Download Indução de mutações por ENU em camundongos e - ICB

Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG
Instituto de Ciências Biológicas – ICB
Departamento de Biologia Geral
Indução de mutações por
ENU
em camundongos
e
Mapeamento genético
da mutação careca
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação
em
Genética
do
Departamento de Biologia Geral da
Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito parcial à obtenção do
título de Mestre em Genética
Bruno Luiz Fonseca Schamber Reis
Orientação: Profª. Drª. Ana Lúcia Brunialti Godard
Fevereiro de 2006
Sumário
1. Resumo
2
2. Apresentação
3
3. Artigo 1 – Projeto ENU
6
4. Artigo 2 – Mapeamento genético da mutação careca
25
5. Conclusões e Perspectivas
60
6. Agradecimentos
63
7. Referências
64
8. Anexo I
69
1
1. Resumo
O camundongo vem sendo explorado de forma intensa como importante
ferramenta experimental no estudo das causas genéticas e do metabolismo anormal
envolvido em doenças. Isolar animais que apresentem fenótipos mutantes de interesse
vem sendo o objetivo de vários grupos de pesquisa na tentativa de se obter bons
modelos murinos para patologias humanas. Um projeto de colaboração entre o
Laboratório de Genética Animal e Humana do ICB/UFMG e o Biotério de
Experimentação do Depto. de Imunologia do ICB/USP buscou induzir mutações em
camundongos com a utilização de ENU (etil-nitroso-uréia), que gera mutações pontuais.
O protocolo de administração do mutágeno e os cruzamentos controlados permitiram
isolar dez mutações autossômicas recessivas e uma autossômica dominante.
Dentre os 11 mutantes recuperados no projeto ENU, a mutação recessiva careca
(carc) foi uma das escolhidas para ser mapeada no genoma do camundongo. O mutante
carc, isolado na linhagem BALB/c, apresenta pelagem defeituosa, rarefeita, além de
problemas na pele, rins e linfonodos. O mapeamento genético à alta resolução desta
mutação se deu pelo estabelecimento de dois retrocruzamentos, sendo o primeiro
carc/C57BL/6 x carc/carc e o segundo carc/NZB x carc/carc. Um haplótipo construído
com os dados provenientes da genotipagem dos 783 animais gerados dos dois
retrocruzamentos com 15 marcadores microssatélites polimórficos, pôde posicionar o
locus careca num intervalo genômico de 5,56 megabases compreendido entre os
marcadores D7Mit105 e D7Mit304. Dentre os genes conhecidos neste trecho, o gene
Fgfr2 (fibroblast growth factor receptor 2) foi considerado o candidato mais imediato,
já que participa ativamente da diferenciação epidérmica no embrião. Além disso,
animais knockouts para Fgfr2 mostram intensa correspondência fenotípica com o
mutante carc. Análises de DHPLC (cromatografia líquida desnaturante de alta
performance), realizadas com fragmentos amplificados por PCR a partir do cDNA deste
gene, indicaram possível presença de mutação em 9 dos 20 éxons de Fgfr2. O
seqüenciamento destes éxons e posterior alinhamento das seqüências provenientes de
animais careca e normais das linhagens isogênicas BALB/c, C57BL/6, NZB e A/J não
permitiu identificar nenhuma mutação nestes intervalos. A permanência do gene Fgfr2
como candidato é discutida e comentada.
2
2. Apresentação
O desenvolvimento de tecnologias inovadoras no âmbito das ciências biológicas
permitiu uma aceleração nos processos de aquisição de conhecimento. Nos últimos anos
as áreas moleculares da genética e da bioquímica alcançaram índices de
desenvolvimento nunca vistos na história. A existência de uma enorme quantidade de
periódicos científicos especializados e um respeitável número de artigos publicados
periodicamente celebra a importância e o impacto da pesquisa da vida sobre o cotidiano
do homem. Uma justificativa forte para este crescimento está na necessidade de se
conhecer como as proteínas, açúcares, lipídios e ácidos nucléicos, considerados blocos
básicos de construção, interagem entre si em suas vias metabólicas e regulam a
fisiologia própria dos tecidos que compõem os órgãos e sistemas de mamíferos
superiores. Adquirir este tipo de informação é crucial para se tentar resolver outra
questão importante: compreender as causas orgânicas e inorgânicas envolvidas no
estabelecimento das doenças moleculares no homem e nos animais, permitindo o
desenvolvimento de terapias que possam trazer a cura. Neste sentido, a genética buscou,
através de sua história, estabelecer modelos animais apropriados para este fim. Os
camundongos ocupam uma posição de destaque dentre os modelos animais disponíveis,
e estudos envolvendo linhagens murinas em laboratório vêm permitindo um intenso
progresso no entendimento de mecanismos envolvidos em doenças.
O camundongo é uma ferramenta experimental versátil para estudos de doenças
genéticas. É de fácil manipulação e se adapta bem a condições artificiais de criação em
laboratório. Várias linhagens isogênicas estão disponíveis e é permitida a realização de
cruzamentos controlados a partir de linhagens interespecíficas que normalmente geram
proles viáveis e férteis, tornando possível a análise de segregação de vários tipos de
polimorfismos (Guénet, 1998). Além disso, o homem e o camundongo compartilham o
período de divergência evolutiva mais recente, em comparação com outros modelos tais
como Drosophila, a mosca de frutas doméstica, e Xenopus (Guénet, 2003). Uma
comparação dos dados genômicos obtidos do seqüenciamento completo dos genomas
murino e humano (Waterston et al, 2002; Lander et al, 2001) levou ao achado de que
mais de 99% dos genes em camundongos têm homólogos no homem (Austin et al,
3
2004). Mais de 90% dos dois genomas podem ser alinhados em regiões de sintenia
conservada entre as duas espécies. A proximidade genômica entre o homem e o
camundongo é um fator marcante que incentiva a adoção dos modelos murinos como
meio experimental nos estudos de patologias humanas. Embora outros organismos
modelos possam ser utilizados com facilidade em processos de dissecção genética, o
camundongo continua sendo o modelo mais valorizado hoje em estudos genéticos
envolvendo aspectos comportamentais, desenvolvimento embrionário de mamíferos,
câncer e imunologia (Perkins, 2002).
A importância do camundongo na modelagem de doenças humanas se
materializa em inúmeros mutantes murinos espontâneos e induzidos que são
constantemente recuperados pelos geneticistas de camundongos. A coleção atual de
mutações cobre alterações em praticamente todas as classes fenotípicas. Um grande
número de mutantes apresenta fenótipos homólogos aos observados em doenças
humanas, que em grande parte dos casos se estendem a nível molecular (Guénet, 1998).
Muitas mutações em camundongos são consideradas modelos experimentais em
pesquisas sobre o avanço de quadros clínicos de doenças genéticas humanas, sendo que
muitos deles têm levado à descoberta de genes importantes envolvidos em tais
enfermidades (Brown & Peters, 1996). Análises moleculares realizadas em
camundongos considerados modelos para alcaptonúria, fenilcetonúria, síndrome de
Marfan, obesidade, síndrome de Down, dentre outros, propiciaram a aquisição de
informações moleculares únicas que serviram, em muitos casos, como peças-chave na
integração de conhecimentos biomédicos previamente obtidos a partir de outras fontes.
Assim sendo, é possível extrair dados biológicos relevantes sobre a evolução de doenças
adotando camundongos mutantes como instrumentos vivos em pesquisa básica.
Esta dissertação está organizada em três partes principais. A primeira apresenta
os resultados de um projeto de indução de mutações por ENU (etil-nitroso-uréia) que
permitiu isolar diversas mutações diferentes em camundongo. A segunda parte aborda o
mapeamento genético de uma mutação de pelagem específica isolada neste projeto,
denominada careca (carc), incluindo análise de gene candidato presente no intervalo
mapeado. Os resultados das duas abordagens estão apresentados sob o formato de
artigos científicos separados. Cada artigo está precedido de uma introdução própria que
procura contextualizar as abordagens experimentais e oferecer base informativa para um
4
melhor entendimento da importância científica trazida por estes trabalhos. A terceira
parte busca integrar os resultados numa conclusão geral que abrange aspectos principais
dos dois artigos, levantando perspectivas futuras. Todos os trabalhos citados na
apresentação, nas introduções que precedem cada um dos dois artigos e na conclusão
geral da dissertação são referenciados separadamente (item 7 do Sumário).
5
3. Artigo 1 – Projeto ENU
Modelos animais sempre foram utilizados como forma indireta de se estudar
fenômenos bioquímicos que ocorrem na espécie humana. Estudos em espécies como D.
melanogaster, S. cerevisiae e D. rerio revelaram importantes aspectos moleculares
envolvidos na genética e no desenvolvimento de invertebrados e vertebrados (Beier,
2000). Os mutantes isolados em camundongos (Mus musculus) vêm proporcionando
enormes avanços no entendimento de aspectos moleculares, fisiológicos e patológicos.
A geração de mutantes pode ocorrer em duas abordagens principais (Brown & Nolan,
1998). A primeira, denominada abordagem genotípica, é baseada primariamente no
conhecimento prévio da seqüência e se dá pela indução de mutações dirigidas por meio
do processo de recombinação homóloga em células germinativas embrionárias. Não é
uma técnica muito proveitosa na geração de mutações em larga escala, porém tem como
vantagem principal a rápida identificação do locus responsável pelo fenótipo, já que o
mesmo é previamente conhecido. A segunda, chamada de abordagem fenotípica, lança
mão de mutagênese aleatória induzida por agentes químicos ou físicos para isolar
animais com novos fenótipos. Neste caso é necessário identificar os genes e vias
metabólicas envolvidas no fenótipo anormal. O grande chamativo desta segunda
abordagem é que nenhuma informação anterior a respeito do genoma é necessária, e
isso se torna importante para trazer à tona o papel de muitos genes ainda sem função
descrita, tendo em vista que 1% dos 30.000 genes preditos no genoma do camundongo
ainda não possui contrapartes humanas identificadas (Waterston et al, 2002).
A expansão da coleção de camundongos mutantes se faz necessária para
identificar e descrever novos genes e para uma melhor compreensão da ação destes
genes no metabolismo geral, permitindo um maior domínio na compreensão da função
gênica em mamíferos (Wells & Brown, 2000). O domínio de técnicas moleculares que
induzem o aparecimento de mutações (ENU, animais knock-in e knockout e mutantes
condicionais), aliado à existência das mutações espontâneas, acelerou o andamento de
estudos sobre o fenótipo, isto é, como o impacto genotípico de diferentes mutações atua
na função normal de genes críticos. Mesmo com os inúmeros mutantes já isolados e
descritos, o termo "gap (buraco) fenotípico" é bem empregado para expor um estado de
carência de animais mutantes, o que leva ao sub-aproveitamento do camundongo como
6
organismo modelo. Para maximizar as potencialidades do camundongo como modelo,
ainda é necessário isolar mais mutantes para os loci já conhecidos e também gerar
mutações em loci ainda desconhecidos (Brown & Peters, 1996).
Apostando nesta estratégia, muitos laboratórios se interessam pela abordagem
fenotípica, isolando mutantes induzidos pela ação alquilante do mutágeno ENU (etilnitroso-uréia). Este agente mutagênico possui um radical etil transferível a oxigênios ou
nitrogênios presentes nas bases nitrogenadas do DNA (Noveroske et al, 2000). Os sítios
de alquilação estão presentes em todas as bases do DNA e foram identificados tanto in
vivo quanto in vitro. Estes sítios incluem os resíduos N1, N3 e N7 da adenina; O6, N3 e
N7 da guanina; O2, O4 e N3 da timina e O2 e N3 da citosina. A base transformada,
então, passa a mimetizar uma outra base durante a replicação da dupla-fita de DNA,
fazendo com que a mutação se fixe no genoma após dois ciclos de replicação celular, já
que o mecanismo impede a ação eficiente do sistema de reparo celular. O ENU gera
mutações de ponto (além de pequenas deleções e inserções) em todo o genoma.
Comparativamente às outras drogas mutagênicas, como, por exemplo, clorambucil,
ENU apresenta a maior taxa de mutação, da ordem de 1,5-6 x 10-3. De todas as
mutações induzidas por ENU e que foram seqüenciadas, foram detectadas mutações de
sentido trocado (64%), mutações sem sentido (10%) e erros de splicing (26%) (Justice
et al, 2000). Os animais tratados com ENU (geralmente machos, pois toleram bem o
tratamento e geram uma grande quantidade de espermatogônias mutantes) são cruzados
para observação dos mutantes na prole, que serão posteriormente caracterizados
fenotípica e geneticamente. Sendo o ENU um alquilante que age aleatoriamente no
genoma, conseqüentemente pode induzir mutações em qualquer ponto de determinado
gene, permitindo a avaliação de todo um espectro de alterações na seqüência (Beier,
2000).
O artigo a seguir apresenta os resultados obtidos num projeto de indução de
mutações por ENU para recuperação de fenótipos dominantes e recessivos. Este projeto
foi realizado em colaboração com a Dra. Silvia Maria Gomes Massironi, coordenadora
do Biotério de Experimentação do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências
Biomédicas–USP. Dentre as onze mutações isoladas percebe-se uma gama diversa de
fenótipos alterados, incluindo alterações hematológicas, comportamento, alterações na
7
pelagem e distúrbios neuromusculares. A dose e freqüência da administração de ENU e
os cruzamentos utilizados para recuperar os mutantes foram bem estabelecidos para
maximizar a capacidade mutagênica do composto sem causar efeitos colaterais nos
animais tratados, o que os impossibilitaria de passar a mutação dos gametas para a
geração seguinte. Os fenótipos de cada um dos mutantes isolados são discutidos no
artigo, sendo que muitas destas mutações já foram mapeadas, numa maior ou menor
resolução, no genoma murino. Este primeiro artigo já foi submetido e aceito para
publicação no Brazilian Journal of Medical and Biological Research.
Muitos projetos de pequena escala, semelhantes ao deste trabalho, buscaram
recuperar alelos mutantes específicos induzidos por ENU no genoma murino. Em um
deles, metade da ninhada obtida dos casais onde o macho foi tratado com ENU
apresentou mutações recessivas que segregavam de forma mendeliana (Kasarkis et al,
1998). Em outro, foi utilizado um sistema de sensibilização da prole com injeções de
fenilalanina para evidenciar mutantes em genes na via metabólica da fenilalanina
(Symula et al, 1997). Um terceiro projeto conseguiu com a administração de ENU obter
uma série alélica para o locus quaking (qk), essencial na mielinização axonal e
importante em processos embriogênicos iniciais (Cox et al, 1998). Ainda, outro projeto
teve como interesse principal isolar fenótipos oculares mutantes e anormalidades na
visão causadas por mutações induzidas por ENU, sendo que 25 linhagens murinas
mutantes puderam ser isoladas (Thaung et al, 2002). Dentre estas mutações, algumas
foram mapeadas em regiões do genoma que não possuem genes candidatos, indicando a
presença de novos genes. Projetos em larga escala também foram realizados por vários
laboratórios que têm como especialidade gerar mutantes. Analisando 26.000 tratados
com ENU, Nolan e colaboradores (Nolan et al, 2000) puderam isolar 500 mutações
novas envolvendo problemas nos membros, malformações caudais e craniofaciais.
Outro grupo isolou mutações dominantes e recessivas após análise de 14.000 animais da
prole de intercruzamentos e retrocruzamentos envolvendo animais tratados com ENU, o
que possibilitou a identificação de 182 novas mutações em diversos fenótipos (de
Angelis et al, 2000).
Apenas cerca de 5% dos estimados 30.000-40.000 genes que compõe o genoma
murino possuem mutações isoladas, a maioria destas sendo mutações dirigidas por
processo de recombinação homóloga em células tronco embrionárias (Perkins, 2002). A
8
abordagem fenotípica que utiliza ENU como agente mutagênico aposta no isolamento
de alelos mutantes de interesse e no estabelecimento de linhagens mutantes modelo para
doenças humanas. Hoje, virtualmente todos os projetos de indução de mutações com
agentes químicos utilizam preferencialmente ENU aos outros compostos (Williams,
2003). A enorme coleção de mutações já isoladas, mapeadas e estudadas, aliada ao
potencial já demonstrado do camundongo como organismo modelo, vem permitindo aos
especialistas vasculhar cada detalhe genético envolvido nos processos metabólicos de
vertebrados. Certamente, este maior entendimento da função gênica vem do estudo de
mutantes (Soewarto et al, 2000).
A seguir apresentamos o artigo referente ao projeto de indução de mutações pelo agente
químico ENU.
9
Assessing gene function by inducing mutations in
the mouse genome
SMG Massironi1, BLF Schamber-Reis3, JG Carneiro3, LBS Barbosa3, CB Ariza4, GC
Santos3, JL Guénet2, ALB Godard3
1
Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São
Paulo;
2
Unité de Génétique des Mammiféres, Institut Pasteur, Paris,
3
Laboratório de Genética Animal e Humana, Departamento de Biologia Geral, Instituto
de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais;
4
Departamento de Bioquímica, Disciplina de Biologia Molecular, Universidade Federal
de São Paulo.
Short running title – Inducing mutations in the mouse genome
Key words- mutation, Ethyl-nitrosourea, mouse
Abstract
Systematic production of mutant phenotypes in mice can be achieved basically
through two approaches: gene-driven and phenotype-driven. Through the gene-driven
approach, also known as the transgenic production, it is possible to explore the function
of already known genes. The induction of mutants through the phenotype-driven
approach enables the identification of new genes and their relevant biological pathways.
The most efficient chemical drug used to induce mouse mutations is Ethyl-nitrosourea
(ENU), an alkylating agent which generates point mutations in mouse DNA. Consistent
with its mode of action, ENU can induce both loss and gain of function. Using ENU as
a mutagenic drug in mice, several laboratories throughout the world have created grand
scale programs with the aim of increasing the number of mutations available, generally
associated with protocols of systematic phenotypic analysis. These studies have yield
immunological and behavioral models, not yet known. On the other hand, modest
programs can equally contribute to this effort, once the mutant induction occurs by
10
chance. In our laboratory, a modest project of ENU mutagenesis produced eleven new
mutant alleles from which five have been localized on the mouse genetic map as a first
step towards positional cloning. To map these mutants and study their phenotypes a
group of Brazilian laboratories joined efforts to better explorer these new models.
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Introduction
The publication of the complete sequence of the human genome and some model
organisms (rat, mouse) can be considered a landmark achievement in life sciences.
Analysis of these sequences with specialized software utilities has revealed a great deal
of new information concerning the genome structure, opening the way to a new
discipline: comparative genomics. However, the analysis of the individual sequences, if
it can help in the identification of genes and other important genomic sequences, does
not reveal much concerning their function(s) and this is why, as of today, functional
information is available for no more than 30% of the mammalian genes. The greatest
challenge for the next phase of genomic research will certainly be to identify functional
DNA from the rest of the sequence and to assign a role to it; and the only reliable way to
reach this goal is to specifically address this question through experimentation.
Experiments performed with this aim are based on two strategies. The first,
termed "reverse genetics", consists in the production of targeted alterations in the
genome, which result in either the non-expression or the misexpression of an unknown
gene. Such mutations are in general engineered in vitro, and once they have been
induced, mutant genotypes are bred and their phenotype thoroughly carefully
scrutinized in the context of the whole organism. This strategy, due to its nature, is often
referred to, as a "top-down" approach. With the availability of embryonic stem cells (ES
cells) this strategy has become very popular in many laboratories and several hundreds
of transgenic mice have been generated worldwide. More recently, trans-national
projects have even been approved by funding agencies for the concerted and systematic
production of at least one null (knockout) mutations in each and every gene of the
mouse genome. There is no doubt that such projects, when completed, will dramatically
implement our knowledge of the function of genes. The second strategy for gene
annotation is based on the observation of phenotypic variations in a given population
followed by the molecular identification of the underlying genetic factor(s) after
positional cloning. Since it proceeds from phenotype to genotype, this strategy is a
"bottom-up" approach and is often called "forward genetics".
Both strategies have been widely used in model organisms, in particular in the
mouse, and both have advantages and drawbacks. The production of targeted mutations
is a straightforward approach for the annotation of genes with virtually no limitation.
One can consider, for example, that any DNA sequence whose function is unknown can
12
be altered in vitro and a mouse embryo can be produced with the mutation in the
homozygous state to study its phenotypic effect. With some refined techniques this
engineered can even be made conditional and/or tissue specific.
However, the
production of targeted alterations in the genome requires experience and rather
sophisticated skills and equipments. More importantly, in many instances, it ends up
with inconclusive phenotypes. This is the case for example when the targeted gene
appears to be essential and its inactivation leads to early embryonic death or, conversely,
when the inactivated gene leads to a very subtle or difficult to assess phenotype or even
no phenotype at all. Positional cloning of mutations whose phenotype is obvious is
sometimes a tedious enterprise that requires the breeding of hundreds of mice to reduce
to a minimal size the interval harboring the mutant locus, but it is always informative
and requires only simple molecular techniques. In fact, one can consider that both
strategies are complementary rather than alternative with, however, the peculiarity that,
while in vitro genetic engineering is universally applicable, positional cloning requires
that mutations with a clear cut phenotype be available.
In this paper we report the conclusions of an experiment we undertook five years
ago, with the aim of producing new mouse mutations with the potent chemical mutagen
Ehtyl-Nitroso-Urea (ENU). We found eleven new mutant alleles out of which five have
been localized on the mouse genetic map as a first step towards positional cloning.
13
Material and Methods
Animals
BALB/c, C57BL/6 and NZB mice were obtained from the Breeding Mouse
Facility of the Department of Immunology of the Institute of Biomedical Sciences
(ICB), University of São Paulo. During the treatment and breeding period, mice were
kept in micro-isolators in rooms, with sanitary barriers. The temperature was maintained
constant with range 21+2oC and with 12 hours light and dark intervals. The mice
received commercial food (Nuvilab - Nuvital ® ) and water ad libitum. The work was
approved by the ICB USP ethical committee with the number 29/2000.
ENU treatment
BALB/c strain was chosen for mutagenesis protocol because this strain tolerates
ENU treatment and as an isogenic strain has its chromosomes well known. On the other
hand, using a white strain it is not possible to detect fur coloration mutants. ENU
(SIGMA Ref N3385-ISOPAC N8509) was dissolved in a pH 5 solution, of which male
mice, 8 to 10 weeks old, received a single intra-peritoneal dose of 250 or 200 mg/Kg or
multiple injections of 100 or 95 mg/Kg at weekly intervals for three to four weeks. The
treated mice were held for a week in complete isolation until they had cleared the
carcinogenic substance.
Waste refuse and bedding was destroyed by highly
concentrated chlorine solution.
Breeding scheme
ENU treatment induced a sterile period up to seven months. After recovering
fertility, BALB/c males treated with mutagen were mated to BALB/c females, and the
offspring were observed so that dominant mutations arising in germ cells of the treated
males could be detected in F1 progeny. To recognize recessive mutations, male of F1
generation were mated with normal BALB/c females and mated again with their female
offspring. In doing so, most of the induced recessive mutations remained in a
homozygous state becoming observable in the G3 generation (Figure. 1). For those
pedigrees in which recessive mutations were identified and tagged, and new crosses
were established to keep the new mutation in a BALB/c coisogenic status.
14
Identification of mutant phenotypes
The identification of mutant phenotypes was made by careful examination of the
behavior and integrity of the offspring of the mutagenised males from birth onwards.
Body size, ears, eyes, skin, hair, behavior, skeleton, tail and extremities, were routinely
examined for visible defects.
Mapping process
Male homozygous or heterozygous for a new mutation were mated with females
partner of C57BL/6 or NZB strains. These strains were chosen because they have good
fecundity and show relatively high genetic divergence from BALB/c mice. Intercross or
backcross progeny were bred and mutant phenotypes identified (Figure 2). Using PCR
technology (1), DNA sample prepared from the new mutants were then analyzed by
PCR technology and to a genome-wide scan with 54 molecular markers
(microsatellites) was undertaken to determine which of the markers constantly cosegregate with the mutant phenotype. In a first step, 50 mutant mice were used in the
linkage analysis, for the positional cloning, 500 mutant mice were needed to construct a
high resolution genetic map of the region.
Result analysis
The DNA used for mapping was analyzed for linkage disequilibrium. Linkage,
once established, was further investigated using new markers to reduce the critical
interval containing the mutant locus. Phenotypical characterization of each mutation
was achieved while mapping was in progress, including histopathology, morphology
and behavior.
15
Results
ENU treatment
Four schemes of ENU treatment were used to determine the best dose to use for
BALB/c males, in our experimental conditions. All treatments lead to a sterile period
lasting between 21 and 30 weeks. The mortality and infertility rates tended to diminish
with the fractioning of doses, even considering the rate of 40 % obtained in the
treatment of 3 X 95 mg/Kg.
Table 1– Mortality, fertility, sterile period and number of pedigree established after
treatment of BALB/c males with different doses of ENU
ENU no. of mortality sterile fertility pedigree mutants obtained
%
%
established
dose males
period
(mg/Kg)
(weeks)
mergulhador, rodador,
250
35
42.9
30
28.6
49
Sacudidor de Cabeça
200
3x100
34
30
26.5
13.3
22
30
5.9
40.0
16
70
careca
equilibrio, nervoso,
cruza pernas, sem pelo,
bate palmas
3 x 95
10
40.0
21
50.0
72
anêmico, fraqueza
Mutants obtained
Eleven mutations were obtained that could be fixed as BALB/c co-isogenic
strains. Table 2 describes the phenotypes observed and, for some of these, the
chromosomal location. Only one dominant mutation (Sacudidor de Cabeça) was fixed,
while all other were recessive. Several mutations were lost mainly due to infertility. The
majority of lost mutations were dominant.
The carefully observation of ENU treated males lead to identification of
different phenotypes affecting skin, equilibrium, development and behavior. Their
names, given in Portuguese, describe the main characteristic of each mutant. According
to fertility and availability of parameters to distinguish mutants and non-mutants it was
possible to establish breeding schemes for mapping some of the genes.
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Table 2 - Mutants obtained and chromosomal location
Mutation
anêmico
Inheritance
Recessive
bate palmas Recessive
careca
Recessive
cruza
as Recessive
pernas
equilíbrio
Recessive
fraqueza
Recessive
mergulhador Recessive
nervoso
Recessive
rodador
Sacudidor
de cabeça
sem pêlo
Main phenotype
Chromosomal Symbol
location
Anemia
Not established anem
yet
Clapping when carried by Not established bapa
tail
yet
Fur development
Crossing
limbs
when
carried by the tail
Tilted head
Progressive
loss
of
movement coordination
Tilted head
Anxiety behavior
Chr. 7
Not established
yet
Chr. 17
Chr. 1
carc
crup
mlh
nerv
roda
Sacc
nudesepe
Recessive
Dominant
Circling behavior
Head tossing movement
Chr. 5
Not established
yet
Chr. 10
Chr. 15
Recessive
Fur development
Chr. 11
eqlb
frqz
The first mutation mapped was mergulhador (mlh). This recessive mutation
affects the ability of the mouse to swim.
Under normal laboratory conditions,
mergulhador mice exhibit head-tilting but show no other behavioral abnormalities such
as circling or head-tossing. The gene, located on chromosome 5, was recognized as an
allele of the mutation tilted that affects balance by impairing otoconial morphogenesis
without causing collateral deafness. Tilted and mergulhador are then two mutant alleles
at the gene Otopetrin 1 (Otop1) locus. The gene encodes a multi-transmembrane domain
protein that is expressed in the macula of the developing otocyst. Both mutants carry
single point mutations leading to non-conservative amino acid substitutions that affect
two putative transmembrane (TM) domains (tlt, Ala151!Glu in TM3; mlh, Leu408!Gln
in TM8). Otop1 and Otop1-like paralogues, Otop2 and Otop3, define a new gene family
of genes with homology to the C. elegans and D. melanoganster DUF270 genes (2).
Careca (carc) is a recessive mutation that shows hair abnormalities from the first
pelage. Hairs are sparse; especially around the eyes, on the limbs and belly. Between 45
to 60 days, some mice lose all of the fur; then hairs reappear, always scattered.
Histological analysis of adult skin showed an increase of skin thickness due to a great
number of follicles in anagen, which is the active growth phase when the hair fiber is
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produced. At the same age hair follicles of controls BALB/c were in telogen, known as
a rest stage. Careca has been localized on chromosome 7.
Sacudidor de cabeça (Sacc) is a dominant mutation that makes the mice to shake
their head continuously. The intensity of movement varies according to the agitation.
When manipulated, head-shaking intensifies. This movement stops only when the mice
are asleep. This mutation was located on chromosome 15.
The recessive mutation rodador (roda) makes the mice continuously walk in
circles while moving their head up and down. There again, agitation varies according to
the agitation state, when manipulated mice shake head more intensively. Rodador
mutant has been located on chromosome 10.
Another recessive mutation obtained was called equilíbrio (eqlb), due to its
problems manifested in motor coordination. These mice always keep their head tilted
downward and the permanence on rota-rod is diminished when compared to controls.
This phenotype, that clearly shows problems in balance, suggests that the cerebelum
development is impaired. The equilíbrio mutant has been located on chromosome 17
The mutant sem pelo (nudesepe ) presents no hair throughout their lifespan, the
thymus is absent, and complementary crosses confirmed that it is a new allele of the
nude mutation.
The mutant fraqueza (frqz) has been recently located on chromosome 1; this is a
recessive and lethal mutation. Mice progressively lose movement coordination and die
at four to six weeks of age. The lifespan can be extended a bit, by enriching the cage
environment and making water and food available into the cage, once the mice can no
longer stand to take them.
Anemico (anem) is a recessive mutant that presents yellowish color at birth,
easily observed among BALB/c neonates. Adults show ears and tail extremely white,
fertility is reduced in males and females. Preliminary phenotype characterization
showed reduction in red blood cells number and increase in reticulocytes and leukocytes
number.
The mutants bate palmas (bapa) and cruza pernas (crup) show abnormal
movement of posterior legs when carried by tail. These movements suggest problems in
balance and motor coordination. The phenotype characterization and mapping will
begin as soon as the breeding performance of both mutations improves.
The behavior of nervoso (nerv) mutant refers anxiety. The movements in the cage are
sometimes quicker than normal, when carried by the tail mice shake vigorously all the
18
body. It was observed spontaneous seizure in some mice. Better characterization of
phenotype is needed to permit the selection of mutants for mapping.
19
Discussion
ENU is a powerful mutagen agent that enables the generation of countless point
mutations in different parts of the mouse genome (3). The point mutations allow gradual
alterations in the gene and detailed studies involving its function. ENU allows the
identification of genes previously unknown, since the random mutations different from
gene targeting does not depend of the previous knowledge of the localization and the
sequence of the genes. It is important o emphasize that the random mutagenesis differs
from the transgenesis being compulsorily punctual, while the transgenesis production
always change a significative portion of the sequence. With ENU it is possible to obtain
several alleles of the same locus which will interfere in different ways in the phenotype,
while using knock-out technology it is generally possible to create just one null allele.
ENU efficiency depends upon the dose and scheme of treatment. In our work,
single and fractionated doses were assayed; our results show that the fractionated doses
seem to diminish infertility and augment to a degree the number of mutants obtained.
With fractionated doses of 100 mg/Kg Hitotsumachi and colleagues (4) obtained a
higher mutant index.
The phenotypic examination of the animals in F1 and F2 generations after ENU
treatment involves different protocols in order to maximize the recognition of mutations
and to isolate mutations of subtle phenotypic effect. Some phenotypes are easy to
identify as problems in the coloration, visual structure of the fur and bone
malformations (5). The neurological and behavior problems demand advanced
examination that requires special methods (6). More sophisticated methods of
phenotype diagnosis, as magnetic resonance, are being developed to complement and to
speed up the characterization of the mutants (7). In this project the mutants were firstly
identified by carefully observation of the phenotype; the pedigrees in which some
abnormalities where identified were continuously observed. Some basic tests were
employed to confirm some of the mutations, even without a sophisticated method of
phenotype diagnosis; it was possible to identify valuables mutations. Using more
sophisticated methods it would certainly be possible to find mutations with late onset or
lethality at birth.
The correct characterization of phenotype is a crucial step for all the process that
aims the discovery of the responsible gene for the mutation. The correct handling of the
20
animals is essential for the success of ENU treatment and the characterization of the
mutation. The phenotype expression in mice, as well as in human beings, is highly
susceptible to changes in the environment. One must pay attention to the way the tests
are applied. A simple change in the order of the experiments can influence the results
of the tests, depending on the stress that the mice are submitted (7). Another important
point is the choice of the strains used in the generation of hybrids for mapping. Mutants
that express a particular behavior in one background cannot present the same behavior
when background is mixed (7). Furthermore, it is important to certify that the phenotype
observed results only from the generated mutation or is related with the background in
which it was inserted (8). In our work the first attempt for mapping the nervoso mutant
was unsuccessful; the behavior of this mutant could not be distinguishing in the hybrids
obtained for mapping. The recognition of this mutation in BALB/c background is quite
easy; because the affected mice are very different from the normal ones that are not
agitated; on the other hand in the BALB/c X C57BL/6 F2 generation it was very
difficult to find a reliable parameter to distinguishing them. New parameters must be
tested to permit the mapping of this mutant.
The projects of induction ENU mutants certainly increase the collection of
sequenced point mutations in mouse genome, leading to the discovery of new genes or
improving the studies of function with allelic variants added. The information that will
be extracted from the functional studies and genetic of the mutants, combined with data
from other projects and manipulated by modern computational tools, certainly will favor
the understanding of the routes in which the genes are involved and of its biological
functions. Our program, although modest in scope, has led to the discovery of several
mutations that may contribute to fill the phenotype gap in the mouse mutant resource.
The ratio new mutant/new allele seems to be the same found in literature, it means 40%
(9). Even modest ENU programs may contribute to this goal, since the mutations occurs
by chance and the results could collectively be joined to achieve the main objective to
create a mutant map of the mouse whereby every gene is related to some information
regarding its function.
21
Acknowledgements
The authors are grateful to Joelma dos Santos Lima for the special care with the
mice. Support for this work was provided by FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa
do Estado de São Paulo)
References
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9. Guénet J-L. Chemical mutagenesis of the mouse: an overview. Genetica, v.122,
p.9-24, 2004.
22
Figures
Figure 1 – Breeding schemes in the mutagenesis screens for dominant and recessive
mutations. BALB/c (ENU-treated) males are mated with BALB/c females. Their
progeny (G1) are observed for dominant mutant phenotype. G1 males are mated to
wild-type BALB/c females to generate G2 families. Matings of G2 females with their
G1 fathers give rise to G3 progeny that can be observed for recessive phenotype.
* 4 G2 females are mated with their fathers.
23
Figure 2 – Breeding schemes in mutagenesis mapping. (A) for dominant mutations;
(B1) backcross and (B2) intercross for viable and fertile recessive mutations; (C) for
non viable and infertile mutations. DNA of F2 mutants are analyzed.
24
4. Artigo 2 – Mapeamento Genético da mutação
careca
O projeto de indução de mutações por ENU, realizado conjuntamente entre o
Laboratório de Genética Animal e Humana do Instituto de Ciências BiológicasICB/UFMG e o Biotério de Experimentação do Depto. de Imunologia-ICB/USP, obteve
êxito na recuperação de mutações autossômicas dominantes e recessivas que conferem
aos camundongos fenótipos bastante peculiares. Cada fenótipo mutante isolado neste
trabalho foi atentamente avaliado. Algumas destas mutações, tendo em vista um
interesse especial fomentado pela observação de seus fenótipos, foram selecionadas
para serem localizadas no genoma murino. A mutação careca (carc) foi uma das
primeiras a serem escolhidas para o mapeamento genético.
A mutação autossômica recessiva careca foi isolada em 1999 pela Prof. Sílvia
Maria Gomes Massironi. A mutação careca (Figura 1) é caracterizada primariamente
por uma evidente rarefação de pelagem por todo o corpo. Os camundongos carc/carc
apresentam esta pelagem rarefeita por toda a vida, com distribuição uniforme, e nunca
apresentam pelagem completa. Essa distribuição dos pelos é observada a partir da
primeira pelagem. Por volta dos 45-60 dias, alguns camundongos ficam completamente
pelados e, a partir desta idade, voltam a apresentar o mesmo padrão de rarefação
corporal. O crescimento da pelagem em camundongos ocorre em um padrão composto
por fases alternadas de crescimento e descanso. Este ciclo é periódico e se prolonga da
região da cabeça até à cauda, ao mesmo tempo em que vai da região ventral para dorsal.
É sabido que a maioria dos folículos pilosos presentes em camundongos normais
encontra-se em fase de telógeno, e que somente cerca de 10% dos folículos encontramse em fase de anógeno. Estes dois tipos de folículos coexistem devido ao padrão de
crescimento normal do pêlo em camundongos adultos. A análise microscópica da pele
de camundongos careca mostrou que a maioria dos folículos pilosos está em fase de
anógeno, com conseqüente espessamento da pele (Figura 2A). Em camundongos
BALB/c observou-se que a grande maioria dos folículos pilosos apresentava-se em fase
de telógeno (Figura 2B). A pele de camundongos careca a partir do primeiro dia de vida
já mostra hiperqueratose. No quarto dia observa-se desorganização e falta de
25
Figura 2 - Corte histopatológico da pele de camundongos: (A) Careca – folículos pilosos em
fase de anagem; (B) BALB/c – folículos pilosos em fase de telogem. Aumento 4×.
27
delimitação das camadas da epiderme. No décimo dia evidencia-se distribuição dos
folículos pilosos menos uniforme que no controle e no décimo terceiro dia esses
folículos encontram-se mais ativos (anagênese) e em maior número. No décimo sexto
dia, a epiderme continua mais espessa, a derme mais densa e os folículos pilosos são
grandes e ativos nos camundongos carecas, quando comparados aos seus controles.
Observam-se ainda pêlos formados na hipoderme e presença de algumas formações
císticas. Observações feitas no décimo nono dia de vida evidenciam a presença dessas
formações císticas em maior número com debris de queratina no seu interior, indicando
a presença de pelos em decomposição. Estes resultados sugerem uma alteração nos
processos de delimitação e maturação dos extratos epidérmicos e migração anômala dos
folículos pilosos, uma vez que os mesmos são encontrados na região da hipoderme e
observa-se a presença de formações císticas na derme. Além de alterações de pele, os
mutantes carc apresentam glomérulos com membrana basal espessada e aumento de
celularidade em cortes histológicos de rim de animais com três meses de vida, o que
caracteriza um quadro de glomerulonefrite membrano-proliferativa. Os mesmos animais
mostraram também linfonodos hiperplásicos, embora ocorra distribuição normal de
linfócitos T, B e macrófagos.
Depois de caracterizar a mutação careca e determinar o modo de herança da
mutação, o interesse maior é chegar na causa do fenótipo, isto é, localizar o gene
mutante. Vários projetos envolvendo indução de mutantes com ENU utilizaram o
mapeamento genético como estratégia primeira na caracterização genética de alelos
mutados. Em geral, genes murinos identificados somente pelos fenótipos mutantes são
mapeados para definir geneticamente um locus, permitindo em seguida, na maioria das
vezes, a identificação de genes candidatos na região mapeada (Taylor, 2000).
O mapeamento genético, ou análise de ligação, consta da construção de mapas a
partir de dados obtidos pela análise de marcadores herdados em cruzamentos
controlados (Boyd, 1998). A produção de híbridos a partir de duas linhagens e o
subseqüente cruzamento destes híbridos entre si (caracterizando o intercruzamento) ou
com seus pais (caracterizando o retrocruzamento) permite a obtenção de prole que é
genotipada para marcadores polimórficos codominantes. O nível de resolução do
mapeamento depende tanto da disponibilidade e quantidade destes marcadores na região
28
a ser mapeada quanto do número de indivíduos da amostra. O mapeamento genético de
um locus é o primeiro passo em direção à sua clonagem posicional.
A análise genética da mutação careca foi iniciada em setembro de 2000 sob a
orientação da Dra. Ana Lúcia Brunialti Godard, professora da Pós Graduação em
Genética do ICB/UFMG. A meta estabelecida nesta fase do trabalho foi determinar a
localização cromossômica do gene careca por mapeamento genético à média resolução,
identificar as regiões cromossômicas humanas que mostram homologia com o segmento
cromossômico mapeado no camundongo e sugerir genes candidatos no intervalo.
A primeira etapa do projeto, após o estabelecimento, por cruzamentos, de
linhagem homozigota para a mutação carc em background BALB/c, constou de
cruzamentos para geração de animais a serem utilizados no mapeamento. O protocolo
adotado envolveu o cruzamento de animais parentais carc/carc da linhagem BALB/c
com animais isogênicos C57BL/6. Os animais obtidos nas várias F1 foram
retrocruzados com animais BALB/c homozigotos para o alelo careca. Gerou-se com
isso 118 animais afetados na geração N2 para o mapeamento.
Em um primeiro momento, cerca de 10 animais foram genotipados utilizando
um painel de 54 marcadores microssatélites polimórficos entre as linhagens BALB/c e
C57BL/6, distribuídos com uma média de dois a três marcadores por cromossomo
murino. Os marcadores foram selecionados através do banco de dados do MGI-Mouse
Genome Informatics (www.informatics.jax.org), baseado nas posições relativas em
centiMorgans (cM). É possível delimitar intervalos cromossômicos muito pequenos
com o uso dos microssatélites, e.g. 0.1 cM, resolução inimaginável de se obter com
outros tipos de marcadores. Este número definido de animais e de marcadores obedeceu
a uma equação bem estabelecida que fornece uma alta probabilidade estatística para
detectar ligação genética entre uma mutação segregante em um cruzamento controlado e
um marcador genético polimórfico numa distância de até 20 cM (Montagutelli, 2000). A
ligação é válida quando a distribuição independente dos alelos marcadores na prole não
ocorre e se observa um excesso estatisticamente significativo de haplótipos parentais em
relação a haplótipos recombinantes nos indivíduos da prole, devido à proximidade física
29
entre eles. Após amplificação dos marcadores microssatélites por PCR a partir dos
DNAs de animais da geração N2 e análise dos fragmentos em gel, buscou-se um padrão
de homozigose para o polimorfismo da linhagem BALB/c na maioria das amostras, já
que os animais genotipados provinham de um retrocruzamento e a mutação careca foi
induzida no background BALB/c. Este indício foi evidenciado pela genotipagem dos
animais com o marcador do cromossomo sete murino D7Mit259. Para fortalecer o
resultado e confirmar a ligação, os 108 animais restantes também foram genotipados
com este mesmo marcador. O resultado unânime foi de homozigose para a banda de 130
pares de bases do marcador D7Mit259 de origem BALB/c.
A densificação do mapeamento se deu pela genotipagem de todos os 118
animais com dez marcadores extras também selecionados no banco de dados do MGI,
tanto acima quanto abaixo da região D7Mit259. Os resultados das genotipagens,
condensados na forma de haplótipo, permitiram delimitar um intervalo cromossômico
carc de 10.50 cM de extensão, demarcado pelo marcador D7Mit105, posicionado à
63.50 cM do centrômero e a porção telomérica distal do cromossomo 7 murino.
O conhecimento sobre a localização cromossômica de uma mutação leva à
seleção de genes candidatos potenciais que se encontram na região (Soewarto et al,
2000). O mapeamento à média resolução da mutação careca permitiu a seleção de
alguns genes candidatos como, por exemplo, frizzy, que dá aos animais uma pelagem
ondulada e crespa, e Tssc6, responsável pela doença auto-imune alopecia areata em
humanos, que leva à perda generalizada de pêlos. A escolha destes candidatos se baseou
principalmente em informações funcionais disponíveis na literatura (Montagutelli,
2000), obtidas a partir de mutantes murinos e mutações humanas seqüenciadas. Toda a
metodologia utilizada e os resultados obtidos nesta fase inicial de caracterização do
mutante carc foram apresentados em agosto de 2003 sob a forma de monografia de
bacharelado.
A proposta de trabalho desta dissertação de mestrado veio em conseqüência da
necessidade de refinar o mapeamento genético da mutação careca. Estima-se que um
intervalo de 10.50 cM mapeado à média resolução contenha aproximadamente 150
genes. Com isso, foi sugerida uma estratégia mais ousada que admitisse a seleção de
genes candidatos mais apropriados em uma região genética melhor definida.
30
O nível de resolução alcançado em uma análise de ligação depende da densidade
de marcadores polimórficos na região e da quantidade de animais disponíveis para
genotipagem. Hoje o número de animais fica sendo o fator limitante, pois os bancos de
dados disponíveis na Internet permitem manipular facilmente a grande quantidade e
diversidade de dados referentes aos milhões de marcadores genéticos disponíveis. Para
um mapeamento à alta resolução como um ponto de partida para a clonagem posicional
do gene, é necessário um número próximo de 1000 animais (Montagutelli, 2000).
Tendo em vista o exposto acima, definiu-se como objetivo geral deste trabalho a
execução do mapeamento genético a alta resolução da mutação careca. Para atingir este
objetivo foram adotadas várias estratégias. A primeira envolveu o estabelecimento de
uma nova bateria de cruzamentos com a linhagem NZB em substituição à linhagem
C57BL/6, o que mobilizaria novos polimorfismos para o intervalo previamente
mapeado. Foi possível gerar 665 novos animais através de retrocruzamento utilizando a
linhagem NZB. Ao mesmo tempo foram selecionados novos marcadores microssatélites
polimórficos no intervalo mapeado, com o intuito de detectar eventos de recombinação
acima e abaixo do locus carc. A genotipagem destes marcadores com todos os 783
animais provenientes dos retrocruzamentos permitiu a construção de um haplótipo
integrado. A análise dos recombinantes delimitou o intervalo careca em 5,56
megabases, que possui homologia de sintenia com o cromossomo 10q26 humano.
Todos os elementos genéticos identificados neste intervalo, incluindo genes,
pseudogenes e marcadores, foram avaliados cuidadosamente com o intuito de selecionar
um bom gene candidato (Anexo 1). O melhor candidato selecionado, dentre todos os
genes da região, foi o gene Fgfr2 (Fibroblast growth factor receptor 2).
O processo de desenvolvimento de várias espécies animais, incluindo
mamíferos, é mediado por um grupo específico de moléculas sinalizadoras
intercelulares da família dos fatores de crescimento Fgf (fibroblast growth factors). Em
mamíferos já foram identificados 22 membros da família FGF, sendo que estes
desempenham um importante papel no desenvolvimento embrionário (Braun et al,
2004). A ligação destes fatores aos seus respectivos receptores leva a ativação de
domínios com função de tirosina cinase e posterior ativação de cascatas de transdução
de sinal específicas. Já foram isolados quatro tipos de receptores para Fgfs (Fgfr1 a
31
Fgfr4). Contudo, podem surgir isoformas adicionais por splicing alternativo dos RNAs.
O gene Fgfr2 codifica um destes receptores de membrana para Fgfs. A ocorrência de
splicing no RNA de Fgfr2 gera duas isoformas funcionais, Fgfr2-IIIb e Fgfr2-IIIc
(Petiot et al, 2003), sendo que a primeira só pode ser isolada a partir do epitélio presente
em órgãos de origem ectodérmica e endodérmica, e a segunda tem expressão confinada
a tecidos mesodérmicos. Os resultados de diferentes trabalhos envolvendo análises
genéticas e histopatológicas em animais knockout para Fgfr2 sugerem um íntimo
envolvimento deste receptor na embriogênese da derme e epiderme, além de participar
ativamente na sinalização e diferenciação de anexos presentes, como folículos pilosos e
glândulas sebáceas (Werner et al, 1994; Celli et al, 1998; Moerlooze et al, 2000; Petiot
et al, 2003).
Em vista disso, admitiu-se que um dos genes mapeados na região careca está
estreitamente envolvido no desenvolvimento embrionário de camundongos e se integra
no processo de sinalização epidérmica para diferenciação de constituintes funcionais
como, por exemplo, o pêlo. O incentivo para trabalhar com o gene Fgfr2 veio destes
indícios funcionais disponíveis na literatura. É fundamental neste momento isolar e
identificar a natureza da mutação responsável pelo fenótipo carc, pois em geral este tipo
de informação molecular permite uma melhor associação da lesão genômica com o
fenótipo mutante observado. Existem muitas técnicas possíveis para caracterizar os
genes murinos identificados somente pelos fenótipos mutantes, como, por exemplo,
estudos de complementação utilizando fragmentos selvagens clonados em BACs e
mapas físicos utilizados na clonagem posicional (Anderson, 2000). A estratégia
escolhida para a sondagem da mutação careca envolveu o seqüenciamento de alguns
éxons específicos do gene Fgfr2, selecionados através de triagem por DHPLC
(Denaturing High Performance Liquid Chromatography) de fragmentos amplificados
por PCR a partir de amostras de cDNA de animais normais e animais mutantes. As
seqüências dos éxons obtidas de várias linhagens murinas isogênicas não-afetadas foram
alinhadas e comparadas, na tentativa de se isolar a mutação causadora do fenótipo
careca.
Genes envolvidos em fenótipos de pelagem em camundongos foram
identificados por clonagem posicional. Por exemplo, uma mutação isolada no gene
mK6irs1 murino, que codifica uma queratina do tipo II participante da formação de
32
filamentos intermediários celulares, levam a anormalidades na estrutura pilosa (Peters et
al, 2003). A clonagem, em ratos, de uma mutação no gene da desmogleína 4 que
interfere na formação normal do eixo do pêlo foi auxiliada por dados extraídos do
mapeamento da mutação lah em camundongo, que leva ao mesmo fenótipo (Jahoda et
al, 2004). Outras mutações murinas de pelagem, como juvenile bare (jb) (Lane et al,
1998), scraggly (Herron et al, 1999) e scant hair (snth) (Wu et al, 2004), também foram
identificadas no genoma murino através de mapeamento genético e triagem de genes
candidatos em intervalos mapeados de diversos cromossomos.
O segundo artigo, apresentado a seguir, disponibiliza os dados experimentais e
informações obtidas durante o período de mestrado. Este artigo é original e tenta
caracterizar melhor a mutação careca em nível molecular.
33
Mapeamento genético da mutação careca (carc)
induzida por ENU em camundongos
Bruno Luiz F.S. Reis1, Sílvia M.G. Massironi2, Jean-Louis Guénet3 e Ana Lúcia B.
Godard1
1
Laboratório de Genética Animal e Humana, Departamento de Biologia Geral, Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais;
2
Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo;
3
Unité de Génétique des Mammiféres, Institut Pasteur, Paris.
Palavras-chave: ENU, mutação, pêlo, pele, mapeamento genético, Fgfr2, DHPLC,
seqüenciamento.
Resumo
A mutação autossômica recessiva careca (carc), induzida por ENU, leva a um fenótipo
caracterizado por pelagem rarefeita e alterações na pele caracterizadas por espessamento
da epiderme e estrutura pilosa comprometida, além de alterações nos rins e linfonodos.
O mapeamento genético à alta resolução do locus carc, utilizando 783 animais
provenientes de retrocruzamento, posicionou a mutação num intervalo de 5,56
megabases delimitado pelos marcadores D7Mit105 e D7Mit304, no cromossomo 7
murino. Dentre os 26 genes conhecidos da região, o gene Fgfr2 (fibroblast growth
factor receptor 2) foi considerado o melhor gene candidato pela alta semelhança
fenotípica observada entre knockouts para este gene e o mutante careca. A análise de
cromatogramas
gerados
por
DHPLC
(denaturing
high
performance
liquid
chromatography) mostraram ocorrência de formação de heterodúplex numa amostra
composta pela mistura equimolar de fragmentos de 908pb de Fgfr2 amplificados a partir
do cDNA de animais normais e mutantes. Todos os oito éxons contidos neste fragmento
foram seqüenciados a partir do DNA genômico de linhagens isogênicas normais
BALB/c, C57BL/6, A/J e NZB, além da linhagem careca. Embora os dados obtidos nos
alinhamentos das seqüências não mostrarem mutações nos éxons e regiões doadoras e
aceptoras de splicing adjacentes, os resultados ainda não podem excluir o gene Fgfr2
34
como um candidato para a mutação carc. Estratégias complementares na sondagem
desta mutação são discutidas.
35
Introdução
Dentre a grande diversidade de mutações espontâneas e induzidas já isoladas em
camundongos, verifica-se que uma parcela significativa leva ao aparecimento de
fenótipos cutâneos alterados que comprometem a quantidade, morfogênese, ciclagem e
estrutura do folículo capilar (Nakamura et al, 2001). A clonagem posicional e a análise
funcional de várias mutações que afetam a estrutura pilosa, tal como scraggly (sgl)
(Herron et al, 1999), ictiose arlequim (ichq) (Dunnwald et al, 2003), plucked (pk) (Luo
et al, 2005) e Hague (Hag) (Poirier et al, 2002), refletem uma tendência positiva em
direção a uma contribuição crescente no entendimento do papel de genes envolvidos na
formação e manutenção da pelagem. Neste contexto, a mutação careca ocupa uma
posição nesta classe de mutações, oferecendo potencial para melhor compreensão do
processo intrincado de desenvolvimento embrionário de anexos cutâneos.
A mutação autossômica recessiva careca (carc) caracteriza-se por rarefação
generalizada de pelagem (Massironi et al, 2006). Apesar deste ser o fenótipo marcante,
exames complementares mostraram que outras características externas são normais,
como o tamanho dos animais ao nascimento e ao desmame, órgãos dos sentidos,
orelhas, pele, esqueleto, cauda, membros e dedos. Nenhuma alteração comportamental
foi observada. Machos e fêmeas carc/carc são férteis. Exames histológicos envolvendo
diferentes tecidos buscaram caracterizar melhor a mutação careca. Cortes de pele
mostraram um aumento do número de folículos pilosos em relação aos animais normais
da mesma linhagem, apresentando também um aumento do número de macrófagos.
Alguns animais careca perdem toda a pelagem, recuperando-a defeituosa. Cortes
histológicos do rim de camundongos mutantes com idade de três meses evidenciaram
um quadro de glomerulonefrite membrano-proliferativa. Estes animais também
mostraram linfonodos hiperplásicos, embora ocorra distribuição tecidual normal de
linfócitos T, B e macrófagos. Os níveis medidos dos hormônios T3, T4 e TSH
mostraram-se normais.
O careca surgiu no Biotério de Experimentação do Departamento de Imunologia
do ICB/USP num projeto de colaboração com o Laboratório de Genética Animal e
Humana do Departamento de Biologia Geral do ICB/UFMG. Este projeto buscou
induzir e recuperar mutações dominantes e recessivas pela administração do agente
mutagênico sintético ENU (etil-nitroso-uréia) em background BALB/c (Massironi et al,
36
2006). O ENU tem a capacidade de alquilar bases nitrogenadas no DNA (Noveroske,
2000) podendo gerar mutações de várias classes, como, por exemplo, mutações sem
sentido, de sentido trocado e em sítios doadores e aceptores na recomposição do RNA
(Justice et al, 2000). Vários laboratórios estão aplicando o ENU para recuperação de
mutações dominantes e recessivas (de Angelis et al, 2000; Nolan et al, 2000). Mutantes
induzidos por ENU permitiram a clonagem posicional de genes envolvidos em câncer
do colo do útero (Moser et al, 2003) e obesidade (Zhang et al, 2003). A estratégia de
clonagem posicional combina análise de ligação seguida de triagem de genes candidatos
no intervalo mapeado (Collins, 1995). Tais candidatos podem ser selecionados levandose em conta evidências funcionais obtidas a partir de animais knock-out e mutações
espontâneas já descritas.
Após selecionar o gene candidato, é necessário validá-lo. Várias estratégias
podem ser empregadas. Uma delas se dá através do seqüenciamento de éxons triados
por DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography). A sondagem da
mutação se fundamenta no alinhamento e comparação de seqüências codificantes de
camundongos normais e mutantes. Através de DHPLC foi possível detectar com 97%
de sensibilidade mutações nos genes MLH1 e MSH2 humanos, envolvidos na
patogênese do câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) (Holinski-Feder et
al, 2001). Mostrou-se que a técnica é robusta para detectar mal-pareamentos de base
única em fragmentos de 1000 pb (Xiao & Oefner, 2001). Considerado o método com a
maior taxa de detecção de mutações para o gene NF1 envolvido na neurofibromatose
tipo 1 (Han et al, 2001), a tática do DHPLC também foi utilizada para a triagem de
mutações geradas por ENU em camundongos (Quwailid et al, 2004), mostrando ser
uma ferramenta acessória na identificação de loci mutados.
Este trabalho realizou o mapeamento genético à alta resolução da mutação carc
e analisou seqüências de éxons triados por DHPLC do gene Fgfr2 (fibroblast growth
factor receptor 2), destacado como melhor candidato da região mapeada no
cromossomo 7 murino. Este gene codifica um receptor de membrana para fatores de
crescimento de fibroblastos (FGFs). Em mamíferos já foram identificados 22 membros
da família FGF, sendo que desempenham um importante papel no desenvolvimento
embrionário (Braun et al, 2004). A recomposição alternativa (splicing) do RNA de
Fgfr2 gera duas isoformas funcionais, Fgfr2-IIIb e Fgfr2-IIIc (Petiot et al, 2003), sendo
que a primeira se expressa exclusivamente no epitélio de órgãos de origem ectodérmica
e endodérmica. Os fatores Fgf-7 e Fgf-10 são os principais ligantes de Fgfr2-IIIb e estão
37
diretamente
envolvidos
na
sinalização
mesênquima-epiderme
durante
o
desenvolvimento epidérmico. Vários autores descreveram um desenvolvimento anormal
em embriões murinos homozigotos para alelos knockout de Fgfr2. Análises funcionais
provindas de animais Fgfr2(IIIb)-/- indicam um envolvimento íntimo deste receptor na
sinalização
para
indução
de
linhagens
celulares
de
diferentes
órgãos
no
desenvolvimento murino, incluindo pele e anexos (pêlo e glândulas sebáceas) (De
Moerlooze et al, 2000). Animais knockout para a isoforma IIIb mostraram uma redução
significativa no número e tempo de desenvolvimento de folículos pilosos (Petiot et al,
2003), enquanto que camundongos transgênicos expressando um alelo dominante
negativo de Fgfr2 na pele levou a uma atrofia da epiderme, anormalidades em folículos
pilosos e espessamento da derme, e, em alguns casos, a uma ausência completa de
folículos (Werner et al, 1994; Celli et al, 1998). Diante da alta correspondência
fenotípica entre estes knockouts e o mutante careca, o gene Fgfr2 se tornou um
excelente candidato.
O objetivo deste trabalho foi mapear geneticamente a mutação careca no
genoma murino por análise de ligação e identificá-la por seqüenciamento de região
genômica triada por DHPLC. Um trecho do cDNA de Fgfr2 onde possivelmente se
encontra a mutação, delimitado por um intervalo que compreende os éxons de 6 a 14,
foi destacado por DHPLC. O seqüenciamento direto destes éxons a partir do DNA
genômico de animais careca e de linhagens isogênicas normais não pôde identificar
nenhuma mutação em potencial.
38
Materiais e métodos
Cruzamentos
Dois retrocruzamentos foram realizados neste trabalho. No primeiro, machos
BALB/c homozigotos para a mutação careca (carc/carc) foram cruzados com fêmeas
normais da linhagem isogênica C57BL/6, levando a uma geração F1 heterozigota
(carc/C57BL/6). Esta F1 foi retrocruzada com os pais afetados, gerando uma N2
constituída de animais normais e mutantes de ambos os sexos (Figura 1). No segundo, a
linhagem NZB foi utilizada no lugar da linhagem C57BL/6. Tanto C57BL/6 e NZB
apresentam um alto grau de polimorfismo para marcadores genéticos informativos
quando comparadas com BALB/c (Petkov et al, 2004). Os retrocruzamentos geraram
118 animais afetados BALB/c-C57BL/6 e 665 animais BALB/c-NZB (241
heterozigotos e 424 afetados), totalizando 783 animais que foram utilizados no
mapeamento genético.
Extração de DNA
O DNA genômico para o mapeamento genético foi extraído por congelamento
de amostras de cauda em nitrogênio líquido e maceração. Foi utilizado proteinase K e
um tampão de lise (Tris HCl 50mM pH 8.0; EDTA 10mM pH 8.0 e 0,5% SDS),
seguido de precipitação com álcool e diluição em TE (Miller et al, 1988). A
concentração de DNA nas amostras foi quantificada por espectrofotometria sob
comprimento de onda de 260/280 nm.
Marcadores genéticos e haplótipo
O mapeamento inicial à baixa resolução constou de um painel de 54 marcadores
microssatélites distribuídos pelos 19 autossomos. As posições genéticas dos loci em
centiMorgans (cM) e as seqüências correspondentes de seus primers foram obtidas
utilizando-se
a
ferramenta
on-line
MGI
–
Mouse
Genome
Informatics
(www.informatics.jax.org), do Laboratório Jackson. Posteriormente, para densificação
do mapeamento, levou-se em conta a posição absoluta do marcador no genoma, em
pares de bases, de acordo com dados do seqüenciamento do genoma murino disponíveis
39
no sistema Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org) (Hubbard et al, 2002;
Hubbard et al, 2005), do Instituto Sanger. Quinze marcadores se apresentaram
polimórficos entre as linhagens BALB/c, C57BL/6 e NZB e foram usados para
genotipagem e construção do haplótipo. Os primers foram sintetizados pela empresa
IDT.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
A amplificação das regiões microssatélites foi realizada por PCR através de
protocolo padrão (Ausubel et al, 1995). O programa constou de desnaturação inicial à
94ºC por 3 minutos seguida por 35 ciclos à 94ºC durante 30 segundos, anelamento dos
iniciadores entre 50ºC-60ºC durante 30 segundos e extensão à 72ºC por 1 minuto,
finalizado por extensão final à 72ºC por 3 minutos. Os produtos de amplificação foram
visualizados em gel de poliacrilamida 8% e corados pelo método de impregnação pela
prata, ou agarose 4% com brometo de etídio.
Amplificação cDNA de Fgfr2
A amplificação do cDNA de Fgfr2 se deu pela construção de 4 pares de primers
a partir da seqüência obtida do transcrito ENSMUST00000084517, anotado
automaticamente pelo Ensembl . Os primers foram desenhados utilizando o programa
PRIMER3 (Rozen et al, 2000). As seqüências destes primers, mostradas no sentido 5´
para 3´, são: 1F-GGCTGCCTGTGTGTTCCT; 1R-ATGCACTGCAACTCTAGCGA;
2F-ATCTGCCTGGTCTTGGTCAC;
2R-CGCTGTAAACCTTGCAGACA;
TTGAACGGTCACCACACC;
3R-ATCGATTCCCACTGCTTCAG;
TGAAAGATGATGCCACAGAGA;
4R-TTGCGGCTGTCCACTTATC.
3F4F-
O
perfil
esperado da amplificação dos quatro fragmentos sobrepostos está esquematizado na
Figura 3, e a comparação de todos os transcritos disponíveis para o gene Fgfr2 está
sumarizada no Quadro 1.
40
Transcrição Reversa e PCR
O RNA total foi isolado de amostra de fígado utilizando TRIzol (Invitrogen). A
integridade do RNA isolado foi avaliada por separação em gel de agarose a 1% corado
com brometo de etídio. Três microgramas de RNA total foram usados para síntese de
cDNA num volume final de 20 µl contendo 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 2.5 mM MgCl2, 10
mM ditiotreitol, 0.5 mM dNTPs, 50 ng de primers randômicos, 20 unidades de
transcritase reversa RevertAidTM H (Fermentas Inc, Hanover, MD) e 20 unidades de
inibidor de ribonuclease Ribonuclease Inhibitor TM (Fermentas Inc, Hanover, MD). Para
amplificação por PCR, 5 µl desta reação foram usados como amostra. As PCRs foram
realizadas na presença de 2.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTPs, 0.2 µM de cada membro
do par de primers para Fgfr2 e 0.15 unidades de Taq polymerase (Phoneutria). Os
tamanhos esperados dos amplicons foram confirmados em gel de agarose 2%,
padronizado por escada alélica de 50pb (Invitrogen).
Cromatografia líquida desnaturante de alta performance (DHPLC)
Os fragmentos amplificados do cDNA foram submetidos à DHPLC. A seqüência
de cada trecho foi utilizada para calcular a temperatura ótima de análise. Para um
fragmento em particular, uma mistura equimolar de amplicons provenientes de animais
careca e normais foi submetida à análise na temperatura ótima calculada pelo software
Navigator (versão 1.5.4). Foi utilizado um aparelho DHPLC WAVE Nucleic Acid
Fragment Analysis System (HITACHI-Transgenomic). As misturas de produtos de
PCR para os fragmentos de 1 a 4 foram desnaturadas a 95ºC por 3 minutos e
renaturadas lentamente por resfriamento gradual até 65ºC. As amostras foram analisadas
em colunas de eluição com temperaturas próximas à temperatura de dissociação
calculada para cada fragmento. A presença de quatro picos nos cromatogramas foi
considerada um indicador forte da existência de mutação em algum ponto da seqüência.
Amplificação de éxons
Os éxons presentes no fragmento detectado por DHPLC foram amplificados
individualmente a partir de amostras de DNA genômico extraído de camundongos
41
careca da linhagem BALB/c e normais das linhagens BALB/c, C57BL/6, A/J e NZB.
Informações sobre os éxons e seqüências intrônicas flanqueadoras para confecção de
primers foram também obtidos no Ensembl. Os melhores iniciadores foram desenhados
manualmente e utilizando o programa PRIMER3 (Rozen et al, 2000). A qualidade das
seqüências dos primers foi avaliada pelo software on-line gratuito Netprimer
(www.premierbiosoft.com) para verificar a possibilidade de formação de hairpins,
presença de regiões internas repetidas e formação de homodímeros e heterodímeros. As
seqüências dos primers forward (F) e reverse (R) descritas no sentido de 5´para 3' são:
éxon6
F-CTCTGCTTCCACCAACTTCC,
éxon7/8
F-CTCCCATTGCCTTTCTCCAT,
R-GCCCATAAAACCTGGCTACC;
R-CCACAGCCTCCAGAAACATT;
éxon9 F-CTTCGTGTCTCTCGGTTGTG, R-GGGGTCATTTGGAACATTTG; éxon10
F-AGGAACCCTTGGCTCTTTGT, R-GCTGACTGAACCTCCACACA; éxon11 FTGAGAACTATCTGAGGAGGGAAG, R-TGGAAAACGGGGAGAAAAA; éxon12
F-CTGATGGAGCCAGCATTACA, R-AGACAACGACCCTCCCAGA; éxon13 FTATCGGAGGCTCATTGGTTC, R-AACGCTCGCTCCTGATAAGA e éxon14 FGGGGAAGTGTTTCTGGCTCT, R-TAGGTGTGATGGGAAAATGC.
Seqüenciamento
O seqüenciamento foi realizado num sistema MegaBACE 1000 AmershamPharmacia Biotech utilizando kits para seqüenciamento DYEnamic ET Terminator da
mesma companhia, seguindo protocolo sugerido pelo fabricante. As amostras foram
seqüenciadas tanto no sentido direto quanto no reverso. As seqüências obtidas foram
alinhadas utilizando o programa CLUSTAL W (Thompson et al, 1994) integrado no
software MEGA 3.1 (Kumar, 2004). O exame visual dos cromatogramas foi feito
utilizando o programa CodonCode Aligner (www.codoncode.com/aligner).
42
Resultados
Mapeamento
A análise de ligação inicial constou da genotipagem de 10 animais carc/carc
para 54 marcadores microssatélites polimórficos entre as linhagens BALB/c e C57BL/6.
Cada marcador pôde detectar recombinação num intervalo genômico de cerca de 40 cM,
que é o alcance relativo calculado para a amostra genotipada de 10 animais. Ficou
evidenciada ligação do locus carc com o marcador D7Mit259, localizado a 72.00 cM no
cromossomo 7, já que todos os 10 animais apresentaram homozigose para este
marcador. Outros 15 marcadores microssatélites foram selecionados e triados, sendo
que 7 deles apresentaram polimorfismo entre BALB/c e C57BL/6 e outros 8 mostraramse polimórficos entre BALB/c e NZB. O mapeamento genético à alta resolução da
mutação careca pôde contar com 783 meioses informativas. Os resultados
possibilitaram a construção de um haplótipo que permitiu posicionar a mutação na
extremidade distal do cromossomo 7 murino, num intervalo de 5,56 megabases
compreendido entre os marcadores D7Mit105 e D7Mit304 (Figura 2). Esta região
possui homologia com o cromossomo 10q26 humano.
Análise da região mapeada
Um levantamento sobre o conteúdo genômico do trecho mapeado mostrou que o
mesmo possui 17 marcadores microssatélites (sem polimorfismo entre as linhagens
utilizadas neste trabalho), 33 seqüências marcadas incluindo tanto ESTs quanto STSs,
26 genes de função conhecida e 4 genes preditos ainda sem função, além de 2
pseudogenes. O gene Fgfr2 foi o escolhido como melhor candidato pela alta semelhança
funcional entre o mutante careca e knockouts para o mesmo gene. O gene Fgfr2
(ENSMUST00000068807) está localizado no cromossomo 7 de camundongo na
posição 63.00 cM no mapa genético consenso, delimitada pelo intervalo 124.235.461124.389.428pb. No Ensembl Genome Browser encontra-se 4 transcritos diferentes
advindos deste gene. A comparação das seqüências destes transcritos, bem como dos
mRNAs correspondentes e quantidade de resíduos na proteína predita, mostra um alto
grau de semelhança com relação ao tamanho dos éxons e íntrons (Figura 3), com
exceção do transcrito 84516 que possui dois éxons ausentes. Esta informação nos
43
permitiu desenhar primers que pudessem amplificar o cDNA do segundo maior
transcrito utilizando amostras de RNA extraídas de fígado de animais normais e careca.
QUADRO 1 – Transcritos do gene Fgfr2
Código
ENSMUST00000033138
ENSMUST00000068807
ENSMUST00000084516
ENSMUST00000084517
Éxons
pré-mRNA (Kb)
mRNA (pb)
resíduos na proteína
20
19
17
20
152,7
149,59
148,08
150,2
3360
3969
2124
3103
821
820
707
820
Fonte: Ensembl (www.ensembl.org)
DHPLC
A triagem de mutações no cDNA de Fgfr2 expresso no fígado se deu pela
amplificação, por PCR, de 4 fragmentos sobrepostos, que juntos cobriram
aproximadamente 96% da seqüência total do transcrito (Figura 3). Cada fragmento foi
amplificado a partir do cDNA de animais normais e mutantes da mesma linhagem. Os
amplicons referentes a um mesmo fragmento foram misturados e aplicados na coluna de
eluição com temperatura estimada in silico através de programa computacional. O perfil
cromatográfico referente ao fragmento 3 permitiu a observação de quatro picos (Figura
4). Os dois picos eluídos entre 4 e 5 minutos correspondem aos heterodúplices,
sabendo-se que os hererodúplices são sempre eluídos antes que seus homodúplices
correspondentes (Xiao & Oefner, 2001). O reanelamento de amplicons semelhantes,
mas que não participaram da formação de heterodúplices, geraram os homodúplices
evidenciados por dois picos adjacentes, aos 6 minutos de eluição. Este padrão de eluição
não foi observado para amostras contendo os fragmentos 2 e 4. Não foi possível uma
amplificação satisfatória do fragmento 1, que ficou excluído da análise por DHPLC.
Seqüenciamento de éxons e alinhamento
A análise de DHPLC forneceu um forte indício da existência de uma diferença
de seqüência nucleotídica no trecho do cDNA de Fgfr2 compreendido entre as bases
1400 e 2308. Este fragmento é transcrito da região do gene que contém os éxons 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13 e 14. Por dificuldades técnicas envolvendo o seqüenciamento direto de
44
produtos de PCR desta região do cDNA, partiu-se para o seqüenciamento de cada um
destes éxons separadamente a partir do DNA genômico. Cada um dos 14 éxons foi
seqüenciado pelo menos duas vezes em cada sentido (forward e reverse) para as
linhagens BALB/c, C58BL/6, NZB, A/J e cinco animais careca escolhidos ao acaso na
amostra. Apenas os segmentos pontuados com uma alta qualidade foram utilizados na
comparação. Foi feita uma conferência visual dos cromatogramas nos casos de dúvida
em relação à identidade das bases seqüenciadas, com posterior correção manual das
ambigüidades. As seqüências consenso, obtidas do Projeto Genoma Murino que utilizou
amostras de camundongos C57BL/6, também foram incluídas no alinhamento. Além
disso, também foi verificada a presença de mutação nos sítios consenso de excisão
presentes nas junções íntron-éxon. O exame minucioso dos alinhamentos individuais
dos éxons triados neste trabalho mostrou claramente uma ausência de mutação
candidata perceptível, com exceção do trecho composto das primeiras 15 bases da
extremidade 5´ do éxon 12 aonde não foi possível obter uma seqüência de qualidade
com o par de primers utilizado. É possível que este intervalo carregue a mutação
causadora do fenótipo careca.
O alinhamento também revelou a presença de três polimorfismos de base única
(SNP) presentes na linhagem A/J, ainda não descritos (Figura 5). Dois deles são
mutações silenciosas ocasionadas por transições presentes na última base da trinca que
codifica as treoninas 215 e 220 (C645T e T660C, respectivamente). A terceira é uma
transversão de timina para guanina na décima terceira base da extremidade 5´ do íntron
que separa os éxons 6 e 7. É preciso validar estes SNPs seqüenciando novamente estes
segmentos a partir do DNA de outros animais A/J, utilizando camundongos de
diferentes estoques de modo a excluir a possibilidade de serem polimorfismos presentes
apenas na nossa amostra, fixados por retrocruzamentos e intercruzamentos necessários
para manter esta linhagem isogênica no biotério.
45
Discussão
As mutações de pelagem são muitas e proporcionaram enormes avanços no
entendimento do processo de organogênese epidérmica em mamíferos. Em
camundongos foram descritas mais de 230 mutações afetando vários aspectos da pele e
seus anexos (Nakamura et al, 2001). De ocorrência bem ampla no genoma murino, as
mutações de pelagem estão presentes nos 19 autossomos (6% delas no cromossomo 7) e
no X. Não há registro de mutações desta classe mapeadas no cromossomo Y. Estes
valores sugerem o envolvimento de vários genes numa embriogênese complexa da pele,
possivelmente implicando numa grande diversidade de sinalizadores intracelulares,
receptores e hormônios. A mutação careca confere aos animais uma pelagem defeituosa
e insuficiente, além de outros problemas nos órgãos internos. Os animais carc fazem
parte, portanto, deste grupo, juntamente com os outros mutantes de pelagem já
conhecidos. A mutação careca é de interesse médico pela sua potencialidade em
contribuir numa melhor compreensão do papel funcional das vias envolvidas na
sinalização epidérmica, ainda pouco conhecidas.
Muitas mutações que afetam a pelagem em camundongo e rato foram
seqüenciadas e tiveram como ponto de partida o mapeamento genético através de
análise de ligação utilizando marcadores microssatélites (Jahoda et al, 2004; Peters et
al, 2003). A mutação careca foi mapeada à alta resolução em um intervalo de 5,56 Mb
que contém cerca de 30 possíveis genes candidatos. A inexistência de outros
marcadores microssatélites polimórficos entre as linhagens BALB/c, C57BL/6 e NZB
nas regiões centroméricas e teloméricas de recombinação impossibilitou uma maior
redução do intervalo mapeado. No caso do careca, esta limitação ainda pode ser
superada lançando mão de SNPs presentes na região pela técnica de SSCP (single
strand conformational polymorphism), que evidencia polimorfismos de base única
segregantes entre as linhagens através da conformação diferencial de fitas simples em
gel não-desnaturante. É possível que esta estratégia abrevie ainda mais o trecho
mapeado e permita a exclusão de mais genes do intervalo careca.
A sondagem do gene Fgfr2, avaliado como o melhor candidato da região
mapeada para presença de mutações associadas com o fenótipo careca, se deu pela
triagem inicial de fragmentos do cDNA deste gene através de DHPLC. A técnica de
DHPLC foi escolhida por se mostrar muito superior na detecção de SNPs comparada à
46
outros métodos como seqüenciamento, SSCP e eletroforese de gradiente em gel
desnaturante, podendo detectar alelos presentes na amostra numa freqüência menor que
3% (Wolford et al, 2000). Os gráficos de retenção para o fragmento 3 amplificado do
cDNA mostraram quatro picos característicos para presença de mutação (Figura 4).
Contudo, o seqüenciamento dos éxons e das regiões doadoras e aceptoras de splicing
presentes neste fragmento não permitiu o isolamento de nenhuma variante nucleotídica
na seqüência que pudesse ser considerada uma mutação. O resultado positivo obtido da
análise de DHPLC pode talvez ser explicado pela ocorrência conjunta das isoformas
intermediárias IIIb (que não possui o éxon 9) e IIIc (que não possui o éxon 8) na
amostra amplificada por PCR. Esta coexistência pode ter promovido a hibridação de
fragmentos de comprimentos diferentes na amostra, levando à detecção de quatro picos
no cromatograma. Os cromatogramas obtidos pela análise dos fragmentos 2 e 4
indicaram inexistência de mutação, e o fragmento 1 não pôde ser analisado. No entanto,
os fragmentos 2 e 4 não podem ser integralmente isentos de portarem a mutação careca.
Apesar da técnica de DHPLC ser bem consolidada e render resultados extremamente
confiáveis, a formação de bolhas de mismatch detectáveis por DHPLC nos fragmentos
amplificados pode depender do conteúdo GC das seqüências que flanqueiam a mutação.
Assim, muitas mutações, mesmo que presentes nos éxons, podem passar
desapercebidas. Este fenômeno pode ter mascarado possíveis mutações nos fragmentos
2 e 4. No caso do mutante careca é considerável adotar a medida de seqüenciar
integralmente os éxons de Fgfr2, que ainda permanece como o melhor gene candidato
do intervalo mapeado.
A triagem do gene Fgfr2 em busca da mutação carc se deu primeiramente nos
éxons, já que modificações em íntrons, embora possam induzir a recomposição de
mRNAs intermediários não-funcionais ou criar novos sítios aceptores de splicing, são
extremamente raras (Beier, 2000). Apesar dos resultados pouco conclusivos do
seqüenciamento dos éxons de 6 a 14 presentes no fragmento 3 amplificado do cDNA de
Fgfr2, não se pode excluir a possibilidade da mutação careca ter alterado alguma
seqüência de controle de splicing presente nos íntrons, tal como as seqüências IAS2 e
ISAR, que controlam a recomposição dos transcritos de Fgfr2 (Wagner et al, 2003).
Neste caso o trabalho fica muito mais difícil pois o gene Fgfr2 possui íntrons de até 67
Kb. Além disso, as seqüências de alguns íntrons do gene Fgfr2 ainda não são
conhecidas, e não existe registro de iniciadores para amplificar seqüências internas a
eles.
47
O gene Fgfr2 de camundongos, presente na região mapeada à alta resolução,
permanece como o melhor candidato a abrigar a mutação careca. Cerca de onze
doenças genéticas associadas aos receptores FGFRs são conhecidas em humanos. Uma
melhor compreensão destas patologias foi conseguida através de estudos dos efeitos de
mutações de sentido trocado (missense), inserção de stop códon prematuro (nonsense),
erro de splicing, deleções e inserções no gene FGFR2 humano e em outros da família
FGFR, como FGFR-1 e FGFR-3 (Passos-Bueno et al, 1999). Diferentes doenças
genéticas humanas, como, por exemplo, Síndrome de Crouzon, Síndrome de Apert e
Síndrome de Beare-Stevenson, são causadas por mutações no gene FGFR2, mas
também podem surgir por alterações em outros receptores tais como FGFR1 e FGFR3.
Mutações induzidas no gene Fgfr2 murino levam a fenótipos que mimetizam
anormalidades ósseas no crânio observadas na Síndrome de Apert humana (Chen et al,
2003). Camundongos knockout homozigotos e heterozigotos para genes da família Fgf e
Fgfr, além de mutações espontâneas, vêm permitindo a obtenção de dados moleculares
conclusivos a respeito da complicada interação destes receptores e seus ligantes na
organogênese murina (De Moerlooze et al, 2000). Além de estar envolvido na
diferenciação epidérmica e óssea, o receptor Fgfr2 também está intimamente ligado aos
processos de desenvolvimento embrionário do timo (Revest et al, 2001), ceco (Burns et
al, 2004) e pâncreas (Pulkkinen et al, 2003). A possibilidade da mutação careca ser um
alelo mutante informativo de Fgfr2 permitirá o delineamento de análises moleculares e
funcionais mais direcionadas. É neste sentido que informações extraídas de estudos
envolvendo o alelo mutante carc podem contribuir para a melhor integração da
compreensão do papel dos receptores Fgfr na embriologia murina. Caso a mutação
careca esteja presente em outro gene que não Fgfr2, é razoável, por exemplo, avaliar os
outros genes da região mapeada e selecionar candidatos adicionais a serem
seqüenciados.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Rodrigo Resende pela extração de RNA e RT-PCR,
Alessandro Ferreira e Frederico Malta, do Instituto de Pesquisa Hermes Pardini, pela
ajuda valiosa no DHPLC e Prof. Fabrício Santos pelo suporte no seqüenciamento das
amostras. Esta pesquisa foi financiada pelas agências FAPEMIG e FAPESP.
48
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54
55
56
57
58
59
5 . Conclusões e Perspectivas
É notável que a caracterização de modelos murinos para várias doenças
humanas, além da incorporação de técnicas experimentais estabelecidas e confiáveis,
tenha levado a um progresso rápido no entendimento de como os processos biológicos
presentes no desenvolvimento e metabolismo se processam em mamíferos. A existência
de modelos murinos para a alcaptonúria humana, distrofia muscular de Duchenne,
fenilcetonúria, síndrome de Waardenburg, retinite pigmentosa, síndrome de Marfan,
melanoma familial, ansiedade e depressão, câncer de mama, dentre outros, permitiu
identificar os genes responsáveis por estas enfermidades e relacionar novos alelos aos
fenótipos mutantes, além de abrir as portas para a criação de novas áreas de pesquisa
com interesse biotecnológico, como a farmacogenética. Isolar novas mutações significa,
conseqüentemente, enriquecer um repertório molecular informativo já bem vasto, mas
que mesmo assim carece de elos moleculares de ligação, representados por novos alelos
mutantes.
O primeiro artigo exemplifica a importância de se isolar novas mutações. A ação
mutagênica do ENU é considerada simples em comparação aos efeitos mutagênicos
induzidos por outros compostos. A possibilidade de mutar apenas uma base no DNA
permite que um número muito grande de alterações nucleotídicas simples possam ser
isoladas de determinado gene na forma de alelos alterados. O enfoque de mutagênese
por ENU dirigida a um gene em particular, adotado por muitos laboratórios, mostra um
potencial teórico para vasculhar os efeitos deletérios de mutações em cada base do gene
escolhido. Associado a isso, o efeito de cada alelo pode ser estudado transferindo-o para
backgrounds característicos de inúmeras linhagens isogênicas de camundongo, através
de cruzamentos. Deste modo, milhões de combinações alelo mutante-genoma-ambiente
podem ser estabelecidas.
Os dois trabalhos apresentados nesta dissertação exemplificam e corroboram o
importante papel do camundongo como modelo preferido para investigar o
processamento e controle envolvidos em processos metabólicos de mamíferos. A noção
de que a maquinaria molecular atuante em mamíferos é diversa e complexa pede que
abordagens mais integradas sejam adotadas e que envolvam técnicas analíticas oriundas
60
de áreas características de pesquisa. O projeto de mutagênese por ENU conseguiu isolar
onze mutações com fenótipos interessantes. O mapeamento genético destes mutantes
consistirá no primeiro passo para a clonagem destes genes num futuro próximo. É
necessário e normal que a análise destes mutantes envolva um grande número de
profissionais, dentre eles geneticistas, bioquímicos, morfologistas e patologistas, já que
os fenótipos resultantes das mutações são complexos demais para serem analisados sob
a óptica de uma única especialidade.
O mapeamento genético da mutação careca foi um esforço multidisciplinar que
buscou identificar a alteração molecular basal, causadora do fenótipo alterado. Hoje, o
mapeamento se constitui num processo bem dinâmico e confiável, pois as linhagens
isogênicas se tornaram mais disponíveis, muito mais marcadores genéticos
(microssatélites e SNPs) foram isolados e os dados referentes a eles podem ser
acessados num piscar de olhos através da Internet. A seleção de genes candidatos ainda
se torna um desafio, mesmo em intervalos pequenos. A única informação disponível no
momento da seleção vem de dados funcionais, ou melhor, do papel genético suposto
que é atribuído ao gene em questão, através da análise da disfunção induzida pela ação
do alelo mutado no genoma isogênico da linhagem escolhida. A transferência destes
alelos para outros backgrounds é uma outra forma de avaliar os efeitos das mutações.
O mapeamento genético da mutação careca permitiu a escolha do gene Fgfr2
como primeiro candidato. Apesar das análises de DHPLC indicarem a presença de
alteração nos éxons de 6 a 14, nenhuma mutação pôde ser detectada por
seqüenciamento. Mutações em geral são difíceis de serem encontradas. Genes
considerados maiores, tal como o Fgfr2 que gera um transcrito de 152.7 Kb, necessitam
despender esforços técnicos extras e estratégias específicas na busca destas variantes.
Certamente todos os éxons do gene Fgfr2 serão seqüenciados em busca da mutação
careca, tendo em vista que sua candidatura é muito forte. Mesmo depois de uma
possível mutação ser identificada, o processo final de validação da mutação pede a
restauração do fenótipo normal in vitro ou a produção de novo do mesmo fenótipo em
animais normais através de técnicas de recombinação sítio-específica.
O interesse no camundongo como modelo para doenças humanas é muito forte.
Devido aos excelentes resultados experimentais e biotecnológicos alcançados através de
61
sua utilização, o camundongo vem recebendo atenção especial demonstrada por
esforços maciços na área genômica. Recentemente, o consórcio genômico RIKEN
isolou e caracterizou mais de 21 mil cDNAs murinos (Kawai et al, 2001). Outro grupo
na Califórnia examinou haplótipos completos de SNPs ao longo do genoma de oito
linhagens isogênicas de camundongos (Wiltshire et al, 2003). As valiosas informações
que foram tiradas destes e de outros trabalhos, juntamente com os dados do Projeto
Genoma do Camundongo (Waterston et al, 2002) servem de base para projetos que
necessitam de ancoramento genômico sólido, tal como os projetos de mapeamento
genético. A essência da pesquisa envolvendo camundongos reside no potencial em
extrair informações funcionais genéricas que possam servir de referencial para se tentar
compreender as especificidades biológicas inerentes a cada espécie.
62
6. Agradecimentos
Esta dissertação nunca ficaria completa sem a colaboração de pessoas que são e
sempre continuarão muito importantes na minha carreira profissional. Gostaria de
agradecer a Ana Lúcia por todos estes cinco anos de convivência profissional e pessoal,
pelo carinho, amizade e confiança. À Juju, Lucas, Gustavo, Nantinha, Carolina,
Horácio, Florence, Alessandro e ex-alunos do Laboratório de Genética Animal e
Humana pelos excelentes momentos dentro do laboratório e também fora dele.
Agradeço à Silvia Massironi pelo apoio com o camundongo careca e toda sua prole,
pela paciência e troca de experiências. Ao Fred Malta pelo subsídio técnico no DHPLC
e aos alunos do Laboratório do Prof. Fabrício (Eloísa, Lilia, Dani, Sibele, Paula,
Rodrigo Redondo e Ricardo): aprendi a seqüenciar o DNA com vocês. Ao Rodrigo
Resende da USP pela extração de RNA e RT-PCR. Aos meus queridos colegas e
professores da Pós-Graduação em Genética. E aos meus queridos amigos para sempre:
Juliana, Fabis, Marina, Lucas e Capolo, sem vocês tudo estaria perdido! As experiências
compartilhadas com todos fizeram de mim um melhor aluno e profissional.
Em caráter especialíssimo agradeço a toda minha família pela compreensão e
carinho, e por acreditarem nos meus sonhos. À minha Mãe, por tudo. Ao meu irmão PH,
agora aproveitando os EUA. Ao meu Vovô Gabriel, pelos papos, conselhos e incentivo.
À Tia Cláudia, Anísio, Gabi e Naná. E ao Papai, que tá longe.
Dedico este trabalho a minha Dodóia Miroca, minha maior fã, pelo seu amor
imensurável e por tudo o que ela representou na minha vida. Agora está torcendo por
mim, lá de cima...
63
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Anexo I
Genes identificados na região mapeada carc, através de busca no banco de dados do
Ensembl (www.ensembl.org).
D7Mit105
(116,4)
5,25 Mb
D7Mit332
(121,65)
Inpp5f
inositol polyphosphate-5-phosphatase F
Q8BXY6
Phospholipase homolog
Wdr11
WD repeat domain 11 (citoesqueleto)
Fgfr2
Fibroblast growth factor receptor 2
Ate1
Arginyl-tRNA--protein transferase 1
Tacc1
Transforming acidic coiled coil containing
Plekha1
Pleckstrin homology domain-containing protein family A member 1
Prss11
Serine protease HTRA1 precursor
Dmbt1
deleted in malignant brain tumors 1; crp-ductin; vomeroglandin; muclin
Q8CEQ5
Mus musculus adult male testis cDNA
Cuzd1
CUB and zona pellucida-like domains 1
Q9DAL9
Mus musculus adult male testis cDNA
Zfpn1a5
zinc finger protein, subfamily 1A, 5.
Acadsb
Acyl-CoA dehydrogenase, short/branched chain specific
Hmx3
Homeobox protein HMX3 (Homeobox protein Nkx-5.1).
Hmx2
Homeobox protein HMX2 (Homeobox protein Nkx-5.2).
Gpr26
Probable G protein-coupled receptor GPR26
Cpxm2
Potential carboxypeptidase-like protein X2 precursor
Oat
Ornithine--oxo-acid aminotransferase
Nkx1-2
NK1 transcription factor-related protein 2 (Homeobox protein SAX-1)
Q9D7I5
Mus musculus adult male tongue cDNA
K140_MOUSE
Protein FAM53B
Q99LW3
Hypothetical protein
D7Wsu87e
TRAF-binding protein
Ctbp2
C-terminal binding protein 2 (CtBP2)
Q9D5N9
Mus musculus adult male testis cDNA
Q8BHY4
Mus musculus 13 days embryo heart cDNA
Mmp21
matrix metalloproteinase 21
Uros
Uroporphyrinogen-III synthase
Bccip
BRCA2 and CDKN1A interacting protein
Dhx32
helicase DDX32; DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 32
Fank1
fibronectin type 3 and ankyrin repeat domains 1
69
70