Download Purificacion DNA

Resumen
 DNA total
 DNA de plasmidio
 DNA de fagos
Aislamiento de DNA de bacteria
 Las bacterias se cultivan en medio favorable a
temperatura óptima
 Se lisan las células y se libera el contenido
 Tratamiento del extracto celular para remover todos los
componentes excepto el DNA
 Se concentra la solución de DNA
DNA Purification > Total Cell
Crecimiento de la bacteria
 Crecimiento de medio líquido
 Medio definido
 Medio complejo
 Crecimiento en medio sólido
Monitoreo del crecimiento
Growth can be monitored by optical density
Monitoreo del crecimiento
Growth can be monitored by optical density
Separación de células
 Colecta de células
 Centrifugación
Monitoreo del crecimiento
 Preparación del extracto celular
 Las células deben lisarse para liberar el DNA
 Métodos Físicos
 Fuerza mecánica es aplicada para romper la pared y la
membrana
 Mortero, sonicación
 Métodos Químicos
 Ataque químico a la pared y membrana celular
 Pared- lisozima, EDTA o ambos
 Membrana- detergente (SDS)
Lisis celular
Rompimiento de la pared
 La lisozima digiere los polisacáridos, componentes
estructurales de la pared
 EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza iones de
magnesio esenciales en preservar la estructura de la célula
e inhibe las enzimas que pueden degradar el DNA
Rompimiento de la
membrana
SDS es un
detergente que
remueve las
moléculas de
lípidos
DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell
DNA Purification > Total Cell
Centrifuge removes insoluble cell debris
Purificación del DNA
 Además del DNA, todavía se encuentran una gran
cantidad de proteínas y de RNA
 La remoción de éstas es importante para evitar
interferencia en el análisis
Remoción de proteínas y RNA
 Extracción orgánica
 Adición de fenol ó fenol/cloroformo
 Se precipitan las proteínas; formación de una capa blanca en
la interfase entre la capa orgánica y la acuosa
 Se remueve la solución acuosa
DNA Purification > Total Cell > Purification
Organic Extraction
Extracción orgánica
 ¿Qué tal si hay un exceso de proteínas?
 Se repiten las extracciones con fenol
 No favorable; destrucción del DNA con el movimiento
 Rompimiento con proteasa antes de la extracción
 Pronasa o proteinasa K
Extracción orgánica
 Parte del mRNA es removido con el tratamiento a fenol.
 El remanente del RNA puede ser digerido con
ribonucleasas (si es necesario).
DNA Purification > Total Cell
Concentration of DNA
Extracción por Silica
 Guanidium thiocyanate
 Desnaturaliza el material que no es DNA
 Hace que el DNA se enlace a las partículas de silica
 Se añade silica directamente o la muestra se pasa por una
columna de silica
 Remoción de DNA al añadir agua
DNA Purification > Total Cell > Purification
Purificación de DNA con
partículas de silica
Extracción de DNA de otros tipos
de células
 Células vegetales: alto contenido de carbohidratos
 Lisozima no tienen efecto
 Se añade CTAB (cetylmethylammonium); se une a los ácidos
nucléicos y los precipita
 Se centrifuga y se remueve el sobrenadante
 Células animales: no tienen pared, lisan con SDS
DNA Purification > Total Cell
Purification of Plant DNA
DNA de plasmidio
 Se crece la bacteria y se colecta
 Se rompen las células y se libera el contenido
 Se trata el extracto celular para remover todos los
componentes excepto el DNA de plasmidio
 Se concentra la solución de DNA
DNA de plasmidio
 Separación basada en diferencias entre el plasmidio y el
DNA bacterial
 tamaño- plasmidios son mucho más pequeños
Separación por tamaño
 En orden de maximar las diferencias, rompimiento
mínimo del DNA bacterial
 Cuando el rompimiento es mínimo, el DNA formará parte
del debris celular
 Rompimiento mínimo se logra utilizando técnicas de
rompimiento suave
Rompimiento suave de la célula
 Tratamiento con lisozima y EDTA en presencia de sucrosa
evita el rompimiento inmediato
 Al formar esferoplastos, la célula puede lizarse con la
adición de detergentes no-íonicos
DNA Purification > Plasmid DNA
Separación basado en
conformación
 Separación por el ¨superenrollamiento¨de pequeños
plasmidios circulares
Separación basada en
conformación
 Rango de pH más estrecho cuando el DNA
¨superenrrollado¨es desnaturalizado y el DNA regular no.
 Se usa un lisado claro
 Al añadir base; DNA regular es desnaturalizado
 Al añadir ácido; DNA regular es una masa ¨enredada¨
 El DNA ¨enredado¨es ¨pellet¨
DNA Purification > Plasmid DNA
Separación basado en
conformación
 DNA ¨superenrrollado¨
también puede ser
separado del DNA
regular utilizando
bromuro de etidio en
asociación con un
gradiente de densidad
con cloruro de cesio
(CsCl)
Separación basado en
conformación
 Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, pero sólo en
cantidad limitada a DNA ¨superenrrollado¨
 Este enlazamiento causa un movimiento en la banda de
DNA ¨normal¨
DNA Purification > Plasmid DNA
DNA Purification > Plasmid DNA
DNA de fagos
 El DNA de fagos puede estar fuera de la célula; no hay que
comenzar con un extracto celular
 Al centrifugar el cultivo, la bacteria estará en el pellet y el
fago en suspensión
 La dificultad es obtener una concentración grande de
fagos por ml de cultivo
Para obtener títulos altos
 El fago debe estar en fase lítica
 Los fagos deben infectar la baceria al m omento justo en el
ciclo de crecimiento
Purificación de DNA fagos
 Los fagos pueden ser precipitados con glicol de polietileno
(PEG)
 Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver.
 Purificar por gradiente de densidad de CsCl.
www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web
S572,FL06,MPurifyDNA.pdf