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Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Heat works by denaturing enzymes and proteins A. Thermal Death Point (TDP) lowest temperature at which all microorganism in a liquid culture are killed in 10 minutes B. Thermal Death Time (TDT) minimum length of time in which all microorganisms in a liquid culture are killed at a given temperature 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Pasteurization Reduction in microbial count not sterilization (removes only unwanted organisms) Mycobacterium tuberculosis 63 °C for 30 minutes 72 °C for 15 seconds (HTST) Thermodurics: able to survive high temperatures 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica Table 1. Recommended use of heat to control microbial growth METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Treatment Temperature Effectiveness Incineration >500o Vaporizes organic material on nonflammable surfaces but may destroy many substances in the process Boiling 100o 30 minutes of boiling kills microbial pathogens and vegetative forms of bacteria but may not kill bacterial endospores Intermittent boiling 100o Three 30-minute intervals of boiling, followed by periods of cooling kills bacterial endospores Autoclave and pressure cooker (steam under pressure) 121o/15 minutes at 1 atm. pressure kills all forms of life including bacterial endospores. The substance being sterilized must be maintained at the effective T for the full time Dry heat (hot air oven) 160o/2 hours For materials that must remain dry and which are not destroyed at T between 121o and 170o Good for glassware, metal, not plastic or rubber items Dry heat (hot air oven) 170o/1 hour Same as above. Note: increasing T by 10 degrees shortens the sterilizing time by 50 percent Pasteurization (batch method) 63o/30 minutes kills most vegetative bacterial cells including pathogens such as streptococci, staphylococci and Mycobacterium tuberculosis Pasteurization (flash method) 72o/15 seconds Effect on bacterial cells similar to batch method; for milk, this method is more conducive to industry and has fewer undesirable effects on quality or taste Ultrapasteurization (direct method) 140 /2 seconds o Effect on most bacterial cells is lethal. For milk, this method creates a product with relatively long shelf life at refrigeration temperatures. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Classificazione dei microrganismi secondo livelli rischio biologico - Class of risk 1 (harmless): micro-organisms known as non pathogenic for the man, the animal, the plant and not-harmul for the environment or presenting a negligible risk for the man and the environment at the laboratory scale. This class includes, beside organisms whose harmlessness was proven, strains which can be allergens and opportunistic pathogens. Human pathogens - Class of risk 2 (low risk): micro-organisms that can cause human disease and might be a hazard for directly exposed persons; they are unlikely to spread to the community. There is usually effective prophylaxis or treatment available (e.g. Clostridium difficile, Salmonella sp.). - Class of risk 3 (medium to high risk): micro-organisms that can cause severe human disease and present a serious hazard for directly exposed persons. They may present a risk of spreading to the community. There is usually effective prophylaxis or treatment available (e.g. Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis). - Class of risk 4 (very high risk): micro-organisms that cause severe human disease and are a serious hazard for directly exposed persons. They may present a high risk of spreading to the community. There is usually no effective prophylaxis or treatment available (e.g. Marburg virus, Ebola virus). 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA HEPA = High Efficiency Particulate Air Biological Safety Cabinet (Class II) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Biological Safety Cabinet (Class III) Glove Box 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica Table 2. Common antiseptics and disinfectants METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Chemical Action Uses Ethanol (50-70%) Denatures proteins and solubilizes lipids Antiseptic used on skin Isopropanol (50-70%) Denatures proteins and solubilizes lipids Antiseptic used on skin Formaldehyde (8%) Reacts with NH2, SH and COOH groups Disinfectant, kills endospores Tincture of Iodine (2% I2 in 70% alcohol) Inactivates proteins Chlorine (Cl2) gas Forms hypochlorous acid (HClO), a strong oxidizing agent Disinfect drinking water; general disinfectant Silver nitrate (AgNO3) Precipitates proteins General antiseptic and used in the eyes of newborns Mercuric chloride Inactivates proteins by reacting with sulfide groups Disinfectant, although occasionally used as an antiseptic on skin Detergents (e.g. quaternary ammonium compounds) Disrupts cell membranes Skin antiseptics and disinfectants Phenolic compounds (e.g. carbolic acid, lysol, hexylresorcinol, hexachlorophene) Denature proteins and disrupt cell membranes Antiseptics at low concentrations; disinfectants at high concentrations Ethylene oxide gas Alkylating agent Disinfectant used to sterilize heatsensitive objects such as rubber and plastics Ozone Generates lethal oxygen radicals Antiseptic used on skin Disinfection of drinking water Purification of water, sewage 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Quaternary Ammonium Detergents 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA MICROSCOPIO OTTICO COMPOSTO (max 1500 ingrandimenti - risoluzione max 0.2 m) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA STEREOMICROSCOPIO (per ingrandimenti fino a 100x) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Aspergillus sp. Penicillium sp. Rhizopus stolonifer 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Rhizopus stolonifer 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Rhodotorula rubra 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA detta anche coltura su “becco di clarino” 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA MEZZI SELETTIVI Selective media inhibit the growth of certain microbes, providing general information regarding the bacteria that are able to grow on these specialized types of substrates. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA MEZZI DIFFERENZIALI Differential media enable different microorganisms to be identified and/or separated on the same substrate by their ability to utilize nutrients or by their form of growth. Mannitol Salt Agar (MSA) - (mannitol fermentation = yellow) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA MEZZI SELETTIVI e DIFFERENZIALI MacConkey's Agar Selective for gram-negative bacteria: growth of gram-positive bacteria (e.g.: Staphylococcus aureus in the image on the left) is inhibited by the crystal violet dye and bile salts in the media differential for lactose fermentation: neutral red pH indicator turns red in the presence of acid by-products of lactose fermentation gram-negative Enterobacteria Escherichia coli and Enterobacter aerogenes ferment lactose E. coli produces pink to red colonies often with a reddish bile precipitate surrounding colonies on MacConkey's agar E. aerogenes produces pink to red mucoid colonies on MacConkey's agar gramnegative bacteria Proteus vulgaris and Salmonella typhimurium grow on MacConkey's agar, but do not ferment lactose (media appears yellow to light pink in color & colonies are colorless; swarming of Proteus is inhibited) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Esempio di mezzo colturale definito (defined medium) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Esempio di mezzo colturale sintetico per la crescita di un microorganismo particolarmente esigente (fastidioso) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Esempio di mezzo colturale complesso (rich medium) 2014 Giovanni Vallini