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DSB
Double-Strand Breaks
causate da
radiazioni
stress ossidativo
farmaci
DSB
e CROMATINA
• Higher-order chromatin packaging is a
barrier to the detection and repair of
DNA damage
• DSBs induce a local decrease in the density
of the chromatin fibre, in addition to
altering the position of nucleosomes
• DSBs also elicit post-translational
modifications on the protruding histone tails
Chromating remodelling and DSBs
RSC remodels the DSB chromatin
The PIKKs Mec1 and Tel1 phosphorylate
H2A(X), and RSC
accumulates in the regions flanking the DSB
SWI/SNF is recruited and remodels the
donor template chromatin
RSC
complex RSC (remodels the structure of chromatin)
ATP-dependent chromatin-remodelling
RSC can mediate nucleosome sliding, alter histoneDNA contacts
and remove histones from DNA.
The chromatin-remodelling activity of RSC is important for
transcriptional regulation of genes that are involved in stress
responses and cell-cycle progression
Chromating remodelling and DSBs
Phosphorylated H2A recruits cohesin, which helps to bridge
interactions between sister chromatids
The HDAC complex Sin3–Rpd3 removes acetylation from H4.
The protein kinase CK2 is also recruited and this phosphorylates H4
The INO80 complex enters the region of the DSB and removes some nucleosomes.
MODIFICAZIONE ISTONI
• Eukaryotes have several histone variants, which, as a
result of their altered amino-acid composition, can
affect both the structure of individual nucleosomes and
the ability of nucleosomes to form higher order
chromatin structure
• The earliest and most robust modification induced by
DSB is phosphorylation of the histone H2A variant
H2AX on its extended C-terminal tail.
• Within seconds, phosphorylated H2AX (known as γH2AX) spreads over a region spanning thousands to
millions of bases surrounding a DSB
H2AX extended Ctail
PIKKs =
phosphatidylinositol-3OH-kinase
-like kinases
DNA-damage sensor proteins
Ku70–Ku80, MRN, RPA
TOPBP1
DDR signal spreading
DDR proteins initially accumulate at DSB sites and then
spread at distance via a positive feedback loop involving
MDC1, which binds gH2AX, the MRN complex, and ATM
kinase, which phosphorylates additional H2AX molecules
further away from the break site.
Temporal regulation of DDR protein accumulation at DNA breaks
Proteine piattaforma
Mre, Rad50
SSB
Nbs1, a subunit of a complex that recognizes DNA DSBs
HRR
kinase signaling
ATM
P
The MDC1 TQXF motifs are ATM targets
required for 53BP1 IRIF. (A) Domain architecture
of MDC1, with ATM consensus sites (dots).
Specialized binding modules for recognition of post-translational
modifications (PTMs) at DNA breaks
.
Domain architecture of RNF8
Ubiquitin ligase activity
Forkhead associated(FHA) domain
bind phosphothreonine-bearing epitopes
interaction with ATM-phosphorylated MDC1.
• FHA-(R42A) and
•
Forkhead domain
RING finger (C406s) mutants.
Orchestration of the DNA-Damage Response
by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)
• Cells respond to DSBs by recruiting the DNAdamage mediator protein MDC1, the p53-binding
protein 1 (53BP1), and the breast cancer
susceptibility protein BRCA1 to sites of damaged
DNA.
Orchestration of the DNA-Damage Response
by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)
• Cells respond to DSBs by recruiting the DNAdamage mediator protein MDC1, the p53-binding
protein 1 (53BP1) to sites of damaged DNA.
• 53BP1 is an established player- important role in
modulating chromatin structure surrounding the
break site- in the cellular response to DNA
damage and is a canonical component of ionizingradiation induced foci (IRIF)
Ranking by z score of 500 siRNAs giving the least
53BP1 foci from a siRNA screen
Orchestration of the DNA-Damage Response
by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)
• Cells respond to DSBs by recruiting the DNAdamage mediator protein MDC1, the p53-binding
protein 1 (53BP1), and the breast cancer
susceptibility protein BRCA1 to sites of damaged
DNA.
Irradiated (10 Gy) HeLa cells transfected with the indicated
siRNAs were stained with antibodies to gH2AX, BRCA1
Orchestration of the DNA-Damage Response
by the RNF8 Ubiquitin Ligase (Nadine Science Feb2008)
• Cells respond to DSBs by recruiting the DNA-damage mediator
protein MDC1, the p53-binding protein 1 (53BP1), and the breast
cancer susceptibility protein BRCA1 to sites of damaged DNA.
• The ubiquitin ligase RNF8 mediates ubiquitin conjugation and
53BP1 and BRCA1 focal accumulation at sites of DNA lesions.
MDC1 recruits RNF8 through phosphodependent interactions between
the RNF8 forkhead-associated domain and motifs in MDC1 that are
phosphorylated by the DNA-damage activated protein kinase ataxia
telangiectasia mutated (ATM).
Depletion of the E2 enzyme UBC13 impairs 53BP1 recruitment to sites
of damage, which suggests that it cooperates with RNF8.
RNF8 promotes the G2/M DNA damage checkpoint and resistance to
ionizing radiation.
the DNA-damage response is orchestrated by ATM-dependent
phosphorylation of MDC1 and RNF8-mediated ubiquitination.
Mutazioni in BRCA 1 o 2  inattivazione meccanismo HRR
 predisposizione allo sviluppo di Carcinoma mammario
ereditario, con insorgenza precoce tumore seno e ovaie
BRCA 1: 50% mutazioni
tumore
mammario
famigliare
BRCA 2: 35% mutazioni
tumore
mammario
famigliare
Eredità di un allele mutante  predisposizione al tumore,
che insorge solo quando la seconda copia del gene è
persa o mutata (perdita di eterozigosità)
BRCA 1
• impairment of homologous repair in Brca1deficient mouse embryonic stem cells
• increase in the frequency of NHEJ in Brca1deficient cells
Riparazione per ricombinazione
omologa (HRR)
Ripara le DSBs (Double-Strand Breaks) causate
da radiazioni, stress ossidativo, farmaci
Replicazione e trascrizione vengono bloccate nel
sito della DSB e le estremità esposte sono
soggette a degradazione con perdita di materiale
genetico  importanza HRR
HRR utilizza come stampo il cromatidio fratello 
protezione dagli errori
HRR avviene in tarda fase S o in G2, quando i
cromatidi fratelli sono vicini
RPA
(ss DNA replication binding protein)
la polimerizzazione di RAD51 sul 3’
libero è BRCA1/2-dipendente
RAD51 (aiutata dall’elicasi RAD54)
cerca la sequenza omologa sul
cromatidio fratello e invade la
doppia elica; le regioni 3’ a singola
elica si appaiano con quelle
complementari
Sensor
MRN
La DNA polimerasi allunga
l’estremità 3’ libera (in cui si
trova
la
nucleoproteina
RAD51) utilizzando come
stampo il cromatidio omologo
non danneggiato
L’altra regione 3’ a singola
elica attorno alla zona
danneggiata
si
appaia
all’elica ormai corretta e gli
eventuali gap sono riempiti
da polimerasi e ligasi
BRCA1/BRCA2
PALB2 and BRCA1 are co-mediators that
directly and indirectly, respectively, interact
with BRCA2 and assist in localizing it, with
RAD51 bound, to the sites of DNA damage
Human BRCA2 is a mediator that interacts directly with approximately
eight RAD51 molecules and transports them to the site of ss-DNA
bound by RPA
Determination of regions required for the
BRCA1-PALB2 interaction.
(A) Graphical projection of
association between PALB2 (residues 9 – 42) and BRCA1 (residues 1393–1424) coiledcoil domains.
Positions of the heptad repeat (positions a to g) were predicted by the Coil program
Boxed residues were experimentally demonstrated to be responsible for the heterooligomeric interaction between PALB2 and BRCA1.
BRCA 1
• The BRCA1 tumor suppressor exists as a heterodimeric
complex with BARD1, and this complex is thought to mediate
many of the functions ascribed to BRCA1, including its role in
tumor suppression.
• The two proteins share a common structural organization : an
N-terminal RING domain and two C-terminal BRCT motifs
•
• the BRCA1/BARD1 heterodimer enhances chromosome
stability by promoting homology-directed repair (HDR) of
double strand DNA breaks.
BRCA 1
- Gene oncosoppressore, localizzato sul cromosoma 17
- Espressione nel nucleo di molti tipi cellulari
N-ter:
dominio
RING
FINGER,
coordina il
legame con
2 ioni zinco
 contatta
DNA
C-ter:
dominio
BRCT

induce
/
reprime
geni;
interazione
con
RNA
pol II
BRCA 1
Ubc13 and Rnf8are recruited to sites of DNA damage through DNA-damage-induced phosphorylation of a
chromatin-associated protein
BRCA 1
• An E3 ubiquitin ligase mediates the transfer
of activated ubiquitin from an E2 ubiquitinconjugating enzyme to its substrate lysine
residues.
• BRCA1 has the ability to direct the
synthesis of specific polyubiquitin chain
linkages, depending on the E2 bound to its
RING.
•Lega p53 attivando p21
•Attiva TNFa
Regolazione delle
proliferazione cellulare
•Lega Rad50/51 e BRCA2
Riparazione HRR
•Inibisce la trasduzione del segnale
da
parte
del
recettore
per
l’estrogeno
Reprime la proliferazione
dell’epitelio mammario che è
estrogeno-dipendente
Mutazioni in BRCA1 possono
determinare
un’incontrollata
proliferazione, in particolare
delle cellule che rispondono
all’estrogeno  tumore
BRCA1 regulates human mammary stem/progenitor cell fate
PNAS
February 5, 2008
BRCA1 is implicated in multiple cellular functions
Red, ubiquitylation; Blue, transcription; Green, cell cyclecheckpoint
control; Light blue, DNA repair; Gray, chromatin modifications.
Riparazione per ricombinazione
non omologa (NHEJ)
E’ il meccanismo prevalente per la riparazione
delle DSBs, soprattutto negli organismi con
elevato numero di sequenze ripetute identiche
(l’HRR rischierebbe di appaiare sequenze ripetute
di cromosomi diversi)
Può causare l’introduzione di errori nel codice
genetico (perdita o aggiunta di nucleotidi)
La via nota è quella Ku-dipendente, ma il NHEJ
può avvenire, con meno efficienza, anche in
estratti cellulari privi di Ku e DNA-PK esistenza
di vie Ku-indipendenti non note
• Mammals have evolved at least two genetically discrete
ways to mediate DNA DSB repair: homologous
recombination (HR) and non-homologous end joining
(NHEJ).
• In mammalian cells, most DSBs are preferentially repaired
by NHEJ.
• NHEJ consists of at least two sub-pathways—
• the main Ku heterodimer-dependent or “classic” NHEJ (CNHEJ) pathway and
• an “alternative” NHEJ (A-NHEJ) pathway, which usually
generates microhomology-mediated signatures at repair
junctions.
L’eterodimero Ku 70/80
lega le DSBs, in tal modo
proteggendo le estremità
libere dalla degradazione
finchè la giunzione non è
completa
Ku recluta DNA-PK DNA-PK
ha siti di legame sia per le
DSBs sia per il DNA a doppia
elica adiacente ad esse e
promuove l’allineamento delle
regioni
che
hanno
microomologie
Autophosphorylation of the DNAPKcatalytic subunit (DNA-PKcs)
after recruitment of DNA-PKcs to
cornerstone of the NHEJ pathway
Ku translocates inwards
DNA-PKcs interacts with the nuclease Artemis
synaptic complex
Dati sperimentali: Davydov et al, 2003
Analisi su omogenati estratti dal cervello di 39 pazienti
affetti da Alzheimer (AD) e 7 soggetti sani di pari età (C)
EMSA: electrophoretic mobility
shift assay
Utilizza una sonda radioattiva
contenente la sequenza di legame
per la proteina di interesse (in
questo caso Ku) e incubata con
estratti nucleari
Principio: in un gel di PAA i
complessi DNA-Proteine migrano
più lentamente rispetto a DNA libero
Capacità di legame di Ku al DNA
Supershift: per confermare che la proteina che si è
legata è Ku-80, si aggiunge nell’EMSA un anticorpo
specifico. L’anticorpo andrà a legare la proteina Ku e se
questa è legata al DNA marcato, il legame dell’anticorpo
causerà un ulteriore ritardo nella corsa eleettrofeoretica
Controllo
sano
Paziente
Alzheimer
Sonda – Ku - anticorpo
Sonda - Ku
Sonda libera
Alterazione di una delle proteine
coinvolte nel meccanismo di NHEJ
può determinare invecchiamento
precoce
Dati sperimentali: Vogel et al., 1999
Topi privi di entrambe le copie del gene per Ku-86 (Ku 86-/-)
Vita media Ku 86 -/-: 3814 wks
Vita media controlli: 9717 wks
Età massima raggiunta da un
topo Ku 86 -/-: 87 wks
Età massima raggiunta da un
topo di controllo: 127 wks
Topi Ku 86-/-: insorgenza precoce di tumori, atrofia della
pelle e dei follicoli, chiusura delle epifisi, curvatura della
spina dorsale, assottigliamento della pelle
Topi DNA-PK-/-: non vanno incontro ad invecchiamento
precoce, forse perché l’attività fosforilante di DNA-PK può
essere svolta da altre chinasi presenti nella cellula
Alterazioni nel NHEJ possono determinare
invecchiamento precoce anche nell’uomo:
•Sindrome di Werner: vita media di 50 anni, alopecia,
osteoporosi, arteriosclerosi, cataratte, atrofia della pelle,…
E’ causata da mutazioni nella proteina WRN, una DNA
elicasi/nucleasi. WRN ha un ruolo sia nel HRR sia nel
NHEJ (interagisce con Ku)
IPOTESI: nei soggetti sani, quando la ricombinazione
omologa non è possibile, WRN lega Ku e facilita la
riparazione della DSB mediante NHEJ
Nei pazienti affetti, invece, la ricombinazione omologa
diventa meno efficiente e anche l’alternativa offerta dal
NHEJ non è più favorita dal legame tra WRN e Ku