de l’AEA (Di Marzo et al. 2001; Calignano et
al., 1998), que a través l’activació dels receptor CB1 i particularment del CB2 té efectes
immunomoduladors (generalment antiinflamatoris) que proporcionen un efecte
protector davant processos autoimmunes i altres desordres al·lèrgics (Rossi et al.,
2011; Karsak et al., 2007). A més, l’AEA actua inhibint els canals de calci tipus T, que
126
DISCUSSIÓ GENERAL
tenen un paper important en la transducció del dolor i que també estan implicats en la
inflamació (Lee et al., 2010; Chemin e al., 2001).
La PEA també incrementa la unió de l’AEA sobre el receptor TRPV1 (transient
receptor potential vanilloid), de manera que facilita l’activació i dessensibilització
immediata d’aquest canal (Ho et al., 2008). D’aquesta manera la PEA podria
desenvolupar efectes antiinflamatoris, encara que paradoxalment aquests canals
actuen com transductors polimodals del dolor i dels estímuls proinflamatoris,
participant en la hiperalgèsia produïda per calor i en processos inflamatoris de la pell
(Walder et al., 2012; De Petrocellis i Di Marzo, 2010; Ross, 2003; Vandevoorde et al.,
2003; Smart et al., 2002 i 2000).
Per tant, la PEA es comporta com un “eCB i endovaniloide indirecte” ja que part
de les accions que desenvolupa, són mitjançades de forma indirecte per un “seguici”
de compostos associats (entourage effects).
L’activació dels receptors CBs constituiria la tercera hipòtesis del mecanisme
d’acció de la PEA. Al principi la PEA es va classificar com un eCB, ja que es va suggerir
que era una agonista del receptor CB2 (Facci et al., 1995), encara que més tard s’ha
observat que la PEA presenta una baixa afinitat pels receptor CB1 i CB2 (Lo Verme et
al., 2005; De Petrocellis et al., 2002; Griffin et al., 2000; Showalter et al., 1996). Aquest
fet es basa en diversos estudis a través dels quals s’ha observat que alguns dels efectes
farmacològics de la PEA es poden antagonitzar a través del blocant selectiu SR144528
del receptor CB2 (Conti et al., 2002; Calignano et al., 1998; Jaggar et al., 1998). Basat
en aquest fet,
es va proposar que les accions del PEA, en concret els efectes
analgèsics, podien estar mitjançats a través d’un receptor tipus CB2 encara no
caracteritzat, que probablement s’expressés als MCs (Calignano et al., 1998; Facci et
al., 1995).
Finalment, l’activació dels receptors nuclears de la família PPARs i dels
receptors orfes acoblats a proteïna G, constituiria la darrera hipòtesi del possible
mecanisme d’acció de la PEA. Estudis recents han mostrat que la PEA és un agonista
del receptor nuclear PPARα (O’Sullivan, 2007; Lo Verme et al., 2006 i 2005). Aquest
receptor també és antagonitzat pel mateix antagonista SR144528 del receptors CB2
127
DISCUSSIÓ GENERAL
que anteriorment hem descrit. Per tant, aquest fet descartaria que els efectes de PEA
estiguin mitjançats pels receptors CB2 o d’un nou receptor del tipus CB2. Així mateix,
la PEA es postula com un agonista del receptor GPR55 (receptor “orfe” acoblat a
proteïna G) (Cantarella et al., 2011; Godleswiki et al., 2009). Aquest tipus de receptor
“orfe”, malgrat que la seva biologia no està totalment compresa, semblaria que tindria
un paper sobre la inflamació similar als receptors CBs i oposat als receptors TRPV i els
canals de calci tipus T (De Petrocellis i Di Marzo et al., 2010).
Per tant, emergeix un nou escenari en el que es suggereix que la PEA no només
actuaria de forma biunívoca sobre un sol receptor, sinó que exerciria de forma directa i
indirecta varis efectes coordinats, a través de varies dianes moleculars, per tal de
restablir de nou un estat d’equilibri quan determinats danys o condicions patològiques
pertorben l’homeòstasi tissular.
En aquest sentit els MCs s’erigeixen com l’element integrador d’aquestes
hipòtesis, ja que expressen els receptors CBs, els receptors PPRAα, els receptors
vaniloides i els receptors orfes acoblats a proteïna G (Cantarella et al., 2011; Pertwee
et al., 2010; Maeyama et al., 2005; Stander et al., 2005; Stander et al., 2004; Samson et
al., 2003; Biro et al., 1998; Facci et al., 1995). A més, aquestes hipòtesis es poden
considerar en gran mesura mecanismes moleculars complementaris. Per tant, donat
que els MCs intervenen en una gran varietat de condicions patològiques, que els eCBs i
els compostos endocannabinod-like presenten una gran “promiscuïtat” de dianes
moleculars i que les NAEs es produeixen a demanda, es pot hipotitzar que el increment
dels nivells dels eCBs i endocannabinoids-like compounds estan modulats de forma
local per tal de restablir l’homeòstasi tissular i contrarestar els efectes d’aquests
processos. Així, l’ús de les NAEs, i concretament de la PEA pot ser útil en el tractament
i control de diferents malalties associades a la hiperactivitat dels MCs com per exemple
malalties inflamatòries de la pell tant agudes com cròniques, com és el cas de la DA.
En aquest sentit, un cop observats els efectes de la PEA sobre els MCs cutanis
canins, l’objectiu va ser avaluar l’eficàcia de la PEA sobre la inflamació produïda en un
model de gos de dermatitis al·lèrgica.
128
DISCUSSIÓ GENERAL
5.2. La PEA en el model de dermatitis al·lèrgica en gossos Beagle
La utilització de models in vivo permet l’estudi dels mecanismes moleculars i
cel·lulars de cert tipus de processos al·lèrgics, així com també l’avaluació de l’eficàcia
dels tractaments farmacològics en el control d’aquest tipus de trastorns.
Concretament el model de gossos Beagle hipersensibles en front a Ascaris suum és un
model útil per l’estudi de processos inflamatoris cutanis immunomitjançats, com és el
cas de la dermatitis al·lèrgica (De Mora et al., 2006). Aquest model ha estat
àmpliament utilitzat, sobretot als anys 1980 (Hirshman, 1985; Dollery et al., 1987;
Woolley et al., 1995) com a model del asma al·lèrgic i com a model de les dermatitis
al·lèrgiques (Brazís et al., 1998, Queralt et al., 1998; Brazís et al., 2006, Torres et al.,
2006). En aquest model, els gossos presenten una alta titulació de IgEs en front els
antígens d’A. suum perquè l’antigen principal (Asc 1) genera reactivitat creuada amb
els antígens de Toxocara canis i Toxascaris leonina, paràsits als quals els gossos estan
exposats de forma freqüent (Christie et al., 1993; Egli et al., 2002). Per tant, en aquest
model, la injecció intradèrmica del extracte d’A. suum inicia la reacció immediata o EPR
de la reacció al·lèrgica amb una vasodilatació local, seguida de l’extravasació, que
macroscòpicament es manifesta en forma d’una pàpula acompanyada d’eritema.
L’àrea de la pàpula és màxima als 10-20 min després de realitzar la injecció
intradèrmica de l’antigen. Al cap de 6-12 h s’observa de forma macroscòpica una
induració de la regió com a resultat del reclutament cel·lular de la LPR de la inflamació
al·lèrgica (Torres et al., 2003), que pot persistir durant dies (Olivry et al., 2001).
El desenvolupament de les pàpules en la pell dels gossos Beagle és el resultat
de l’acció dels mediadors (principalment histamina) alliberats pels MCs activats.
L’antigen dipositat directament en la dermis indueix la degranulació dels MCs després
d’unir-se a les IgEs específiques que es troben unides als receptors de membrana dels
MCs. Per tant, l’alliberació de mediadors prefomats i mediadors lipídics contribueixen
als símptomes aguts i altres símptomes associats amb la EPR. Així doncs, la histamina
alliberada induirà l’activació de la microvasculatura dèrmica provocant vasodilatació,
que en la pell es traduirà en eritema, i incrementant la permeabilitat vascular donant
lloc a la inflammació característica d’aquestes reaccions. A més, també s’activen els
nociceptors dels nervis sensorials de la pell produint pruïja (Cevikbas et al., 2007). Per
129
DISCUSSIÓ GENERAL
tant, la histamina juga un paper preponderant en les reaccions inflamatòries en la pell
dels gossos en forma de pàpules i erupcions (Roßbach et al., 2009). Així doncs, donat
que es va demostrar que la PEA era capaç d’inhibir un 54% l’alliberació d’histamina
dels MCs immunològicament estimulats, era probable que també podria exercir un
control farmacològic en el desenvolupament de les pàpules en aquest model.
Així doncs, es va observar que una única dosi oral de PEA, de 10 i 30 mg/kg, va
reduir de forma significativa l’àrea de les pàpules induïdes per l’antigen d’A. suum, un
29% i un 32% respectivament, després de 1 i 2 h de l’administració del fàrmac.
Resultats similars es van obtenir amb les pàpules induïdes amb anti-IgE canina, amb
uns percentatges màxims d’inhibició també al voltant del 32%, tant per la dosi de 10
com de 30 mg/kg després de 2 h de l’administració oral (Cerrato et al., 2012a).
En aquest sentit, els efectes inhibitoris de la PEA sobre la formació de les
pàpules confirmen els resultats obtinguts en d’altres models animals d’inflamació on
els MCs tenen també tenen un paper essencial. Així doncs, un dels primers estudis en
un model d’inflamació neurogènica on es van mostrar que els efectes antiinflamatoris
de la PEA estaven relacionats amb l’activació dels MCs va ser realitzat per Mazzari et
al. (1996). En aquest estudi l’administració d’una dosi oral de 0.1, 1 i 10 mg/kg de PEA
va reduir de forma significativa i depenent de dosi la degranulació dels MCs i en
conseqüència l’extravasació a l’orella de ratolins induïda per substancia P. Així mateix
les mateixes dosis de PEA van reduir l’extravasació en un altre model en ratolí de
reacció anafilàctica cutània passiva. Per últim en aquest estudi també es va determinar
que la PEA (0.1, 1 i 10 mg/kg) era capaç de reduir l’edema subplantar induït per
substancia P, formalina i carraguenina en el model d’inflamació aguda perifèrica en
rata. En aquest estudi la PEA es va administrar 1h abans de la inducció de l’edema o
extravasació (Mazzari et al., 1996).
En la mateixa línia, Conti et al. (2001) van mostrar que en el mateix model, a
més de la reducció de l’edema subplantar, també es va reduir l’hiperalgèsia quan es va
administrar una dosi oral de PEA (10 mg/kg) 1h abans de la inducció amb carraguenina,
mentre que Costa et al. (2002) van mostrar que la PEA (10mg/kg/dia) també era
130
DISCUSSIÓ GENERAL
efectiva reduint l’edema quan s’administrava 2h després de la inducció amb
carraguenina durant 4 dies.
Consistents amb els resultats obtinguts per Mazzari, la PEA (0.2 mg/ratolí, IP)
també va reduir l’edema en resposta al compost 48/80 (un altre tipus diferent d’agent
promotor de la degranulació dels MCs) demostrant la capacitat de la PEA per inhibir les
conseqüències de la degranulació dels MCs in vivo en resposta a diversos estímuls
(Jonsson et al., 2006).
Per últim, la PEA també es va mostrar eficaç en el control de l’activació dels
MCs en un model d’inflamació crònica en rata. En aquest model es va induir la
formació d’un granuloma a través de la implantació d’una esponja impregnada de
carraguenina i PEA (20, 40 i 80 µg) de forma subcutània. Els resultats van mostrar una
reducció de la formació del granuloma, com també una reducció en el número de MCs
i en la seva degranluació. Així mateix, en aquests treballs també es va observar una
reducció de l’angiogènesi i la hiperalgèsia com a conseqüència del control de la
degranulació dels MCs (De Filippis et al., 2010 i 2011). De forma interessant, en
aquests estudis es va mostrar una reducció dels nivells endògens tissulars de la PEA
durant la formació del granuloma, de manera que la restauració del “to de la PEA” a
través de l’administració exògena, va reduir la formació del teixit granulomatós 96 h
després de la inducció amb l’estímul. En aquesta línia, els nostres resultats també van
mostrar una correlació dels efectes inhibitoris de la PEA sobre l’àrea de les pàpules
amb el increment dels seus nivells plasmàtics després de l’administració de la dosi oral
de 30 mg/kg.
Per tant, aquests resultats suggereixen que la PEA actuaria, almenys en part,
sobre l’activació dels MCs i en conseqüència reduiria la resposta inflamatòria en la pell
dels gossos Beagle. A més, un dels resultats obtinguts confirmaria un altre mecanisme
d’acció descrit anteriorment: l’efecte seguici. Doncs, el increment dels nivells
plasmàtics de la PEA després de l’administració oral en els gossos, es va correlacionar
amb els efectes inhibitoris sobre l’àrea de les pàpules, però un cop aquests nivells van
retornar al seu estat basal, l’acció inhibitòria exercida sobre l’àrea de les pàpules es va
perllongar més. Aquest fet, suggereix l’existència d’un mecanisme pel qual la PEA
131
DISCUSSIÓ GENERAL
modula els nivells o accions d’altres compostos endògens bioactius, tal i com es
proposa en la hipòtesi de l’efecte seguici.
Finalment, el fet de no trobar diferències en els percentatges d’inhibició entre
les dosis orals de PEA de 10 i 30 mg/kg suggereix la possibilitat de l’existència d’un
efecte plateau a la dosi de 10 mg/kg, tal i com també es va observar en un estudi previ
en un model d’inflamació aguda en rata (Wise et al., 2008) a on es va veure que
l’administració de PEA (12.5, 25 i 50 mg/kg, I.P.) 30 min abans de la inducció de la
inflamació amb carraguenina tenia un efecte significatiu sobre la reducció de la
inflamació i no hi havia diferències entre les dosis. En aquest mateix estudi també es
va observar que a diferència d’altres NAEs, els efectes antiinflamatoris de la PEA no
estaven sotmesos a efectes de tolerància desprès de l’administració repetida de dosis
altes. Doncs l’administració durant 5 dies consecutius de dues injeccions
intraperitoneals de PEA a una dosi alta (50 mg/kg), no van modificar la magnitud dels
efectes inhibitoris quan al sisè dia es va induir la inflamació després de 30 min de
l’administració de PEA a una dosi menor (25 mg/kg). Tots aquestes fets demostrant el
potencial terapèutic de la PEA.
5.3. Bioseguretat i tolerabilitat de la PEA
Si bé es cert que estudis recents han demostrat l’eficàcia d’alguns
glucocorticoides orals, esteroides tòpics, la immunoteràpia específica per al·lèrgens, la
ciclosporina oral i altres inhibidors de la calcineurina en el tractament de malalties
al·lèrgiques en el gos (Olivry et al., 2010), aquests fàrmacs presenten certes
limitacions. Els glucocorticoides presenten efectes indesitjables a curt termini com la
polidípsia, poliúria i polifagia, i quan els tractaments són concurrents i a llarg termini,
especialment per la ciclosporina i els glucocorticoides orals, poden produir una
immunosupressió del individu associada amb un probable desenvolupament
d’infeccions oportunistes severes, que poden afectar tant a la pell com altres òrgans.
Els tractaments tòpics a llarg termini amb glucocorticoides i tracolimus també
predisposen a un important nombre de trastorns cutanis com l’aprimament i
afinament de la pell, calcinosis del cutis, alopècia, predisposició a la demodicosis,
132
DISCUSSIÓ GENERAL
etcètera. A més, els inhibidors de la calcineurina, com per exemple la ciclosporina i
tacrolimus són tractaments cars, i com hem vist, poden desenvolupar greus efectes
adversos. Per altra banda, l’ús dels antihistamínics pel tractament de malalties
al·lèrgiques en el gos, com per exemple la DA, presenta una eficàcia clínica limitada, a
més d’estar associat als típics efectes adversos de sedació. Per últim, la immunoteràpia
específica d’al·lèrgens, malgrat que els estudis realitzats són limitats, sembla ser
efectiva i segura en la reducció de la simptomatologia associada als trastorns al·lèrgics,
encara que implica un elevat cost econòmic i una important inversió de temps, a més
d’altres aspectes tècnics que el propietari ha d’afrontar. No obstant, en certs casos,
s’ha observat un increment de la pruïja després de les injeccions de la immunoteràpia,
que per tal de controlar-la s’utilitzen glucocorticoides i ciclosporina que podrien
produir altres efectes adversos si el tractaments acaben sent llargs. Per tant, és
important el desenvolupament de nous fàrmacs amb una major bioseguretat.
En aquest sentit, els eCBs, com per exemple la PEA, poden ser una alternativa
eficaç i segura. Estudis preliminars van demostrar que la PEA administrada en el medi
de cultiu de fibroblasts i queratinòcits, així com també en les dispersions de MCs
cutanis canins obtingudes, no presentava efectes citotòxics in vitro a cap de les
concentracions testades, que anaven de 10-5 a 10-8 M (Cerrato et al., 2010). Aquestes
dades també s’han observat en altres estudis amb diversos tipus cel·lulars confirmant
la bioseguretat d’aquest compost. Per exemple, es va observar que la incubació amb
PEA (10-4 M) durant 24h, no van afectar la viabilitat cel·lular dels cultius primaris de
neurones de ratolí (Skaper et al., 1996), com tampoc es observar cap efecte de
toxicitat en cultius primaris d’adipòcits humans després d’incubar durant 24h amb PEA
també a una concentració de 10-4 M (Hoareau et al., 2009).
A més, es va observar que els efectes farmacològics observats en model de
dermatitis al·lèrgica en els gossos Beagle no estaven associats a cap efecte indesitjable
així com tampoc a cap dels efectes psicoactius clàssics dels CBs, com per exemple
sedació, disminució de l’activitat locomotora, efectes psicotròpics, etcètera (Cerrato et
al., 2012a); corroborant les dades observades en estudis clínics en humans i animals.
Així, en un estudi clínic amb 17 gats afectats per desordres d’hipersensibilitat a la pell,
es van tractar durant 30 dies amb una dosi diària de 20 mg/kg i es va observar una
133
DISCUSSIÓ GENERAL
disminució de la pruïja, l’eritema i l’alopècia, mentre que no es va observar cap efecte
advers i es va determinar la tolerabilitat com excel·lent, tant pels propietaris com pels
investigadors (Scarampella et al., 2001). En dos altres estudis clínics en humans pel
tractament del dolor neuropàtic, un amb 600 pacients i l’altre amb 100, es va observar
que l’administració oral de PEA (300 o 600 mg/dia) durant 21 dies, no va produir cap
alteració dels paràmetres hematològics ni urinaris estudiats i no es van observar altres
efectes indesitjables (Canteri et al., 2010; Guida et al., 2010). Finalment, en un tercer
estudi clínic en humans, tampoc es van observar efectes adversos després de tractar
26 pacients durant 30 dies a través de l’administració oral de PEA (600 o 1200 mg/dia)
(Conigliaro et al., 2011). Malgrat que tots aquests estudis indiquen que l’administració
de PEA possiblement no estigui associada al desenvolupament d’efectes adversos, serà
necessari realitzar més estudis per confirmar la seva bioseguretat a llarg termini en els
gossos després de l’administració repetida durant llargs períodes.
5.4. L’adelmidrol en el tractament tòpic de la dermatitis al·lèrgica
Des d’un punt de vista pràctic, en la gestió de trastorns d’hipersensibilitat en els
gossos, que tenen una afectació cutània, seria preferible l’ús de tractaments tòpics que
no pas tractaments sistèmics, principalment en els primers estadis de les malalties que
són menys severs. En aquest sentit, i a diferència de la PEA que és un compost lipofílic,
l’adelmidrol és un compost amfipàtic, cosa que facilita la seva absorció a través de la
pell. Per aquesta raó, es va realitzar un tercer estudi amb un tractament tòpic amb
adelmidrol, que després de 3 i 6 dies de tractament va demostrar un efecte inhibitori
sobre la EPR, reduint l’àrea de les pàpules generades amb l’antigen d’A. suum un 20 i
un 37% respectivament. Per contra, en el tractament amb vehicle no es va observar
cap efecte sobre les àrees de les pàpules confirmant indirectament que l’activitat de
l’adelmidrol tòpic es restringia de forma local, demostrant la manca d’absorció
sistèmica (Cerrato et al., 2012b).
En altres estudis realitzats en diferents models de dermatitis al·lèrgica en
gossos s’ha avaluat l’eficàcia de diferents tractaments. Així doncs, en gossos Beagle,
una única dosi oral de l’antihistamínic rupatadina (30 mg/kg) 30 min abans de la
134
DISCUSSIÓ GENERAL
inducció de les pàpules amb histamina i el factor activador plaquetari, van presentar
valors màxims d’inhibició de les àrees de les pàpules al voltant del 80% i 40%,
respectivament (Merlos et al., 1997). En un altre estudi amb el mateix model però amb
d’altres antihistamínics (rupatadina, cetrizina, levocabastina i loratadina), es van
observar uns efectes màxims d’inhibició (78-87%) després de la inducció de les pàpules
amb histamina i l’administració prèvia d’una única dosi oral de 10 mg/kg (Queralt et
al., 1996). Els percentatges d’inhibició obtinguts en aquests estudis van superiors als
obtinguts amb la PEA i l’adelmidrol, però en aquest cas la inducció de les pàpules es va
realitzar amb histamina, de manera que l’acció farmacològica observada dels
antihistamínics es centrava en la inhibició dels efectes de la histamina injectada sobre
altres tipus cel·lulars del microambient tissular, més que no pas en una acció
inhibitòria sobre la dreganulació dels MCs de la pell. Per contra, la prednisolona
(corticosteroide oral) administrada dos cops al dia durant 3 dies, no va tenir cap efecte
sobre les pàpules en gossos Beagle després de la inducció de les pàpules amb anti-IgE
canina (Pucheu-Haston et al., 2006). Igualment, la hidrocortisona al 1%
(corticosteroide tòpic) aplicada setmanalment durant 6 setmanes en gossos amb
dermatitis pruïjosa o aplicada durant 3 dies en gossos Beagle tampoc va tenir efectes o
van ser d’un 14% quan es van induir les pàpules amb histamina o anti-IgE canina
(Rivierre et al., 2000; Thomas et al., 1999). A més, la betametasona, un altre
corticosteroide aplicat en gossos Beagle dos cops al dia durant 2 setmanes a través
d’una solució òtica, no va tenir pràcticament efectes sobre les pàpules induïdes amb
antígens i anti-IgE canina (Ginel et al., 2007). Per últim, els valors màxims d’inhibició
amb els corticosteroides tòpics (45%) es van observar amb un tractament amb una
solució de triamcinolona al 0.015% durant 7 dies, després de la inducció amb anti-IgE
canina (DeBoer i Cooley, 2000), una magnitud semblant als obtingut amb la PEA i
l’adelmidrol, exceptuant un altre estudi on es va obtenir el 72% d’inhibició després de
tractar gossos atòpics amb aceponat d’hidrocortisona al 0.0584% durant 7 dies i induir
les pàpules amb anti-IgE (Bizikova et al., 2010).
Per altra banda, tot i que no es va incloure en els resultats obtinguts en l’article
perquè no va ser un dels objectius del protocol original, val la pena esmentar que es va
observar una reducció aparent de la pruïja al costat tractat amb adelmidrol en
135
DISCUSSIÓ GENERAL
comparació amb el costat tractat amb vehicle, en el que es van observar lesions
secundàries autoinduïdes pel gratament.
Com anteriorment hem observat, l’efecte màxim de l’acció del tractament amb
adelmidrol va ser lleugerament superior a l’obtingut amb una única dosi oral de PEA i a
més, es va observar un increment en el percentatge d’inhibició del tercer al sisè dia de
tractament amb adelmidrol. Això suggereix un efecte acumulatiu de l’adelmidrol a
través d’un mecanisme gradual, més que no pas un efecte farmacològic de
desactivació immediata dels MCs. En aquest sentit sembla probable que igualment que
s’ha observat amb els corticosteroides, tractaments més llargs poden incrementar la
magnitud dels efectes farmacològics de l’adelmidrol. Aquest efecte pot ser degut,
almenys en part, a la capacitat d’incrementar l’acció de diferents compostos endògens
bioactius a través del “entourage effect”. Per tant, l’aplicació de l’adelmidrol podria
contribuir en el control de l’activació dels MCs durant la EPR, prevenint el
desenvolupament de la LPR i en el control de malalties inflamatòries cròniques.
Com ja hem descrit a la revisió bibliogràfica, l’estímul al·lèrgic produeix
l’activació dels MCs, que amb l’alliberament dels diferents mediadors, principalment la
histamina, indueixen la EPR amb la formació d’eritema i edema, el desenvolupament
de pruïja i que acaba amb una cascada de reaccions desencadenant la LPR amb el
reclutament cel·lular (Olivry et al., 2001; Torres et al. 2003). La quimioatracció
seqüencial de cèl·lules inflamatòries es va estudiar després de 8 dies de tractament
amb adelmidrol i vehicle. Malgrat que es va observar una reducció en l’infiltrat cel·lular
(eosinòfils, limfòcits, monòcits i neutròfils), només es va determinar una reducció
significativa en el número de MCs en l’àrea tractada amb adelmidrol respecte a la
tractada amb el vehicle (Cerrato et al., 2012b). Aquest resultats estan en consonància
amb els obtinguts en un estudi amb un model d’inflamació crònica en rata induïda per
la implantació d’una esponja impregnada amb carraguenina i 100 µL d’una solució
d’adelmidrol al 7%, on es va observar una reducció significativa del número de MCs del
52% després de 96h (De Filippis et al., 2009). Aquestes observacions suggereixen una
reducció en el reclutament de MCs i/o en la proliferació, i per tant, una reducció local
de quimiocines i factors de creixement dels MCs, secretats tant pels mateixos MCs com
per la resta de cèl·lules del teixit. En aquest sentit, hi ha evidències recents que
136
DISCUSSIÓ GENERAL
recolzen aquesta hipòtesi. S’ha observat que la PEA modula negativament l’expressió i
els nivells de la citoquina MPC-2 (monocyte chemotactitc protein-2), responsable del
reclutament dels MCs (Romagnani, 2002) i produïda pels queratinòcits (Petrosino et
al., 2010a). A més, els queratinòcits formen part de la primera línia de defensa en front
l’ambient, ja que formen part de la barrera epidèrmica i s’ha observat que en resposta
a lesions, la llum UV, certs irritants de la pell, etcètera, són capaços d’alliberar més de
30 tipus de citoquines i altres molècules capaces d’incrementar la resposta
inflamatòria (Uchi et al., 2000). Concretament els queratinòcits són capaços de
segregar diferents citoquines proinflamatòries entre les que trobem la IL-1, IL-6, IL-8 i
el TNFα (Gröne, 2002). També, s’ha observat que els queratinòcits en resposta a la
histamina produeixen metaloproteinases que poden contribuir en el desenvolupament
de lesions cutànies (Gschwandtner et al., 2008; Harvima, 2008). Per
tant, els
queratinòcits també són cèl·lules importants en la patogènia de les reaccions
al·lèrgiques i altres trastorns associats. Així doncs, s’ha observat un increment en la
secreció de la IL-1 i del TNFα en els queratinòcits de pacients amb DA (Pastore et al.,
2000), mentre que en gossos amb DA s’ha observat un increment en el TNFα en les
regions de pell lesionada, suggerint que aquesta desregulació podria estar causada en
part pels queratinòcits.
Per altra banda, donat que en la pell s’expressen la FAAH i la PAA (Biro et al.,
2009), els principals enzims hidrolítics de les NAEs, i que l’adelmidrol pertany a les
NAEs, és probable que l’aplicació tòpica d’aquest compost comporti la degradació local
i en conseqüència, un increment en els nivells d‘etanolamina (compost biològicament
inactiu) i àcid azelaic (compost biològicament actiu). Doncs aquest últim, s’ha observat
que exerceix importants propietats antiinflamatòries inhibint l’expressió de la IL-1 i el
TNFα en cultius de queratinòcits (Mastofrancesco et al., 2010). Per tant, és probable
que el tractament amb adelmidrol exerceixi els seus efectes a través de la inhibicó de
l’alliberament dels mediadors dels MCs, i també actuï sobre els queratinòcits a través
del metabòlit àcid azelaic.
Finalment, s’ha demostrat que la PEA inhibeix l’alliberament del TNFα dels MCs
(Cantarella et al., 2011; Cerrato et al., 2010), una neurotrofina que promou la
quimiotaxis dels MCs així com també la seva maduració (Sawada et al., 2000; Matsuda
137
DISCUSSIÓ GENERAL
et al., 1991). Finalment, un estudi recent ha demostrat que els eCBs redueixen
l’activació i maduració dels MCs, regulant l’expressió del SCF (Sugawara et al., 2012),
una citoquina crucial pel reclutament, el desenvolupament i la supervivència dels MCs
(Demitsu et al. 1999; Finotto et al., 1997; Castells et al., 1996; Costa et al. 1996). Per
tant, els eCBs i les aliamides poden exercir un efecte negatiu en el reclutament dels
MCs, en la maduració i proliferació, de manera que sembla plausible que l’adelmidrol
actuï a aquest nivell, justificant la reducció en el número de MCs.
Per tant, la PEA i el seu anàleg sintètic adelmidrol poden ser una eina segura i
eficaç en el control de les malalties cutànies associades a la hipersensibilitat dels MCs,
que actuarien de forma directa o indirecta a diferents nivells del sistema immunològic
de la pell, produint una millora de la simptomatologia associada a aquests trastorns.
En la gestió de les malalties d’al·lèrgia en els gossos, l’adelmidrol es pot utilitzar
juntament amb tractaments sistèmics, tal i com es realitza amb els compostos tòpics
clàssics (Olivry et al., 2010). Els tractaments tòpics són formulacions a base de
glucocorticoides i tacrolimus, que malgrat ser efectius, tots dos presenten efectes
adversos (Olivry et al., 2010). En aquest sentit l’adelmidrol podria esdevenir una
alternativa, encara que és necessari realitzar estudis amb tractaments més llargs per
confirmar l’absència de signes d’irritació o altres efectes adversos, no observats durant
l’estudi. Per últim, la DA és una malaltia freqüent en els gossos, i un 80% dels que la
pateixen, desenvolupen els signes clínics al llarg de l’any i no de forma estacional,
requerint un tractament a llarg termini (Scott, 2001). Les estratègies terapèutiques pel
maneig dels pacients amb DA inclouen evitar l’exposició als al·lèrgens, el tractament
d'infeccions secundàries per bacteris o llevats, la utilització de fàrmacs
antipruriginosos tòpics i sistèmics, l’administració àcids grassos essencials,
glucocorticoides, ciclosporina, o la immunoteràpia específica d’al·lèrgens. Aquesta
darrera, és una teràpia que es basa en l’administració gradual de quantitats creixents
d’un extracte dels al·lèrgens causants del quadre clínic, amb l’objectiu de
desensibilitzar l’individu perquè en la següent exposició a l’al·lergen, es redueixin els
símptomes associats (Bousquet et al., 1998). No obstant, en certs casos al inici
d’aquest
tractament,
l’aparició
de
símptomes
obliga
a
la
utilització
d’immunosupressors, i aquests podrien actuar inhibint els mecanismes pels quals
138
DISCUSSIÓ GENERAL
actua la immunoteràpia específica d’al·lèrgens, alentint la seva acció terapèutica. La
recurrència de la simptomatologia durant la immunoteràpia està sovint associada a
infeccions secundàries i al desenvolupament de noves al·lèrgies (Nesbitt et al., 1984),
per aquesta raó alguns autors recomanen específicament evitar els glucocorticoides
durant aquesta teràpia (Griffin et al., 1993), ja que poden emmascarar la millora dels
signes clínics, així com també poden desenvolupar reaccions adverses que requereixen
una modificació o supressió del tractament. No obstant, altres autors aconsellen
l’administració de prednisona en dosis baixes o en dies alterns (Scott, 2001). Malgrat
tot, els efectes dels cotractaments amb immunosupressors durant aquesta teràpia no
s’han avaluat a llarg termini en el gos, però la interacció pot ser d'importància. En
aquest sentit les NAEs, com per exemple la PEA i el seu anàleg sintètic adelmidrol,
poden ser una bona alternativa. Doncs, donat que aquests compostos són molècules
que el propi organisme allibera quan es produeix una lesió per tal de restablir
l’homeòstasi tissular, és plausible pensar que el seu mecanisme d’acció està dirigit a
atenuar la resposta inflamatòria més que nos pas inhibir-la, de manera que a
diferència dels immunosupressors clàssics, el tractament amb PEA o adelmidrol durant
la immunoteràpia específica d’al·lèrgens no produiria efectes indesitjables ni
alteracions de la teràpia que afectin a la seva eficàcia. No obstant, es necessari el
desenvolupament de nous estudis que confirmin l’eficàcia i seguretat de la PEA i
l’adelmidrol en aquest tipus de tractaments.
En conclusió, les propietats farmacològiques de la PEA i el seu anàleg sintètic
adelmidrol observades en aquests estudis, confirmen l’acció sobre la modulació del
comportament dels MCs (número i activació), més que no pas en el blocatge de la seva
degranulació. Així doncs, aquests compostos poden proporcionar un nou impuls en
l’estudi de l’acció farmacològica sobre els MCs, com a principals cèl·lules efectores en
el desenvolupament dels processos inflamatoris i al·lèrgics tant des de la seva
promoció com fins a la cronicitat. Per tant, la PEA i el seu anàleg sintètic adelmidrol
poden representar una nova estratègia farmacològica pel tractament dels trastorns
al·lèrgics que afecten la pell dels animals de companyia.
139
140
VI. CONCLUSIONS
141
142
VI. CONCLUSIONS
Els resultats presentats en aquesta tesi ens permeten arribar a les següents
conclusions:
1. La PEA és capaç de modular negativament l’alliberament d’histamina, PGD2 i
TNFα dels MCs cutanis canins immunològicament induïts per anti-IgE. Aquest
resultats mostren que els efectes beneficiosos de la PEA observats en estudis
clínics sobre la inflamació i el dolor són deguts, almenys en part, a la capacitat
per inhibir l’alliberació dels mediadors mastocitàris tant reformats com de nova
síntesi.
2. El tractament oral amb PEA és eficaç en la reducció de forma significativa de les
reaccions al·lèrgiques a la pell en forma de pàpula induïdes tant amb antigen
com anti-IgE. Per tant, la PEA pot constituir una nova estratègia terapèutica en
el tractament de malalties al·lèrgiques inflamatòries de la pell en els gossos.
3. Els efectes antial·lèrgics observats després de l’administració oral de PEA es
correlacionen en el temps amb el increment dels seus nivells plasmàtics.
Malgrat això, els efectes antial·lèrgics es perllonguen més enllà després que la
concentració de PEA retorni als nivells basals. Aquests fets, evidencien la
capacitat de la PEA per modular els nivells i/o l'acció d'altres compostos
endògens bioactius a través del mecanisme d’acció anomenat “entourage
effect”.
4. El tractament tòpic amb adelmidrol inhibeix significativament la formació de les
pàpules induïdes per l’antigen en gossos Beagle hipersensibles, després de 3 i 6
dies de tractament, mentre que el tractament amb vehicle no inhibeix la
formació de les pàpules. D’aquesta manera, es confirma de forma indirecta la
manca d’absorció sistèmica de l’adelmidrol administrat per via tòpica. Per tant,
l’adelmidrol pot constituir un tractament per lesions localitzades a la pell en els
animals de companyia.
5. El tractament amb adelmidrol durant 8 dies limita el desenvolupament de la
LPR a través d’una reducció de la hiperplàsia dels MCs cutanis després de la
indducció amb antigen, possiblement a través de la reducció de la maduració
i/o proliferació dels progenitors reclutats de la circulació sanguínia o residents
del teixit.
143
144
VII. REFERÈNCIES
145
146
VII. REFERÈNCIES (REVISIÓ BIBLIOGRÀFICA I DISCUSSIÓ)
Adams, R., Baker, B.R., Wearn, R.B., 1940. Structure of cannabinol. III Synthesis of
cannabinol, 1-hydroxy-3-n-amyl-6,6,9-trimethyl-dibenxopyran. Journal of the American
Chemical Society 62, 2204-2207.
Adams, I.B., and Martin, B.R., 1996. Cannabis: pharmacology and toxicology in animals
and humans. Addiction 91, 1585-1614.
Akdis, M., Akdis, C.A., 2007. Mechanisms of allergen-specific immunotherapy. The
Journal of Allergy and Clinical Immunology 119, 780-791.
Akdis, C.A., Jutel, M., Akdis, M., 2008. Regulatory effeccts of histamine and histamine
receptor expression in human allergic immune responses. Chemical Immunology and
Allergy 94, 67-82.
Aloe, L., Leon, A., Levi-Montalcini, R., 1993. A proposed autocoid mechanism
controlling mastocyte behaviour. Agents Actions 39, C145-C147.
André, A., Gonthier, M.P., 2010. The endocannabinoid system: its roles in energy
balance and potential as a target for obesity treatment. The International Journal of
Biochemistry and Cell Biology 42, 1788-1801.
Ashton, C.H., 2001. Pharmacology and effects of cannabis: a brief review. The British
Journal of Psychiatry 178: 101-116.
Ashton, J.C., Glass, M., 2007. The cannabinoid CB2 receptor as a target for
inflammation-dependent neurodegeneration. Current Nneuropharmacology 5, 73-80.
Auchampach, J.A., Jin, X., Wan, T.C., Caughey, G.H., Linden, J., 1997. Canine mast cell
adenosine receptors: cloning and expression of the A3 receptor and evidence that
degranulation is mediated by the A2b receptor. Molecular Pharmacology 52, 846-860.
Azizkhan, R.G., Azizkhan, J.C., Zetter, B.R., Folkman, J., 1980. Mast cell heparin
stimulates migration of capillary endothelial cells in vitro. The Journal of Experimental
Medecine 152, 931-944.
Bachur, N.R., Masek, K., Melmon, K.L., Udenfriend, S., 1965. Fatty acids amides of
ethanolamine in mammalian tissues. Journal of Biological Chemistry 240, 1019-1024.
Basu, S., Ray, A., Dittel, B.N., 2011. Cannabinoid receptor 2 is critical for the homing
and retention of marginal zone B linage cells and for efficient T-independent immune
responses. Journal of Immunology 187, 5720-5732.
Becker, A.B., Chung, K.F., McDonald, D.M., Lazarus, S.C., Frick, O.L., Gold, W.M., 1985.
Mast cell tryptase levels in normal canine tissues. The Anatomical Record 213, 477480.
Befus, A.D., Dyck, N., Goodacre, R., Bienenstock, J., 1987. Mast cells from the human
intestinal lamina propia. Isolation, histochemical subtypes, and functional
characterization. Journal of Immunlogy 138, 2604-2610.
147
Biro, T., Maurer, M., Modarres, S., Lewin, N.E., Brodie, C., Acs, G., Acs, P., Paus, R.,
Blumberg, P.M., 1998. Characterization of functional vanilloid receptors expressed by
mast cells. Blood 91, 1332–1340.
Biro, T., Toth, B.I., Hasko, G., Paus, R., Pacher, P., 2009. The endocannabinoid system of
the skin in health and disease: novel perspectives and therapeutic opportunities.
Trends in Pharmacological Sciences 30, 411-420.
Bisogno, T., Maurelli, S., Melck, D., De Petrocellis, L., Di Marzo, V., 1997. Biosynthesis,
uptake, and degradation of anandamide and palmitoylethanolamide in leukocytes. The
Journal of Bioligical Chemistry 272, 3315-3323.
Bissonnette, E.Y., Enciso, J.A., Befus, A.D., 1996. Inhibitory effects of sulfasalazine and
its metabolites on histamine release and TNF-alpha production by mast cells. Journal
of Immunology 156, 218-223.
Bissonnette, E.Y., Befus. A.D., 1997. Anti-inflammatory effect of beta 2-agonists:
inhibition of TNF-alpha release from human mast cells. The Journal of Allergy and
Clinical Immunology 6, 825-831.
Bizikova, P., Linder, K.E., Paps, J., Olivry, T., 2010. Effect of a novel topical diester
glucocorticoid spray on immediate- and late-phase cutaneous allergic reactions in
Maltese-beagle atopic dogs: a placebo-controlled study. Veterinary Dermatology 21,
70-79.
Blair, R.J., Meng, H., Marchese, M.J., Ren, S., Schwartz, L.B., Tonnesen, M.G., Gruber,
B.L., 1997. Human mast cells stimulate vascular tube formation. Tryptase is a novel,
potent angiogenic factor. The Journal of Clinical Investigation 99, 2691-2700.
Bookbinder, P.F., Butt, M.T., Harvey, H.J., 1992. Determination of the number of mast
cells in lymph node, bone marrow, and buffy coat cytologic specimens from dogs.
Journal of the American Veterinary Medical Association 200, 1648-1650.
Bouaboula, M., Poinot-Chazel, C., Bourrié, B., Canat, X., Calandra, B., Rinaldi-Carmona,
M., Le Fur, G., Casellas, P., 1995. Activation of mitogen-activated protein kinases by
stimulation of the central cannabinoid receptor CB1. The Biochemical Journal 312, 637641.
Bousquet, J., Lockey, R., Malling, H.J., 1998. Allergen immunotherapy: therapeutic
vaccines for allergic diseases. A WHO position paper. The Journal of Allergy and Clinical
Immunology 102, 558-562.
Boyce, J.A., 2007. Mast cells and eicosanoid mediators: a system of reciprocal
paracrine and autocrine regulation. Immunological reviews 217, 168-185.
Brandt, W., Gürke M., Pabst, G., Khöler, F.E., Schellenbereg, G., Vogtherr, M., 1887.
Köhler's Medizinal-Pflanzen in naturgetreuen Abbildungen mit kurz erläuterndem
Texte: Atlas zur Pharmacopoea germanica, austriaca, belgica, danica, helvetica,
hungarica, rossica, suecica, Neerlandica, British pharmacopoeia, zum Codex
medicamentarius, sowie zur Pharmacopoeia of the United States of America. In:,
Khöler, F.E. (Ed.). Gera-Untermhaus, Germany, pp. (lam 13).
148
Brazis, P., Queralt, M., de Mora, F., Ferrer, L., Puigdemont, A., 1998. Comparative study
of histamine release from skin mast cells dispersed from atopic, ascaris sensitive and
healthy dogs. Veterinary Immunology and Immunopatholology 66, 43–51.
Brazis, P., Barandica, L., García, F., Clough, G.F., Church, M.K., Puigdemont, A., 2006.
Dermal microdialysis in the dog: In vivo assessment of the effect of cyclosporin A on
cutaneous histamine and prostaglandin D2 release. Veterinary Dermatology 17, 169–
174.
Brown, J.M., Wilson, T.M., Metcalfe, D.D., 2008. The mast cell and allergic diseases:
role in pathogenesis and implications for therapy. Clinical and Experimental Allergy 38,
41-118.
Burstein, S.H., 1999. The cannabinoid acids: nonpsychoactive derivates with
therapeutic potential. Pharmacology and Therapeutics 82, 87-96.
Cadas, H., Gaillet, S., Beltramo, M., Venance, L., Piomelli, D., 1996. Biosynthesis of an
endogenous cannabinoid precursor in neurons and its control by calcium and cAMP.
The Journal of Neuroscience 16, 3934-3942.
Calignano A., La Rana, G., Markriyannis, A., Lin, S.Y., Beltramo, M., Piomelli, D., 1997.
Inhibition of intestinal motility by anandamide, an endogenous cannabinoid. European
Journal of Pharmacology 340, R7-R8.
Calignano, A., La Rana, G., Giuffrida, A., La Rana, G., Mackie, K, Freund, T.F., Piomelli,
D., 1998. Control of pain initiation by endogenous cannabinoids. Nature 394, 277-281.
Calignano, A., Kátona, I., Désarnaud, F., Giuffrida, A., La Rana, G., Mackie, K, Freund,
T.F., Piomelli, D., 2000. Bidirectional control of airway responsiveness by endogenous
cannabinoids. Nature 408, 96-101.
Cantarella, G., Scollo, M., Lempereur, L., Saccani-Jotti, G., Basile, F., Bernardini, R.,
2011. Endocannabinoids inhibit release of nerve growth factor by inflammationactivated mast cells. Biochemical Pharmacology 82, 380-388.
Canteri, L., Petrosino, S., Guida, G., 2010. Reducción del consumo de antiinflamatorios
y analgésicos en el tratamiento del dolor neuropático crónico en pacientes afectados
por lumbociatalgia de tipo compresivo y en tratamiento con Normast® 300 mg. Dolor
25, 227-234.
Carracedo, A., Lorente, M., Egia, A., Blazquez, C., Garcia, S., Giroux, V., Malicet, C.,
Villuendas, R., Gironella, M., Gonzalez-Feria, L., Piris, M.A., Iovanna, J.L., Guzman, M.,
Velasco, G., 2006. The stress-regulated protein p8 mediates cannabinoid-induced
apoptosis of tumor cells. Cancer Cell 9, 301–312.
Castells, M.C., Friend, D.S., Bunnell, C.A., Hu, X., Kraus, M., Osteen, R.T., Austen, K.F.,
1996. The presence of membrane-bound stem cell factor on highly immature
nonmetachromatic mast cell in the peripheral blood of a patient with aggressive
systemic mastocytosis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology 98, 831-840.
149
Cerrato, S., Brazis, P., della Valle, M.F., Miolo, A., Puigdemont, A., 2010. Effects of
palmitoyethanolamide on immunologically induced histamine, PGD2 and TNF alpha
release from canine skin mast cells. Veterinary Immunology and Immunopathology
133, 9-15.
Cerrato, S., Brazis, P., Della Valle, M.F., Miolo, A., Petrosino, S., Di Marzo, V.,
Puigdemont, A., 2012a. Effects of palmitoylethanolamide on the cutaneous allergic
inflammatory response in Ascaris hypersensitive Beagle dogs. Veterinary Journal 191,
377-382.
Cerrato, S., Brazis, P., Della Valle, M.F., Miolo, A., Puigdemont, A., 2012b. Inhibitory
effect of topical adelmidrol on antigen-induced skin wheal and mast cell behavior in a
canine model of allergic dermatitis. BMC Veterinary Research 8, 230.
Cevikbas, F., Steinhoff, A., Homey, B., Steinhoff, M., 2007. Neuroimmune interactions
in allergic skin diseases. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 7, 365-373.
Chapman, K.D., 2004. Occurrence, metabolism, and prospective functions of Nacylethanolamines in plants. Progress in Lipid Research 43, 302-27.
Chemin, J., Monteil, A., Perez-Reyes, E., Nargeot, J., Lory, P., 2001. Direct inhibition of
T-type calcium channels by the endogenous cannabinoid anandamide. The EMBO
Journal 20, 7033-7040.
Chen, C.C., Grimbaldeston, M.A., Tsai, M., Weissman, I.L., Galli, S.J., 2005.
Identification of mast cell progenitors in adult mice. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 102, 11408-11413.
Chiappetta, N., Gruber, B. The role of mast cells in osteoporosis. Seminars in arthritis
and Rheumatism 36, 32-36.
Christie, J.F., Dunbar, B., Kennedy, M.W., 1993. The ABA-1 allergen of the nematode
Ascaris suum: epitope stability, mass spectrometry, and N-terminal sequence
comparison with its homologue in Toxocara canis. Clinical and Experimental
Immunology 92, 125-132.
Church et al., 1997
Cindik, E.D., Maurer, M., Hannan, M.K., Müller, R., Hayes, W.C., Hovy, L., Kurth A.A.,
2000. Phenotypical characterization of c-kit receptor deficient mouse femora using
non-destructive high-resolution imaging techniques and biochemical testing.
Technology and Health Care 8, 267-275.
Coburn, A.F., Graham, C.E., Haninger, J., 1954. The effect of egg yolk in diets on
anaphylactic arthritis (passive Arthus phenomenon) in the guinea pig. The Journal of
Experimental Medecine 100, 425-435.
Conigliaro, R., Drago, V., Foster, P.S., Schievano, C., Di Marzo, V., 2011. Use of the
palmitoylethanolamide in the entrapment neuropathy of the median in the wrist.
Minerva Medica 102, 141-147.
150
Conti, S., Costa, B., Colleoni, M., Parolaro, D., Giagnoni, G., 2002. Antiinflammatory
action of endocannabinoid palmitoylethanolamide and the synthetic cannabinoid
nabilone in a model of acute inflammation in the rat. British Journal of Pharmacology
135, 181-187.
Costa, B., Conti, S., Giagnoni, G., Colleoni, M., 2002. Therapeutic effect of the
endogenous fatty acid amide, palmitoylethanolamide, in rat acute inflammation:
inhibition of nitric oxide and cyclo-oxygenase systems. British Journal of Pharmacology
137, 413-420.
Costa, B., Comelli, F., Bettoni, I., Colleoni, M.P., Giagnoni, G., 2008. The endogenous
fatty acid amide, palmitoylethanolamide, has anti-allodynic and anti-hyperalgesic
effects in a murine model of neuropathic pain: involvement of CB1. TRPV1 and
PPARgamma receptors and neurotrophic factors. Pain 139, 541–550.
Costa, J.J., Demtri, G.D., Harrist, T.J., Dvorak, A.M., Hayes, D.F., Merica, E.A.,
Menchaca, D.M., Gringeri, A.J., Schwartz, L.B., Galli, S.J., 1996. Recombinant humans
stem cell factor (kit ligand) promotes human mast cell and melanocyte hyperplasia and
functional activation in vivo. The Journal of Experimental Medecine 183, 2681-2686.
Cota, D., Marsicano, G., Tschöp, M., Grübler, Y, Flachskamm, C., Schubert, M., Auer, D.,
Yassouridis, A., Thöne-Reineke, C., Ortmann, S., Tomassoni, F., Cervino, C., Nisoli, E.,
Linthorst, A.C., Pasquali, R., Lutz, B., Stalla, G.K., Pagotto, U., 2003. The endogenous
cannabinoid system affects energy balance via central orexigenic drive and peripheral
lipogenesis. The Journal of Clinical Investigation 112, 423-431.
Cuss, F.M., 1999. Beyond the histamine receptor: effect of antihistamine on mast cells.
Clinical and Experimental Allergy 29 (Suppl.), 54-59.
Cravatt, B.F., Giang, D.K., Myafield, S.P., Boger, D.L., Lerner, R.A., Gilula, N.B., 1996.
Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid
amides. Nature 384, 83-87.
Croxford, J.L., 2003. Therapeutic potential of cannabinoids in CNS disease. CNS Drugs
17, 179-202.
D'Agostino, G., La Rana, G., Russo, R., Sasso, O., Iacono, A., Esposito, E., Mattace Raso,
G., Cuzzocrea, S., Lo Verme, J., Piomelli, D., Meli, R., Calignano, A., 2009. Central
administration of palmitoylethanolamide reduces hiperalgesia in mice via inhibition of
NF-kB nuclear signaling in dorsal root ganglia. European Journal o Pharmacology 613,
54-59.
De Filippis, J.L., D’Amico, A., Cinelli, M.P., Esposito, G., Di Marzo, V., Iuvone, T., 2009.
Adelmidrol, a palmitoyethanolamide analogue, reduces chronic inflammation in a
carrageenin-granuloma model in rats. Journal of Cellular and Molecular Medecines 13,
1086-1095.
De Filippis, D., D’Amico, A., Cipriano, M., Petrosino, S., Orlando, P., Di Marzo, V.,
Iuvone, T., 2010. Levels of endocannabinoids and palmitoylethanolamide and their
151
pharmacological manipulation in chronic granulomatous inflammation in rats.
Pharmacological Research 61, 321–328.
De Filippis, D., Luongo, L., Cipriano, M., Palazzo, E., Cinelli, M.P., de Novellis, V.,
Maione, S., Iuvone, T., 2011. Palmitoylethanolamide reduces granuloma-induced
hyperalgesia by modulation of mast cell activation in rats. Molecular Pain 7, 3.
De Filippis, D., Negro, L., Vaia, M., Cinelli, M.P., Iuvone, T., 2013. New insights in mast
cell modulation by palmitoylethanolamide. CNS and Neurological Disorders Drug
Targets 12, 78-83.
De Mora, F., Puigdemont, A., Torres, R., 2006. The role of mast cells in atopy: what can
we learn from canine models? A thorough review of the biology of mast cells in canine
and human systems. The British Journal of Dermatology 155, 1109-1123.
De Petrocellis, L., Bisogno, T., Ligresti, A., Bifulco, M., Melck, D., Di Marzo, V., 2002.
Effect on cancer cell proliferation of palmitoylethanolamide, a fatty acid amide
interacting with both the cannabinoid and vanilloid signaling systems. Fundamental
and Clinical Pharmacology 16, 297–302.
De Petrocellis, L., Di Marzo, V., 2010. Non-CB1, non-CB2 receptors for
endocannabinoids, plant cannabinoids, and synthetic cannabimimetics: focus on Gprotein-coupled receptors and transient receptor potential channels. Journal of
Neuroimmune Pharmacology 5, 103-121.
DeBoer, D.J., Cooley, A.J., 2000. Use of induced cutaneous immediate-type
hypersensitivity reactions to evaluate anti-inflammatory effects of triamcinolone
topical solution in three dogs. Veterinary Dermatology 11, 25-33.
DeBoer, D.J., Marsella, R., 2001. The ACVD task force on canine atopic dermatitis (XII):
the relationship of cutaneous infections to the pathogenesis and clinical course of
canine atopic dermatitis. Veterinary Immunology and Immunopathology 81, 12391249.
DeBoer, D.J., 2004. Canine atopic dermatitis: new targets, new therapies. The Journal
of Nutrition 134, 2056S-2061S.
Demitsu, T., Kivosawa, T., Kakurai, M., Murata, S., Yaoita, H., 1999. Local injection of
recombinant human stem cell factor promotes human skin mast cell survival and
neurofibroma cell proliferation in the transplanted neurofibroma in nude mice.
Archives of Dermatological Research 291, 318-324.
Devane, W.A., Hanus, L., Breuer, A., Pertwee, R.G., Stevenson, L.A., Griffin, G., Gibson,
D., Mandelbaum, A., Etinger, A., Mechoulam, R., 1992. Isolation and structure of a
brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 258, 1946-1949.
Di Marzo, V., Fontana, A., Cadas, H., Schinelli, S., Cimino, G., Schwartz, J.C., Piomelli, D.,
1994. Formation and inactivation of endogenous cannabinoid anandamide in central
neurons. Nature, 372, 686-691.
152
Di Marzo, V., Fontana, A., 1995. Anandamide, an endogenous cannabinomimetic
eicosanoid: “killing two birds with one stone”. Prostaglandins, Leukotrienes, and
Essential Fatty Acids 53, 1-11.
Di Marzo, V., Deutsch, D.G., 1998. Biochemistry of the endogenous ligands of
cannabinoid receptors. Neurobiology of Disease 5, 386–404.
Di Marzo, V., Melck, D., Orlando, P., Bisogno, T., Zagoory, O., Bifulco, M., Vogel, Z., De
Petrocellis, L., 2001. Palmitoylehanolmide inhibits the expression of fatty acids mide
hydrolase and enhances the anti-proliferative effect of anandamide in human breast
cancer. The Biochemical Journal 358, 249-255.
Dinh, T, Carpenter, D., Leslie, F.M., Freund, T.F., Katona, I., Sensi, S.L., Kathuria, S.,
Piomelli, D., 2002a. Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid
inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 99, 10819-10824.
Dinh, T.P., Freund, T.F., Piomelli, D., 2002b. A role for monglyceride lipase in 2arachidonoylglycerol inactivation. Chemistry and Physics of lipids 121, 149-158.
Dollery, C.T., Eady, R., Fuller, R.W., Jackson, D.M., Norris, A., Turner, N.C., Vendy, K.,
1985. Bronchial anaphylaxis in Ascaris sensitive dogs. British Journal of Pharmacology
90, 34P.
Dvorak, A.M., 2005. Ultrastructural studies of human basophils and mast cells. The
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 53, 1043-1070.
Eder, W., Ege, M., von Mutius, E., 2006. The asthma epidemic. The New England
Journal of Medecine 355, 2226-2235.
Egli, K.S., Schiessl, B., Roosje, P.J., Seewald, W., Foster, U., Peel, J.E., Welle, M.M.,
2002. Evaluation of the usefulness of sensitization to aeroallergens as a model for
canine atopic dermatitis in genetically predisposed beagles. American Journal of
Veterinary Research 63, 1329–1336.
Egozi, E.I., Ferreira A.M., Burns, A.L., Gamelli, R.L., Dipietro, L.A., 2003. Mast cells
modulate the inflammatory but not the proliferative response in healing wounds.
Wound Repair and Regeneration 11, 46-54.
Ehrilch, P., 1877. Beiträge zur Kenntniss der Anilinfärbung und ihrer Verwendung in der
mikroskopischen Technik. Archiv für Mikroskopische Anatomie 13, 263-278.
Elenkov, I., 2002. Systemic stress-induced Th2 shift and its clinical implication.
International Review of Neurobiology 52, 163-185.
Elias, P.M., Schmuth, M., 2009. Abnormal skin barrier in the etiopathogenesis of atopic
dermatitis. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 9, 437-446.
Elsohly, M.A. and Slade, D., 2005. Chemical constituents of marijuana: the complex
mixture of natural cannabinoids. Life Sciences 78, 539-548.
153
Ennis, M., Amon, E.U., Lorenz, W., 1989. Histamine release from canine lung and liver
mast cells induced by radiographic contrast media. Agents Actions 27, 101-103.
Epps, D.E., Schmid, P.C., Natarajan, V., Schmid, H.H., 1979. N-Acylethanolamine
accumulation in infarcted myocardium. Biochemical and Biophysical Research
Communications 90, 628-633.
Esposito, E., Paterniti, I., Mazzon, E., Genovese, T., Di Paola, R., Galuppo, M.,
Cuzzocrea, S., 2011. Effects of palmitoylethanolamide on release of mast cell
peptidases and neurotrophic factors after spinal cord injury. Brain, Behavoir and
Immunity 25, 1099-1112.
Facci, L., Dal Toso, R., Romanello, S., Buriani, A., Skaper, S.D., Leon, A., 1995. Mast cells
express a peripheral cannabinoid receptor with differential sensitivity to anandamide
and palmitoyethanolamide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 92, 3376-3380.
Finotto, S., Mekori, Y.A., Metcalfe, D.D., 1997. Glucocorticoids decrease tissue mast
cell number by reducing the production of the c-kit ligand, stem cell factor, by resident
cells: in vitro and in vivo evidence in murine systems. The Journal of the Clinical
Investigation 99, 1721-1728.
Frangogiannis, N.G., Lindsey, M.L. Michael, L.H., Youker, K.A., Bressler, R.B., Mendoza,
L.H., Spengler, R.N., Smith C.W., Entman, M.L., 1998. Resident cardiac mast cells
degranulate and release preformed TNF-alpha, initiating the cytokine cascade in
experimental canine myocardial ischemia/reperfusion. Circulation 98, 699-710.
Franklin, A., Parmentier-Batteur, S., Walter, L., Greenberg, D.A., Stella, N., 2003.
Palmitoylethanolamide increases after focal ischemia and potentiates microgial cell
motility. The Journal of Neuroscience 23, 7767-7775
Fuller, R., Johnson, M., Bye, A., 1995. Fluticasone propionate – an update on preclinical
and clinical experience. Respiratory Medecine 89, 3-18.
Galiègue, S., Mary, S., Marchand, J., Dussossou, D., Carriere, D., Carayon, P.,
Bouaboula, M., Shire, D., Le Fur, G., Casellas, P., 1995. Expression of central and
peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte
subpopulations. European Journal of Biochemistry 232, 54-61.
Galli, S.J., 1997. The Paul Kallos Memorial Lecture. The mast cell: a versatile effectors
of cell for a challenging world. International Archives of Allergy and Immunology 113,
14-22.
Galli, SJ, Kalesnikoff, J., Grimbaldeston, M.A., Piliponsky, A.M., Williams, C.M., Tsai, M.,
2005. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances.
Annual Review of Immunology 23, 749-786.
Galli, S.J., Tsai, M., Piliponsky, A.M., 2008. The development of allergic inflammation.
Nature 454, 455-454.
154
Galli, S.J., Tsai, M., 2010. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and
regulatory cells in innate and adaptive immunity. European Journal of Immunology 40,
1843-1851.
Gaoni, U., Mechoulam, R., 1964. Isolation, structure elucidation and partial synthesis
of an active constituent of hashish. Journal of the American Chemical Society 86, 16461647.
Garcia-Ovejero, D., Arevalo-Martin, A., Petrosino, S., Docagne, F., Hagen, C., Bisogno,
T., Watanabe, M., Guaza, C., Di Marzo, V., Molina-Holgado, E. The endocannabinoid
system is modulated in response to spinal cord injury in rats. Neurobiology of Disease
33, 57-71.
Gaudenzio, N., Espagnolle, N., Mars, L.T., Liblau, R., Valitutti, S., Espinosa, E., 2009.
Cell-cell cooperation at the T helper cell/mast cell immunological synapse. Blood, 114,
4979-4988.
Geha, R.S., Jabara, H.H., Brodeur, S.R., 2003. The regulation of immunoglobulin E classswitch recombination. Nature Reviews. Immunology 3, 721-732.
Gilfillan, A.M., Tkaczyk, C., 2006. Integrated signaling pathways for mast-cell activation.
Nature Reviews. Immunology 6, 218-230.
Ginel, P.J., Garrido, C., Lucena, R., 2007. Effects of otic betamethasone on intradermal
testing in normal dogs. Veterinary Dermatology 18, 205-210.
Godlewski, G., Offertáler, L., Wagner, J.A., Kunos, G., 2009. Receptors for
acylethanolamides-GPR55 and GPR119. Prostaglandins and Other Lipid Mediators 89,
105-297.
Gomez Del Pulgar, T., De Ceballos, M.L., Guzman, M., Velasco, G., 2002. Cannabinoids
protect astrocytes from ceramide-induced apoptosis through the phosphatidylinositol
3-kinase/protein kinase B pathway. The Journal of Biological Chemistry 277, 3652736533.
Granberg, M., Fowler, C.J., Jacobsson, S.O., 2001. Effects of the cannabimimetic fatty
acid derivatives 2-arachidonoylglycerol, anandamide, palmitoylethanolamide and
methanandamide upon IgE-dependent antigen-induced beta-hexosaminidase,
serotonin and TNF alpha release from rat RBL-2H3 basophilic leukaemic cells. NaunynSchmiedeberg’s Archives of Pharmacology 364, 66–73.Grassberger, M., Steinhoff, M.,
Schneider, D., Luger, T.A., 2004. Pimecrolimus -- an anti-inflammatory drug targeting
the skin. Experimental Dermatology 13, 721-730.
Griffin CE., 1993. Canine atopic disease. In: Griffin, C.E., Kwochka, K.W., MacDonald,
J.M. (Eds.). Current Veterinary Dermatology: The Science and Art of Therapy. Mosby
Year Book, St. Louis, USA, pp. 99–120.
Griffin, G., Tao, Q., Abood, M.E., 2000. Cloning and pharmacological characterization of
the rat CB(2) cannabinoid receptor. Journal of the Pharmacology and Experimental
Therapeutics 292, 886–894.
155
Griffin, C.E., DeBoer, D.J., 2001. The ACVD task force on canine atopic dermatitis (XIV):
clinical manifestations of canine atopic dermatitis. Veterinary Immunology and
Immunopathology 81, 255-269.
Grimbaldeston, M.A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S.J., 2007. Mast cellderived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic
irradiation with ultraviolet B. Nature Immunology 8, 1095-1104.
Gröne, A., 2002. Keratinocytes and cytokines. Veterinary Immunology and
Immunopahtology 88, 1-12.
Gschwandtner, M., Purwar, R., Wittman, M., Bäumer, W., Kietzmann, M., Werfel, T.,
Gutzmer, R., 2008. Histamine upregulates keratinocyte MMP-9 production via the
histamine H1 receptor. The Journal of Investigative Dermatology 128, 2783-2791.
Guida, G., de Martino, M., de Fabiani, A., Cantieri, L., Alexandre, A., Vassallo, G.M.,
Rogai, M., Lanaia, F., Petrosino, S., 2010. La palmitoiletanolamida (Normast®) en el
dolor neuropático crónico por lumbociatalgia de tipo compresivo: estudio clínico
multicéntrico. Dolor 25, 35-42.
Guillemin, R., Ling, N., Burgus, R., Bloom, F., Segal, D., 1977. Characterization of the
endorphins, novel hypothalamic and neurohypophysial peptides with opiate-like
activity:
evidence
that
they
induce
profound
behavioural
change.
Psychoenuroendocrinology 2, 59-62.
Gutiérrez, T., Farthing, J.N., Zvonok, A.M., Makriyannis, A., Hohmann, A.G., 2007.
Activation of peripheral cannabinoid CB1 and CB2 receptors suppresses the
maintenance of inflammatory nociception: a comparative analysis. British Journal of
Pharmacology 150, 153-163.
Hakim-Rad, K., Metz, M., Maurer, M., 2009. Mast cells: makers and breakers of allergic
inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 9, 427-430.
Halliwell, R., 2006. Revised nomenclature for veterinary allergy. Veterinary
Immunology and Immunopathology 114, 2007-2008.
Hammerberg, B., Olivry, T., Orton, S.M., 2001. Skin mast cell histamine release
following stem cell factor and high-affinity immunoglobulin E receptor cross-linking in
dogs with atopic dermatitis. Veterinary Dermatology 12, 339–346.
Hansen, H.S., Moesgaard, B., Hansen, H.H., Petersen, G., 2000. N-Acylethanolamines
and precursor phospholipids-relation to cell injury. Chemistry and Physics of Lipids 108,
135-150.
Harvima, I.T., 2008. Induction of matrix metalloproteinase-9 in keratinocytes by
histamine. The Journal of Investigative Dermatology 128, 2748-2750.
Hashimotodani, Y., Ohno-Shosaku, T., Kano, M., 2007. Endocannabinoids and synaptic
function in the CNS. The Neuroscientist 13, 127-137.
156
Herkenham, M., Lynn, A.B., Little, M.D., Johnson, M.R., Melvin, L.S., de Costa, B.R.,
Rice, K.C.., 1990. Cannabinoid receptor localization in brain. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 87, 1932-1936.
Herkenham, M., Lynn, A.B., Johnson M.R., Melvin, L.S., de Costa, B.R., Rice, K.C., 1991.
Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative
in vitro autoradiographic study. The Journal of Neuroscience 11, 563-583.
Hillier, A., Griffin, C.E., 2001. The ACVD task force on canine atopic dermatitis:
Incidence and prevalence. Veterinary Immunology and Immunopahtology 81, 147-151.
Hirai, H., Tanaka, K, Yoshie, O., Ogawa, K., Kenmotsu, K., Takamori, Y., Ichimasa M.,
Sugamura, K., Nakamura, M., Takano, S., Nagata, K., 2001. Prostaglandin D2 selectively
induces chemotaxis in T helper type 2 cells, eosinophils, and basophils via seventransmembrane receptor CRTH2. The Journal of Experimental Medecine 193, 255-261.
Hirshman, C.A., 1985. The basenji-greyhound dog model of asthma. Chest 87S, 172S178S.
Ho, W.S., Barnett, D.A., Randall, M.D., 2008. “Entourage” effects of Npalmitoylethanolamide and N-oleoylethanolamide on vasorelaxation to anandamide
occur through TRPV1 receptors. British Journal of Pharmacology 155, 837-846.
Hoareau, L., Buyse, M., Festy, F., Ravanan, P., Gonthier, M.P., Matias, I., Petrosino, S.,
Tallet, F., d'Hellencourt, C.L., Cesari, M., Di Marzo, V., Roche, R., 2009. Antiinflammatory effect of palmitoylethanolamide on human adipocytes. Obesity (Silver
Spring) 17, 431-438.
Holgate, S.T., Robinson, C., Church, M.K., 1993. Mediators of immediate
hypersensitivity. In: Middelton, Jr. (Ed.). Allergy: Principles and Practice. St. Louis, USA,
pp. 267-301.
Holgate, S.T., Church, M.K., 1995. Allergy. In: Holgate, S.T., Church, M.K., (Eds.). Allergy,
Mosby-Wolfe Publishing, London, United Kingdom.
Holgate, S.T., 1999. The epidemic of allergy and asthma. Nature 402, B2-B4.
Howlett, A.C., Mukhopadhyay, S., 2000. Cellular signal transduction by anandamide
and 2-arachidonoylglycerol. Chemistry and Physics of Lipids 108, 53–70.
Howlett, A.C., Breivogel, C.S., Childers, S.R., Deadwyler, S.A., Hampson, R.E., Porrino,
L.J., 2004. Cannabinoid physiology and pharmacology: 30 years of progress.
Neuropharmacology 47, 345-358.
Hsu, C.L., Nielsen, C.V., Bryce, P.J., 2010. IL-33 is produced by mast cells and regulates
IgE-dependent inflammation. PLoS One 5, e11944.
Hungness. S.I., Akin, C., 2007. Mastocytosis: advances in diagnosis and treatment.
Current Allergy Asthma Reports 7, 248-254.
157
Irani, A.A., Nilsson, G., Ashman, L. K., Schwartz, L.B., 1995. Dexamethasone inhibits the
development of mast cells from dispersed human fetal liver cells cultured in the
presence of recombinant human stem cell factor. Immunology 84, 72-78.
Ishizuka, T., Matsui, T., Okamoto, Y., Ohta, A., Shichijo, M., 2004. Ramatroban (BAY U
3405): a novel dual antagonist of TXA2 receptor and CRTh2, a newly indentified
prostaglandin D2 receptor. Cardiovascular Drug Reviews 22, 71-90.
Iuvone, T., De Filippis, D., D’Amico, A., Petrosino, S., Di Marzo, V., 2007. Protective role
of aliamides and endocannabinoid system during lambda-carrageenan-induced
granuloma formation. In: Proceedings 3rd International Conference on ‘‘Phospholipase
A2 and Lipid Mediators’’, Sorrento, Italy, pp. 143.Jacob, A. and Todd, A. R., 1940.
Cannabis indica. Part II. Isolation of cannabidiol from Egyptian hashish. Observations
on the structure of cannabinol. Journal of the American Chemical Society, 649-653.
Jacobsson, S.O., Fowler, C.J., 2001. Characterization of palmitoylethanolamide
transport in mouse Neuro-2a neuroblastoma and rat RBL-2H3 basophilic leukaemia
cells: comparison with anandamide. British Journal of Pharmacology 132, 1743-1754.
Jaggar, S.I., Hasnie, F.S., Sellaturay, S., Rice, A.S., 1998. The anti-hyperalgesic actions of
the cannabinoid anandamide and the putative CB2 receptor agonist
palmitoylethanolamide in visceral and somatic inflammatory pain. Pain 76, 189-199.
Johnson, M., 1998. Development of fluticasone propionate and comparison with other
inhaled corticoesteroids. The Journal of Allergy and Clinical Immunology 101, S434S439.
Jonsson, K.O., Vandevoorde, S., Lambert, D.M., Tiger, G., Fowler, C.J., 2001. Effects of
homologues and analogues of palmitoylethanolamide upon the inactivation of the
endocannabinoid anandamide. British Journal of Pharmacology 133, 1263-1275.
Jonsson, K.O., Persson, E., Fowler, C.J., 2006. The cannabinoid CB(2) receptor selective
agonist JWH133 reduces mast cell oedema in response to compound 48/80 in vivo but
not the release of betahexosaminidase from skin slices in vitro. Life Sciencies 78, 598–
606.
Kambayashi, T., Baranski, J.D., Baker, R.G., Zou, T., Allenspach, E.J., Shoag, J.E., Jones,
P.L., Koretzky, G.A., 2008. Indirect involvement of allergen-captured mast cells in
antigen presentation. Blood 111, 1489-1496.
Kambayashi, T., Allenspach E.J.,Chang, J.T., Zou, T., Shoag, J.E., Reiner, S.L., Canton,
A.J., Koretzky, G.A., 2009. Inducible MHC class II expression by mast cells supports
effector and regulatory T cell activation. Journal of Immunology 182, 4686-4695.
Kanaoka, Y., Boyce, J.A., 2004. Cysteinyl leukotrienes and their receptors: cellular
distribution and function in immune and inflammatory responses. Journal of
Immunology 173, 1503-1510.
Karsak, M., Gaffal, E., Date, R., Wang-Eckhardt, L., Rehnelt, J., Petrosino, S., Starowicz,
K., Steuder, R., Schlicker, E., Cravatt, B., Mechoulam, R., Buettner, R., Werner, S., Di
158
Marzo, V., Tüting, T., Zimmer, A., 2007. Attenuation of allergic contact dermatitis
through the endocannabinoid system. Science 316, 1494-1497.
Kawakami, T., Ando, T., Kimura, M., Wilson, B.S., Kawakami, Y., 2009. Mast cell in
atopic dermatitis. Current Opinion in Immunology 21, 666-678.
Kay, A.B., 2000. Overview of allergy and allergic diseases: with a view to the future.
British Medical Bulletin 56, 843-864.
Kay, A.B., 2001. Allergy and allergic diseases. First of two parts. New England Journal of
Medecine 344, 30-37.
Keppel-Hesselink, J.M., 2012. New targets in pain, non-neuronal cells, and the role of
palmitoylethanolamide. The Open Pain Journal 5, 12-23.
Kinet, J.P., 2007. The essential role of mast cells in orchestrating inflammation.
Immunological Reviews 217, 5-7.
King, S.J., Miller, H.R., Newlands, G.F., Woodbury R.G., 1985. Depletion of mucosal
mast cell protease by corticosteroids: effect on intestinal anaphylaxis in the rat.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82,
1214-1218.
Kitamura, Y., Ito, A., 2005. Mast cell-commited progenitors. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 102, 11129-11130.
Kovalik, M., Thoday, K.L., van den Broek, A.H., 2012. The use of ciclosporin in
veterinary dermatology. Veterinary Journal 193, 317-325.
Kraft, S., Kinet, J.P., 2007. New developments in FcεRI regulation, function and
inhibition. Nature Reviews. Immunology 7, 365-378.
Kube, P., Audige, L., Kuther, K., Welle, M., 1998. Distribution, density and
heterogeneity of canine mast cells and influence of fixation techniques. Histochemistry
and Cell Biology 110, 129-135.
Kuehl, F.A.Jr., Jacob, T.A., Ganley, O.H., Ormond, R.E., Meisinger, M.A.P., 1957. The
identification of N-(2-hydroxyethyl)-palmitamide as a naturally occuring antiinflammatory agent. Journal of the American Chemical Society 79, 5577-5578.
Lambert, D.M., Vandevoorde, S., Jonsson, K.O., Fowler, C.J., 2002. The
palmitoylethanolamide family: a new class of anti-inflammatory agents? Current
Medecinal Chemistry 9, 663-74.
Larché, M., Akdis, C.A., Valenta, R., 2006. Immunological mechanism of allergenspecific immunotherapy. Nature Reviews. Immunology 6, 761-771.
Lau, A.H., Chow, S.S., 2003. Effects of cannabinoids receptor agonist on
immunologically induced histamine release from rat peritoneal mast cells. European
Journal of Pharmacology 464, 229–235.Lawson, J.A., Senthilselvan, A., 2005. Asthma
epidemiology: has the crisis passed? Current Opinion in Pulmonary Medecine 11, 7984.
159
Lee, M.J., Shin, T.J., Lee, J.E., Choo, H., Koh, H.Y., Chung, H.J., Pae, A.N., Lee, S.C., Kim,
H.J., 2010. KST5468, a new T-type calcium channel antagonist, has an antinociceptive
effect on inflammatory and neuropathic pain models. Pharmacology, Biochemistry and
Behavior 97, 198-204.
Li, H.L. and Lin, H., 1974. An archeological and historical account of cannabis in China.
Economic Botany 28, 437-447.
Liu, J., Farmer, J.D.Jr, Lane, W.L., Friedman, J., 1991. Calcineurin is a common target of
cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes. Cell 66, 807-815.
Lo Verme, J., Fu, J., Astarita, G., La Rana, G., Russo, R., Calignano, A., Piomelli, D., 2005.
The nuclear receptor PPAR-a mediates the anti-inflammatory actions of
palmitoylethanolamide. Molecular Pharmacology 67, 15–19.
Lo Verme, J., Russo, R., La Rana, G., Fu, J., Farthing, J., Mattace-Raso, G., Meli, R.,
Hohmann, A., Calignano, A., Piomelli, D., 2006. Rapid broad-spectrum analgesia
through activation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha. The Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics 319, 1061-1061.
Long, D.A., Martin, A.J., 1956. Factor in arachis oil depressing sensitivity to tuberculin
in B.C.G.-infected guineapigs. Lancet 270, 464-466.
Luongo, L., Guida, F., Gatta, L., de Novellis, V., Maione, S., 2011.
Palmitoylethanolamide systemic treatment reduces spinal and supraspinal formalininduced neuroinflammation and allodynia. Shock 36 (Suppl.), 22.
Lynn, A.B., Herkenham, M., 1994. Localization of cannabinoid receptors and
nonsaturable high-density cannabinoid binding sites in peripheral tissues of the rat:
implications for receptor-mediated immune modulation by cannabinoids. The Journal
of Pharmacology and Experimental Therapeutics 268, 1612-1623.
Mackie, K., Hille, B., 1992. Cannabinoids inhibit N-type calcium channels in
neuroblastoma-glioma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 89, 2825-3829.
Maccarrone, M., Fiorucci, L., Erba, F., Bari, M., Finazzi-Agrò, A., Ascoli, F., 2000. Human
mast cells take up and hydrolyze anandamide under the control of 5-lipoxygenase and
do not express cannabinoid receptors. FBS Letters 468, 176-180.
Maeyama, K., Emi, M., Tachibana, M., 2005. Nuclear receptors as targets for drug
development: peroxisome proliferator-activated receptor gamma in mast cells: its
roles in proliferation and differentiation. Journal of Pharmacological Sciences 97, 190194.
Marshall, J.S., 2004. Mast-cell responses to pathogens. Nauture Reviews. Immunology
4, 787-799.
Masek, K., Perlík, F., Klíma, J., Kahlich, R., 1974. Prophylactic efficacy of N-2hydroxyethyl palmitamide (impulsin) in acute respiratory tract infections. European
Journal of Clinical Pharmacology 7, 415-419.
160
Mastrofrancesco, A., Ottaviani, M., Aspite, N., Cardinali, G., Izzo, E., Graupe, K.,
Zouboulis, C.C., Camera, E., Picardo, M., 2010. Azelaic acid modulates the
inflammatory response in normal human keratinocytes through PPARgamma
activation. Experimental Dermatology 19, 813-820.
Matias, I., Gonthier, M.P., Petrosino, S., Docimo, L., Capasso, R., Hoareau, L.,
Monteleone, P., Roche, R., Izzo, A.A., Di Marzo, V., 2002. Role and regulation of
acyethanolamides in energy balance: focus on adipocytes and beta-cells. British
Journal of Pharmacology 152, 676-690.
Matias, I., Carta, G., Murru, E., Petrosino, S., Banni, S., Di Marzo, V., 2007. Effect of
polyunsaturated fatty acids on endocannabinoid and N-acyl-ethanolamine levels in
mouse adipocytes.
Matsuda, L.A., Lolati, S.J., Brownstein, M.J., Young, A.C., Bonner, T.I., 1990. Structue of
a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature 346,
561-564.
Matsuda, H., Y. Kannan, H. Ushio, Y. Kiso, T. Kanemoto, H. Suzuki, Kitamura, Y., 1991.
Nerve growth factor induces development of connective tissue-type mast cells in vitro
from murine bone marrow cells. The Journal of Experimental Medecine 174. 7-14.
Matsumoto, I., Inoue, Y., Shimada, T., Aikawa, T., 2001. Brain mast cells act as an
immune gate to the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in dogs. The Journal of
Experimental Medecine 194, 71-78.
Maurer, M., Fischer, E., Handjiski, B., von Stebut, E., Algermissen, B., Bavandi, A., Paus,
R., 1997. Activated skin mast cells are involved in murine hair follicle regression
(catagen). Laboratory Investigation 77, 319-322.
Maurer, M., Theoharide, T., Granstein, R.D., Bischoff, S.C., Bienenstock, J., Henz, B.,
Kovanen, P., Piliponsky, A.M., Kambe, N., Vliagoftis, H., Levi-Schaffer, F., Metz, M.,
Miyachi, Y., Befus, D., Forsythe, P., Kitamura, Y., Galli, S., 2003. What is the
physiological function of mast cells? Experimental Dermatology 12, 886-910.
Mazzari, S., Canella, R., Petrelli, L., Marcolongo, G., Leon, A., 1996. N-(2hydroxyethyl)hexadecanamide is orally active in reducing edema formation and
inflammatory hyperalgesia by down-modulating mast cell activation. European Journal
of Pharmacology 300, 227-236.
Mechoulam, R., Ben-Shabat, S., Hanus, L., Ligumsky, M., Kaminski, N.E., Schatz, A.R.,
Gopher, A., Almog, S., Martin, B.R., Compton, D.R., Pertwee, R.G., Griffin, G.,
Bayewitch, M., Barg, J., Vogel, Z., 1995. Identification of an endogenous 2monoglyceride, present in canine gut, that binds to cannabinoid receptors.
Biochemical Pharmacology 50, 83-90.
Merlos, M., Giral, M., Balsa, D., Ferrando, R., Queralt, M., Puigdemont, A., GarciaRafanell, J., Forn, J., 1997. Rupatadine, a new potent, orally active dual antagonist of
histamine and platelet-activating factor (PAF). The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics 280, 114-121.
161
Milgrom, H., Fick, R.B. Jr, Su J.Q., Reimann, J.D., Bush, R.K., Watrous, M.L., Metzger,
W.J., 1999. Treatment of allergic asthma with monoclonal ant-IgE antibody. rhuMAbE25 Study Group. The New England Journal of Medecine 341, 1966-73.
Moesgaard, B., Petersen, G., Jaroszewski, J.W., Hansen, H.S., 2000. Age dependent
accumulation of N-acyl-ethanolamine phospholipids in ischemic rat brain. A (31)P NMR
and enzyme activity study. Journal of Lipid Research 41, 985-990.
Molina-Holgado, E., Vela, J.M., Arevalo-Martin, A., Almazan, G., Molina-Holgado, F.,
Borrell, J., Guaza, C., 2002. Cannabinoids promote oligodendrocyte progenitor survival:
involvement of cannabinoid receptors and phosphatidylinositol-3 kinase/Akt signaling.
The Journal of Neuroscience 22, 9742–9753.
Moon, T.C., St Laurent C.D., Morris, K.E., Marcet, C., Yoshimura, T., Sekar, Y., Befus,
A.D., 2009. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and
function. Mucosal Immunology 3, 111-128.
Moqbel, R., Walsh, G.M., Macdonald, A.J., Kay, B., 1986. Effect of disodium
cromoglycate on activation of human eosinophils and neutrophils following reversed
(anti-IgE) anaphylaxis. Clinical Allergy 16, 73-83.
Morimoto, M., Tsujimura, T., Kanamura, Y., Kitamura, Y., Matsuda, H., 1998.
Expression of c-kit and stem cell factor mRNA in liver specimens from healthy adult
dogs. American Journal of Veterinary Research 59, 63-66.
Mu, J., Zhuang, S.Y., Kirby, M.T., Hampson, R.E., Deadwyler, S.A., 1999. Cannabinoid
receptors differentially modulate potassium A and D currents in hippocampal neurons
in culture. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 291, 893-902.
Muccioli, G.G., Stella, N., 2008. Microglia
palmitoylethanolamide. Neuropharmacology 54, 16-22.
produce
and
hydrolyze
Muccioli, G.G., Sia, A., Muchowski, P.J., Stella, N., 2009. Genetic manipulation of
palmitoylethanolamide: Production and inactivation in Saccharomyces cerevisiae. PLoS
ONE 4, e5942.
Muccioli, G.G., 2010. Endocannabinoid biosynthesis and inactivation, from simple to
complex. Drug Discovery Today 15, 474-483.
Munro, S., Thomas, K.L., Abu-Shaar, M., 1993. Molecular characterization of a
peripheral receptor for cannabinoids. Nature 365, 61-65.
Muramatsu, M., Katada, J., Hayashi, I., Majima, M., 2000. Chymase a proangiogenic
factor. A possible involvement of chymase-angiotensin dependent pathway in the
hamster sponge angiogenesis model. The Journal of Biological Chemistry 275, 55455552.
Nagasaka, A., Matsue, H., Matsushima, H., Aoki, R., Nakamura, Y., Kambe, N., Kon, S.,
Uede, T., Shimada, S., 2008. Osteopontin is produced by mast cells and affects IgEmediated degranulation and migration of mast cells. European Journal of Immunology
38, 489-499.
162
Nazzaro-Porro, M., 1987. Azelaic acid. Journal of the American Academy of
Dermatology 87, 1033-1041.
Nesbitt, G.H., Kedan, G.S., Caciolo, P., 1984. Canine atopy. Part II. Management.
Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian 6, pp. 264–78.
Nødtvedt, A., Bergwall, K., Emanuelson, U., Egenvall, A., 2006. Canine atopic
dermatitis: validation of recorded diagnosis against practice records in 335 insured
Swedish dogs. Acta Veterinaria Scandinavica 48, 8.
Noli, C., Miolo, A., 2001. The mast cell in wound healing. Veteinary Dermatology 12,
303-313.
Noviana, D., Mamba, K., Makimura, S., Horii, Y., 2004. Distribution, histochemical and
enzyme histochemical characterization of mast cells in dogs. Journal of Molecular
Histology 35, 123-132.
Nutall, T.J., Knight, P.A., McAleese, S.M., Lamb, J. R., Hill, P.B., 2002. Expression of TH1,
TH2, and immunosuppressive cytokine gen transcripts in canine atopic dermatitis.
Clinical and Experimental Allergy 94, 789-795.
O’Shaughnessy, W.B., 1938-1940. On the preparations of the Indian hemp (Cannabis
indica); their effects on the animal system in health, and their utility in the treatment
of tetanus and other convulsive diseases. Transactions of the Medical and Physical
Society, Bengal 71-102, 421-426.
O’Sullivan, S.E., 2007. Cannabinoids go nuclear: evidence for activation of peroxisome
proliferator-activated receptors. British Journal of Pharmacology 152, 576-582.
Olivry, T., Moore, P.F., Affolter, V.K., Naydan, D.K., 1996. Langerhans cell hyperplasia
and IgE expression in canine atopic dermatitis. Archives of Dermatological Research
288, 579-585.
Olivry, T., Naydan, D.K., Moore, P.F., 1997. Characterization of the cutaneous
inflammatory infiltrate in canine atopic dermatitis. The American Journal of
Dermopathology 19, 477-486.
Olivry, T., Dunston, S.M., Murphy, K.M., Moore, P.F., 2001. Characterization of the
inflammatory infiltrate during IgE-mediated late phase reactions in the skin of normal
and atopic dogs. Veterinary Dermatology 12, 49-58.
Olivry T, DeBoer DJ, Favrot C, Jackson HA, Mueller RS, Nuttall T, Prélaud P;
International Task Force on Canine Atopic Dermatitis., 2010. Treatment of canine
atopic dermatitis: 2010 clinical practice guidelines from the International Task Force on
Canine Atopic Dermatitis. Veterinary Dermatology 21, 233-48.
Osborne, M.L., Sommerhoff, C.P., Nadel, J.A., McDonald, D., 1989. Histochemical
comparison of mast cells obtained from the airways of mongrel dogs and Basenjigreyhound dogs by bronchoalveolar lavage. The American Review of Respiratory
Disease 140, 749-755.
163
Osei-Hyiaman, D., DePetrillo, M., Pacher, P., Liu, J., Radaeva, S., Bátkai, S., HarveyWhite, J., Mackie, K., Offertáler, L., Wang, L., Kunos, G., 2005. Endocannabinoid
activation at hepatic CB1 receptors stimulates fatty acid synthesis and contributes to
diet-induced obesity. Journal of Clincal Investigation 115, 1298-1305.
Ozalp, A., Barroso, B., 2009. Simultaneous quantitative analysis
acylethanolamides in clinical samples. Analytical Biochemistry 395, 68–76.
of
N-
Pache, I., Rogler, G., Felley, C., 2009. TNF-alpha blockers in inflammatory bowel
diseases: practical consensus recommendations and user’s guide. Swiss Medical
Weekly 139, 278-287.
Pastore, S., Mascia, F., Giustizieri, M., Giannetti, A., Girolomoni, G., 2000. Pathogenetic
mechanisms of atopic dermatitis. Archivium Immunologiae et Therapiae
Experimentalis 48, 497-504.
Patalano, F., Ruggieri, F., 1989. Sodium cromoglycate: a review. The European
Respiratory Journal 6 (Suppl.), 556s-560s.
Pearce, F.L., Befus, A.D., Gauldie, J., Bienenstock, J., 1982. Mucosal mast cells II. Effects
of anti-allergic compound on histamine secretion by isolated intestinal mast cells.
Journal of Immunology 128, 2481-2486.
Peeters, D., Day, M.J., Clercx, C., 2005. Distribution of leucocyte subsets in bronchial
mucosa from dogs with eosinophilic bronchopneumopathy. Journal of comparative
pathology 133, 128-135.
Perlik, F., Raskova, H., Elis, J., 1971. Anti-inflammatory properties of N(2-hydroxyethyl)
palmitamide. Acta Physiologica Academiae Scientirarum Hungaricae 39, 395-400.
Pertwee, R.G., 1997. Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors.
Pharmacology & Therapeutics 74, 129-180.
Pertwee, R.G., Howlett A.C., Abood, M.E., Alexander, S.P., Di Marzo, V., Elphick, M.R.,
Greasley, P.J., Hansen, H.S., Kunos, G., Mackie, K., Mechoulam, R., Ross, R.A., 2010.
International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXIX. Cannabinoid receptors
and their ligands: beyond CB1 and CB2. Pharmacological Reviews 62, 588-631.
Petrosino, S., Di Marzo, V., 2009. Anandamide and Other Acylethanolamides. In:
Tettamanti, G., Goracci, G. (Eds.). Handbook of neurochemistry and molecular
neurobiology. Neural Lipids, 3rd edition, Springer, New York, USA, pp.75-98.
Petrosino, S., Cristino, L., Karsak, M., Gaffal, E., Udea, N., Tüting, T., Bisogno, T., De
Filippis, D., D’Amico, A., Saturnino, C., Orlando, P., Zimmer, A., Iuvone, T., Di Marzo, V.,
2010a. Protective role of palmitoylethanolamide in contact allergic dermatitis. Allergy
65, 698-711.
Petrosino, S., Iuvone, T., Di Marzo, V., 2010b. N-palmitoyl-ethanolamine: Biochemistry
and new therapeutic opportunities. Biochimie 92, 724-727.
164
Pipkorn, U., Hammarlund, A., Enerback, L., 1989. Prolonged treatment with topical
glucocorticoids results in an inhibition of the allergen-induced weal-and-flare response
and reduction in skin mast cell numbers and histamine content. Clinical and
Experimental Allergy 19, 19-25.
Pucheu-Haston, C.M., Shuster, D., Olivry, T., Brianceau, P., Lockwood, P., McClanahan,
T., de Waal Malefyt, R., Mattson, J.D., Hammerberg, B., 2006. A canine model of
cutaneous late-phase reactions: prednisolone inhibition of cellular and cytokine
responses. Immunology 117, 177-187.
Pushparaj, P.N., Tay, H.K, H’Ng, S.C., Pitman, N., Xu, D., McKenzie, A., Liew, F.Y.,
Melendez, A.J., 2009. The cytokine interleukin-33 mediates anaphylactic shock.
Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 106,
9773-9778.
Queralt, M., Merlos, M., Giral, M., Puigdemont, A., 1996. Dual effect of a new
compound, rupatadine, on edema induced by platelet-activating factor and histamine
in dogs: comparison with antihistamines and PAF antagonists. Drugs Development
Research 39, 12-18.
Queralt et al., 1998; Queralt, M., Brazis, P., Merlos, M., Puigdemont, A., 1998.
Inhibitory effects of rupatadine on mast cell histamine release and skin wheal
development induced by Ascaris suum in hypersensitive dogs. Drug Development
Research 44, 49–55.
Rao, K.N., Brown, M.A. Mast cells: multifaceted immune cells with diverse roles in
health and disease. Annals of the New York Academy of Sciences 1143, 83-104.
Re, G., Barbero, R., Miolo, A., Di Marzo, V., 2007. Palmitoylethanolamide,
endocannabinoids and related cannabimimetic compounds in protection against tissue
inflammation and pain: Potential use in companion animals. Veterinary Journal 173,
23-32.
Rivera, J., Gilfillan, A.M., 2006. Molecular regulation of mast cell activation. The Journal
of Allergy and Clinical Immunology 117, 1214-1225.
Rivierre, C., Dunston, S.M., Olivry, T., 2000. Effects of a 1 per cent hydrocortisone
conditioner on the prevention of immediate and late-phase reactions in canine skin.
Veterinary Records 147:739-742.
Rodríguez de Fonseca, F., Navarro, M., Gómez, R., Escuredo, L., Nava, F., Fu., MurilloRodríguez, E., Giuffrida, A., Lo Verme, J., Gaetani, S., Kathuria, S., Gall, C., Piomelli, D.,
2001. An anorexic lipid mediator regulated by feeding. Nature 414, 209-212.
Romagnani, S., 2002. Cytokines and chemoattractants in allergic inflammation.
Molecular Immunology 38, 881-885.
Rosenkrantz, W., 2006. Practical applications of topical therapy for allergic, infectious,
and seborrheic disorders. Clinical Techniques in Small Animal Practise 21, 106-116.
165
Ross, R.A., 2003. Anandamide and vanilloid TRPV1 receptors. British Journal of
Pharmacology 140, 790-801.
Roßbach, K., Stark, H., Sander, K., Leurs, R., Kietzmann, M., Baümer, W., 2009. The
histamine H4 receptor as a new target for treatment of canine inflammatory skin
diseases. Veterinary Dermatology 20, 555–561.
Rossi, S., Furlan, R., De Chiara, V., Muzio, L., Musella, A., Motta, C., Studer, V.,
Cavasinni, F., Bernardi, G., Martino, G., Cravatt, B.F., Lutz, B., Maccarrone, M.,
Centonze, D., 2011. Cannabinoid CB1 receptors regulate neuronal TNF-α effects in
experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior and Immunity 25, 12421248.
Samson, M.T., Small-Howard, A., Shimoda, L.M., Koblan-Huberson, M., Stokes, A.J.,
Turner, H., 2003. Differential roles of CB1 and CB2 cannabinoid receptors in mast cells.
Journal of Immunology 170, 4953–4962.
Sasso, O., Russo, R., Vitiello, S., Mattace Raso G., D'Agostino, G., Iacono, A., La Rana, G.,
Vallée, M., Cuzzocrea, S., Piazza, P.V., Meli, R., Calignano, A., 2012. Implication of
allopregnanolone in the antinociceptive effect of N-palmitoylethanolamide in acute or
persistent pain. Pain, 153:33-41.
Sawada, J., A. Itakura, A. Tanaka, T. Furusaka, Matsuda, H., 2000. Nerve growth factor
functions as a chemoattractant for mast cells through both mitogen-activated protein
kinase and phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathways. Blood 95, 2052–2058.
Scarampella, F., Abramo, F., Noli, C., 2001. Clinical and histological evaluation of an
analogue of palmitoylethanolamide, PRL 120 (comicronized Palmdirol INN) in cats with
eosinophilic granuloma and eosinophilic plaque: a pilot study. Veterinary Dermatology
12, 29-39.
Schäbitz, W.R., Giuffrida, A., Berger, C., Aschoff, A., Schwaninger, M., Schwab, S.,
Piomelli, D., 2002. Release of fatty acid amides in a patient with hemispheric stroke: a
microdialysis study. Stroke 33, 2112-2114.
Schmid, P.C., Kuwae, T., Krebsbach, R.J., Schmid, H.H., 1997. Anandamide and other Nacylethanolamines in mouse peritoneal macrophages. Chemistry and Physics of Lipids
87, 103-110.
Schmid, H.H., Berdyshev, E.V., 2002. Cannabinoid receptor-inactive Nacylethanolamines and other fatty acid amides: metabolism and function.
Prostaglandins, Leukotriens, and Essential Fatty Acids 66, 363-76.
Scott, D.W., 2001. Skin immune system and allergic skin disease. In: Scott, D.W.,
Miller, W.H., Griffin, C.E. (Eds). Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 6th edition,
WB Saunders, Philadelphia, USA, pp. 543-666.
Sheerin, A.H., Zhang, X., Saucier, D.M., Corcoran, M.E., 2004. Selective antiepileptic
effects of N-plamitoyethanolamide, a putative endocannabinoid. Epilepsia 45, 11841188.
166
Showalter, V.M., Compton, D.R., Martin, B.R., Abood, M.E., 1996. Evaluation of binding
in a transfected cell line expressing a peripheral cannabinoid receptor (CB2):
identification of cannabinoid receptor subtype selective ligands. The Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics 278, 989–999.
Shull, R.M., Suggs, S.V., Langley, K.E., Okino, K.H., Jacobsen, F.W., Martin, F.H., 1992.
Canine stem cell factor (c-kit ligand) supports the survival of hematopoietic
progenitors in long term canine marrow culture. Experimental Hematology 20, 111811124.
Silverstein, A.M., 2000. Clemens Freiherr von Pirquet: explaining immune complex
disease in 1906. Nature Immunology 1, 453-455.
Skaper, S.D., Buriani, A., Dal Toso, R., Petrelli, L., Romanello, S., Facci, L., Leon, A., 1996.
The ALIAmide palmitoylethanolamide and cannabinoids, but not anandamide, are
protective in a delayed postglutamate paradigm of excitotoxic death in cerebellar
granule neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 93, 3984-3989.
Smart, D., Gunthorpe, M.J., Jerman, J.C., Nasir, S., Gray, J., Muir, A.I., Chambers, J.K.,
Randall, A.D., Davis, J.B., 2000. The endogenous lipid anandamide is a full agonist at
the human vanilloid receptor (hvr1). British Journal of Pharmacology 129, 227–230.
Smart, D., Jonsson, K.O., Vandevoorde, S., Lambert, D.M., Fowler, C.J., 2002.
‘Entourage’ effects of n-acyl ethanolamines at human vanilloid receptors. Comparison
of effects upon anandamide-induced vanilloid receptor activation and upon
anandamide metabolism. British Journal of Pharmacology 136, 452–458.
Smith, S.J., Piliponsky, A.M., Rosenhead, F., Elchalal, U., Nagler, A., Levi-Schaffer, F.,
2002. Dexamethasone inhibits maturation, cytokine production and Fc epsilon RI
expression of human cord blood-derived mast cells. Clincal and Experimental Allergy
32, 906-913.
Soll, A.H., Toomey, M., Culp, D., Shanahan, F., Beaven, M.A., 1988. Modulation of
histamine release from canine fundic mucosal mast cells. The American Journal of
Physiology 254, G40-G48.
Stander, S., Moormann, C., Schumacher, M., Buddenkotte, J., Artuc, M., Shpacovitch,
V., Brzoska, T., Lippert, U., Henz, B.M., Luger, T.A., Metze, D., Steinhoff, M., 2004.
Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers, mast
cells, and epithelial cells of appendage structures. Experimental Dermatology 13, 129–
139.
Stander, S., Schmelz, M., Metze, D., Luger, T., Rukwied, R., 2005. Distribution of
cannabinoid receptor 1 (CB1) and 2 (CB2) on sensory nerve fibers and adnexal
structures in human skin. Journal of Dermatological Science 38, 177–188.
Stella, N., Piomelli, D., 2001. Receptor-dependent formation of endogenous
cannabinoids in cortical neurons. European Journal of Pharmacology 425, 189-196.
167
Su, M., Chi, E.Y., Bishop, M.J., Henderson, W.R.J., 1993. Lung mast cells increase in
number and degranulate during pulmonary artery occlusion/reperfusion injury in dogs.
The American Review of Respiratory Disease 147, 448-456.
Sugawara, K., Biró, T., Tsuruta, D., Tóth, B.I., Kromminga, A., Zákány, N., Zimmer, A.,
Funk, W., Gibbs, B.F., Zimmer, A., Paus, R., 2012. Endocannabinoids limit excessive
mast cell maturation and activation in human skin. The Journal of Allergy and Clinical
Immunology 129, 726-738.
Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Tonegawa, T., Nakane, S., Yamashita, A., Ishima,
Y., Waku, K., 1996. Transacylase-mediated and phosphodiesterase-mediated synthesis
of N-arachidonoylethanolamine, an endogenous cannabinoid-receptor ligand, in rat
brain microsomes. Comparison with synthesis from free arachidonic acid and
ethanolamine. European Journal of Biochemistry 240, 53-62.
Szabó, A., Boros, M., Kaszaki, J., Nagy, S., 1997. The role of mast cell in mucosal
permeability changes during ischemia-reperfusion injury in the mast cell intestine.
Shock 8, 284-291.
Temizel, E.M., Cihan, H., Akhtardanesh, B., Aytug, N., 2011. Effect of prednisolone and
cetirizine on D. farinae and histamine-induced wheal and flare response in healthy
dogs. Tierärztliche Praxis Kleintiere. Ausgabe K, Kleintiere/Heimtiere 39, 25-30.
Theoharides, T.C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitro, D., 2007.
Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation.
Immunological Reviews 217, 65-78.
Thomas, R.C., Logas, D., Radosta, L., Harrison, J. Effects of a 1% hydrocortisone
conditioner on haematological and biochemical parameters, adrenal function testing
and cutaneous reactivity to histamine in normal and pruritic dogs. Veterinary
Dermatology 10, 109-116.
Tizard, I.R., 2000. Helper T cells and their response to antigen. In: Veterinary
immunology (Ed.). Veterinary Immunology, an Introduction, 6th edition, WB Saunders,
Philadelphia, USA, pp. 98-109.
Tore, F., Tuncel, N., 2009. Mast cells: target and source of neuropeptides. Current
Pharmaceutical Design 15, 3433-3345.
Torres, R., Grifols, J., Fondevila, D., de Mora, F., 2003. Dermal exposure to Ag induces
sensitization and inflammation, in addition to the immediate response, in the Ascaris
suum-hypersensitive dog model of skin allergy. Allergy 58, 262 (Abstract from XXII
EAACI Congress, 2003, Paris, France).
Torres, R., Grifols, J., Marco, A., de Mora, F., 2006. Sensitization of naive beagles by
intradermal injection of an ascaris antigen: Induction of a model of skin allergy.
Immunopharmacology and Immunotoxicology 28, 697–702.
Touwn, M., 1981. The religious and medicinal uses of Cannabis in China, India and
Tibet. Journal of Psychoactive Drugs 13, 23-34.
168
Tsou, K., Brown, S., Sanudo-Pena, M.C., Mackie, K., Walker, J.M., 1998.
Immunohistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central
nervous system. Neuroscience 83, 393-411.
Uchi, H., Terao, H., Koga, T., Furue, M., 2000. Cytokines and chemokines in the
epidermis. Journal of dermatological Science 24, S29-S38
Ueda, N., Tsuboi, K., Uyama, T., 2010. N-acylethanolamine metabolism with special
reference to 4 N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Progress in Lipid
Research 49, 299-315.
Vandevoorde, S., Lambert, D.M., Smart, D., Jonsson, K.O., Fowler, C.J., 2003. NMorpholino- and n-diethyl-analogues of palmitoylethanolamide increase the sensitivity
of transfected human vanilloid receptors to activation by anandamide without
affecting fatty acid amidohydrolase activity. Bioorganic and Medicinal Chemistry 11,
817–825.
von Pirquet, C., 1906. Allergie. Münchener Medizinische Wochenschrift 53, 1457-1458.
von Recklinghausen, F., 1863. Uber Eiter-und Bindegewebskorperchen. Virchows
Archiv 28, 157.
von Ruedorffer, U., Fisch, R., Peel, J., Roosje, P., Griot-Wenk, M., Welle, M., 2003. Flea
bite hypersensitivity: new aspects on the involvement of mast cells. Veterinary Journal
165, 149–156.
Walder, R.Y., Radhakrishnan, R., Loo, L., Rasmussen, L.A., Mohapatra, D.P., Wilson,
S.P., Sluka, K.A., 2012. TRPV1 is important for mechanical and heat sensitivity in
uninjured animals and development of heat hypersensitivity after muscle
inflammation. Pain 153, 1664-1672.
Wallis, R.S., 2008. Tumour necrosis factor antagonists: structure, function, and
tuberculosis risks. The Lancet Infectious Diseases 8, 601-611.
Walter, L., Franklin, A., Witting, A., Moller, T., Stella, N., 2002. Astrocytes in culture
produce anandamide and other acylethanolamides. The Journal of Biological Chemistry
277, 20869-20876.
Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M., 2006. Mast cells are required for
normal healing of skin wounds in mice. FASEB Journal 20, 2366-2368.
Westlake, T.M., Howlett, A.C., Bonner, T.I., Matsuda, L.A., Herkenham, M., 1994.
Cannabinoid receptor binding and messenger RNA expression in human brain: an in
vitro receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry study of
normal aged and Alzheimer's brains. Neuroscience 63, 637-652.
Williams, C.M., Galli, S.J., 2000. The diverse potential effector and immunoregulatory
roles of mast cells in allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology
105, 847-859.
169
Wise, L.E., Cannavacciulo, R., Cravatt, B.F., Marun, B.F., Lichtman, A.H., 2008.
Evaluation of fatty acid amides in the carrageenan-induced paw edema model.
Neuropharmacology 54, 181-188.
Woelkart, K., Salo-Ahen, O.M., Bauer, R., 2008. CB receptor ligands from plants.
Current Topics in Medicinal Chemistry 8, 173–186.
Wollenberg, A., Bieber, T., 2000. Atopic dermatitis: from the genes to skin lesions.
Allergy 55, 205-213.
Woolley, M.J., Lane, C.G., Ellis, R., Stevens, W.H., Woolley, K.L., O’Byrne, P.M., 1995.
Role of airway eosinophils in the development of allergen-induced airway
hyperresponsiveness in dogs. American Journal of Respiratory and Clinical Care
Medicine 152, 1508-1512.
Yamamoto, K., 2000. Electron microscopy of mast cells in the venous wall of canine
liver. The Journal of Veterinary Medical Science 62, 1183-1188.
170