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La replicazione del DNA
Replicazione “in vivo”
Meccanismo biochimico
Enzimi
Origini di replicazione
Replicazione “in vitro”
Meccanismo biochimico (idem)
Enzimi
Primer
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Colcofluor stained yeast cells
A
T
C
G
C
T
G
C
A
C
A
TA
AT
TA
CG
GC
CG
T
A
G
C
G
A
C
G
T
G
T
T A
AT
T A
C G
G C
C G
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Replication: “in vivo” e “in vitro”: identical biochemical mechanism
Synthesis requires a «primer», i.e. a piece of DNA in double strand form
Annealed primer
Growing 3’ end of DNA
Template strand
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DNA Polymerase enzyme is extremely accurate
DNA Polymerase - movie
Precisione di base: 1*10E-04
Attività di “proof-reading”  1*10^-07
Direzione di sintesi: unicamente 5’3’
I due filamenti sono antiparalleli
Vengono replicati contemporaneamente
Come è possibile ?
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Primase
direction of leading strand
syntesis by DNA polymerase
replication
RNA primer
Okazaki fragments
DNA Polymerase
direction of lagging strand syntesis by
DNA polymerase
The enzyme Primase synthesizes short RNA primers (green)
at a fixed distance, following the sliding of the leading strand
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free 3’-end here
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Svolgimento: DNA elicasi
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Filmato movie
Origini e terminazioni
Origine di replicazione (o replicatore)
Proteina che riconosce l’origine
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Two replication forks take off from origin
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Bacteria (e.g. E. coli) often
possess circular DNA (circular
chromosome). The same is true
for organelle DNA of eukaryotic
cells (e.g. mitochondria). When
replication is complete, the two
daughter molecules need to be
separated. The enzyme doing
this is called Topoisomerase II.
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E.coli ha un unico cromosoma circolare di circa 6x106 bp
Eukaryotes have linear
chromosomes that are replicated
using multiple replication origins.
Some of these origins can be
either active or replicated
passively.
Il problema dei telomeri (estremità
dei cromosomi)
Telomerasi (solo cellule linea
germinale, embrionali staminali e
tumorali)
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La Telomerasi è un enzima fatto di
proteina +RNA
Parte dell’RNA serve da stampo per la
sintesi di ripetizioni telomeriche, con
spostamento successivo della
Telomerasi stessa di volta in volta
verso il 3’
Per gli appassionati di origini della vita
ed “RNA world”, questo potrebbe
essere un fossile molecolare di una
“RNA Replicasi” primordiale
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da
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Replicazione “in vitro”:
Meccanismo biochimico
Desossiribonucleotidi trifosfato
primer
DNA Polimerasi
simpler is better
Stampo (template)
Vertebrate DNA: 3-4 x 109 bp
If we to isolate a fragment 3-4 Kbp in length: 1 / 1 million
I.e. if we take 1g DNA  1pg of our desired fragment
The sole property that could identify my fragment is: its sequence
L’essenza di tutte le tecnologie del DNA ricombinante è di poter disporre
di una grande quantità di copie (infinite) del frammento di DNA che
si vuole studiare ed utilizzare
Una notevole semplificazione del cloning si ha quando si conosce già a priori tutta o
parte della sequenza del gene o del cDNA che si desidera clonare.
In questo caso si può applicare la tecnica chiamata PCR (“Polymerase Chain Reaction”)
che consente di produrre un numero teoricamente infinito di copie della stessa
sequenza di DNA (“bersaglio”) in provetta
La reazione a catena della Polimerasi (PCR)
Si basa sulla esecuzione ciclica ripetuta più volte delle fasi di:
- denaturazione
- annealing (o ibridazione) di un oligonucleotide specifico (primer)
- estensione (cioè la sintesi del DNA complementare allo stampo)
utilizzando 2 primers complementari alla sequenza estreme ( a
sinistra e a destra) del pezzo di DNA che si desidera amplificare.
Poiché la denaturazione richiede alte temperature, la tecnica
richiede un enzima termoresistente: La Taq DNA Polimerasi
(dell’organismo termofilo T. acquaticus)
5’..aggtcatccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcatgca…5’
5’-catccgtta-3’
3’-ggctagcat-5’
5’..aggtcatccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’-ggctagcat-5’
5’-catccgtta-3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcatgca…5’
5’..aggtcatccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’-ggctagcat-5’
5’-catccgtta-3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcatgca…5’
5’..aggtcatccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcat-5’
5’-catccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcatgca…5’
5’-catccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’-ggctagcat-5’
5’-catccgtta-3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcatgca…5’
5’..aggtcatccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’-ggctagcat-5’
5’-catccgtta-3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcat-5’
5’-catccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’-gtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcat-5’
5’-catccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcatgca…5’
5’..aggtcatccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgtacgt…3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcat-5’
5’-catccgttatctagacataatagatctagatcgtccgatcgta-3’
3’..tccagtaggcaatagatctgtattatctagatctagcaggctagcat-5’
Il funzionamento della PCR
Specie molecolari PCR movie 2
PCR movie 1
DNA ottenuto mediante
amplificazione con PCR
-
Elettroforesi su gel
di agaroso
+
frammenti di DNA
di lunghezza nota
Start with DNA from 100.000 mouse cells in culture
Extract DNA: you obtain 200.000 copies of your target, together
with 200.000 of any other piece of DNA.
Assuming your target: 1.000 bp and the mouse genome 3x109 bp,
you have a relative abundance o 1:3x10E6, i.e. 1 copy in 3 millions
unrelated sequences.
Make a PCR of your fragment, 30 cycles.
You obtain theoretically  200.000 x 230  2 x 1014 molecules of
your target, and you still have the original 200.000 molecules of any
other sequence.
The relative abundance is now 2x1014 :2x105 = 109
You obtain a one billion prevalence of your sequence over any other
unrelated sequence.
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L2.2
Transcription & translation
The genome
copier
coding strand
5’-……AATCTGTTAATCATGAAGGTACCTTAG……-3’
3’-……TTAGACAATTAGTACTTCCATGGAATC……-5’
DNA
template strand
5’-……AAUCUGUUAAUCAUGAAGGUACCUUGG……-3’
NH2-..N
L
L
I
M
K
V
P
W
-COOH
DNA is double-stranded, but since one filament is
coding, we can represent it as a single sequence
RNA
protein
RNA polymerases from: a) Thermus aquaticus b) Saccaromyces cerevisiae
Different colors refer to different subunits, colors are kept the same for subunits
showing homology in the two proteins.
RNA synthesis
(biochemistry)
DNA
template



Trascrizione
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RNA Polimerasi
Movie is available
(Moodle)
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transcription
Promoter
PROMOTORE
Trascrizione
TSS
5’UTR)
Coding sequence………
5’---TGCATTCAGGCTGTAGCTTCTTGGCTGGTCCATCGTTCATGCATGACTGGGTCATGCATGCT
3’---ACGTAAGTCCGACATCGAAGAACCGACCAGGTAGCAAGTACGTACTGACCCAGTACGTACGA
DNA
RNA (primary transcript)
5’-AGCUUCUUGGCUGGUCCAUCGUUCAUGCAUGACUGGGUCAUGCAUGC
Regione non tradotta
5’-UTR
(5’ untranslated region)
(detta anche leader)
(Può essere centinaia di bp)
1° codone:
N-terminale del peptide
concetto di “sequenza consenso”
transcription start site
TSS
Upstream Promoter element
allineamento di
diversi geni
«Promotori»
i promotori nei procarioti (E. coli)
Sigma subunit (σ) allows RNA Polymerase of bacteria to recognize promoter sequence
Termination of transcription is determined by special sequences that
form a «stem-loop» structure
Terminators are usually
followed by a «U» stretch
that allows easy
dissociation of RNA from
the template
Termination
is a special case of pause
self-complementary sequences
that can form a hairpin
followed by a strecht of UUUUU
Promotori
Eucarioti
1)
1)
promotori degli
Promotori di tipo «TATA-plus» a unico TSS (transcription start site)
Promotori di tipo «GC-rich» con TSS mutipli
Regione ricca di «CG»
Sequenza propria
movie TBP TBP
Al contrario dei Procarioti, dove di solito i geni presentano una
sequenza codificante continua,
negli Eucarioti (e sempre in aumento con la scala evolutiva) i geni
contengono sequenze codificanti discontinui
Ovvero
Le sequenze codificanti sono intervallate da sezioni non codificanti
che si chiamano «introni»
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3’utr
heterochromatin
Khm
reprogramming
euchromatin
Nc gene
transcription
C gene
Ktc
pre-ncRNA
Kpr
processing &
transport
Ktc
pre-mRNA
Kpr
Localization,
translation
mRNA
ncRNA
KdR
KdR
degraded
degraded
folding &
modifications
Ktl
peptide
Kpd
degraded
Kpt
protein
Ka
Gene
Trascritto primario
5’-capping
Splicing / Alternative splicing
polyadenylation
Other processing
RNA maturo
degradazione
measure
Transport
Localization
Protein-guided degradation (exosome)
RNA-guided degradation
guanine-N7methyltransferase
Elongation
factor
EJC deposited 20-24 nt upstream the
exon-exon junction
Splicing factors and snRNPs are replaced by
the EJC (exon junction complex) proteins
From Aguilera 2005, Curr Op Cell Biol, 17:242.
Proteins necessary for mRNP
transport through the nuclear
pores are also charged to RNA
during transcription
Fig. 1 Schematic view of the nuclear side of eukaryotic gene expression, from
transcription to nuclear export. NPC Nuclear pore complex, CTD C-terminal domain of
Rpb1, RNAPII RNA polymerase II.
Esistono due forme di splicing un po’ diverse: la prima si riferisce ad un sottotipo di introni detti ATAC dai dinucleotidi di confine, molto poco frequenti, che hanno snRNP dedicate.
La seconda è detta “trans-splicing” ed è un fenomeno (raro?) in cui un esone presente in un pre-mRNA
viene ligato ad un altro esone presente in un secondo pre-mRNA
Costitutivo:
snRNP (U1,U2)
Siti di splicing
«conservati»
Alternativo:
elementi cis
(ESE, ESS,
ISE, ISS)
riconosciuti da
SR, hnRNP,
Attivatori,
Basics of the mechanisms of alternative splicing. (a) The architecture of a pre-mRNA and theRepressori
important cisacting sequence elements that direct the splicing reaction. The consensus sequences for the 50 splice site,
branchpoint and 3’ splice site for human introns is shown. (b) Schematic diagram of the sequences and
proteins involved in regulating alternative splicing. Four types of regulatory sequences are known: intronic
splicing enhancers (ISEs), intronic splicing silencers (ISSs), exonic splicing enhancers (ESEs) and exonic
splicing silencers (ESSs). The enhancer elements are recognized by activator proteins. Within exons, these
activators are most commonly members of the SR protein family. The silencer elements are bound by
repressor proteins. Within exons, these repressors tend to be members of the hnRNP protein family.
Regardless of their binding location, activators tend to enhance the binding of spliceosomal components to the
regulated splice site while repressors tend to inhibit binding or function of the spliceosomal components.
Eucarioti:
Durante la trascrizione (sintesi di RNA) l’RNA trascritto primario viene modificato da
enzimi che viaggiano insieme alla RNA Polimerasi II
5’-capping
Exon splicing
3’ polyadenylation
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Modificazione 5’ con funzioni
principali di protezione =
«capping»
Comune a tutti gli eucarioti
Terminazione negli eucarioti
Non esiste una vera e propria
terminazione.
Il trascritto viene tagliato in corrispondenza
di una sequenza specifica
La trascrizione continua, ma dato che
l’RNA tagliato non ha «cap» viene
degradato e fermato
Modificazione al 3’
Poli-adenilazione
(in media circa 200 “A”)
“Quasi” tutti gli RNA messaggeri (ovvero
codificanti proteine) ma anche alcuni altri
tipi di RNA
Vi sono alcuni RNA messaggeri che non
hanno poliadenilazione, per es. quelli che
codificano gli “istoni” (componenti dei
nucleosomi, vedi più avanti).
La traduzione
ORF (open reading frame)
leader
Coding sequence
5’-UTR
Tail
3’-UTR
Cds / ORF
Sempre multiplo di 3
The Genetic Code
tRNA
Aminoacyl-tRNA
Synthetase
ribosomi
poliribosoma
Solo procarioti
Il primo aminoacido è sempre metionina
procarioti
corretto
scorretto
Terminazione con
Releasing Factors
Quando nel sito A c’e
uno dei te codoni di
STOP, non c’è alcun
tRNA appaiabile.
Nel sito A entra allora
una proteina chiamata
Releasing Factor
…che appaia al
codone di stop
una sorta di
anticodone
peptidico (glicinaglicina-glutamina
in questo
modello).
Solo Procarioti: co-traduzione
Eucarioti
trasporto
nucleocitoplasma
Proteine di testa e di
coda ciclizzano il
complesso
The Genetic Code
Regolazione trascrizionale
genome
transcriptome
Noncoding RNA
rRNA
tRNA
snRNA
snoRNA
Etc.
mRNA
Small RNA
proteins
Long noncoding
Is the transcriptome «regulated» ?
Quantitatively ?
Qualitatively ?
YES !
Saccaromyces
cerevisiae
nitrogen-deficient medium
induces sporulation
Samples:
Cells collected at
0 hours
0.5 hours
2 hours
5 hours
7 hours
9 hours
11 hours
after induction
Reference sample is 0 hour sample.
From Chu, 2008
Procarioti
mRNA policistronico
L’operone
5’
3’
Gene 2
Gene 1
Gene n
Coda 3’
Promotore
operatore
leader
Inizio di trascrizione
ATG 1st codon
Stop codon
terminatore
Un cambiamento
allosterico.
Il repressore di Lac lega
l’induttore: l’effetto
allosterico è
l’allontanamento dei
domini che permettono
l’interazione con il DNA
Procarioti
I repressori agiscono sempre impedendo l’ingresso della RNA Polimerasi
RNA Pol
R
Procarioti
Example: The E. coli lactose operon
Eucarioti
2 problemi
Nucleo (necessità di trasduzione)
Il DNA non è nudo ma è organizzato in struttura complessa  cromatina
Necessità di regolare l’accessibilità del DNA alla RNA Polimerasi ed ai fattori
regolatori
 Eukaryotes
The default status for all the genes is
the REPRESSED status. This is
because all the DNA is
chromatinized, i.e. it is tightly
wrapped around nucleosomes. In
this condition, the DNA is not
accessible to Transcription Factors
and to RNA Polymerase.
Eterocromatina in bianco
Histone H4
HCH3
C=O
CH3
Acetyl-Lys
HCH3
Methyl-Arg
Un-acetylated histone tails
have positive charges
Acetylated histone tails
have no positive charge
La modificazione più dinamica, legata all’attivazione della trascrizione, è
l’acetilazione degli istoni nucleosomali nell’intorno del promotore del gene
RNA molecules being synthesized
RNA Polymerase
Heterochromatic,
silenced region:
very compacted
chromatin
nucleosomes
Secondo problema:
Gli eucarioti (e man mano sempre di più salendo la scala
evolutiva ed organizzativa) devono integrare numerosi
segnali cellulari nel controllo dei geni.
prokaryotes
+
up
O
P
transcribed unit
eukaryotes
Cn
C4
C3
C2
C1
P
transcribed unit
Molti elementi cis- di regolazione
ciascuno dei quali lega una specifica proteina regolatrice
(fattori di trascrizione regolatori)
In prokaryotes, there are a limited number of repressors (and activators) that
regulate one or few related operons.
In Eukaryotes, there are hundreds to thousands transcription
factors (activators and repressors) that regulate thousands of
genes by a combinatorial mechanisms
1
2
1 3 4
3
4
5
2 1 4
Gene A
Gene C
5 3
2 4 5
Gene B
Gene D
Most of eukaryotic genes contains regulatory elements not only in the proximal
region, but also in distal position (up to tens of Kbp away, upstream or downstream,
as well as in introns. These regulatory “units” are called “enhancers”.
Eukaryotes
Upstream enhancer
Distal elements
Downstream enhancer
Proximal elements
P
Transcribed sequence
Each cis element has the potential to bind a specific transcription factor
PIC
P
Transcribed sequence
Each bound protein contributes its own regulatory activity to the gene.
The result in terms of gene regulation is the sum of all specific contributions by
the bound transcription factors.