Survey
* Your assessment is very important for improving the workof artificial intelligence, which forms the content of this project
* Your assessment is very important for improving the workof artificial intelligence, which forms the content of this project
KJB220 Oversikt over oppgaven Forsøk 1 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 2 Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1 Forsøk 3 Test av celletype- spesifikk mRNA c-myb Real-time PCR Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs KJB220 Ulike mønstre av mRNA uttrykk Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering Referanse Ukjent KJB220 The quantitative assay - step by step 1 2 3 4 5 6 7 8 Primer design RNA isolation cDNA synthesis Set up of the experiment Programming and running the LightCycler Optimizing the PCR reaction Interpretation of the results Troubleshooting KJB220 Stage 1: Primer design 1 2 3 4 5 6 7 8 Length: 18-24 bp Try to make the two primers equal in length GC content: Between 40% and 60% with equal GC content in both primers Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains Sequence: 3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences, palindromes, and highly degenerate sequences Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C Melting temperatures Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded. Depends on primer sequence and buffer composition Tm between 55-65oC, primers used together should have similar Tm value KJB220 2. step: RNA isolation Several methods 1 GTC metoden 2 Trizol metoden Ulike kommersielle kit 3 4 5 Kits for cultured cells 6 5 x 106 cells/prep, 7 expected yield: 10-20 ug/ 106 cells 8 KJB220 Arbeid med RNA er krevende pga RNA lett degraderes 1 2 3 4 5 6 7 8 RNA er et labilt molekyl som lett degraderes Pga 2´-OH som deltar i degraderingsmekanismen Pga RNAser som finnes overalt (fingre etc) og som er svært robuste enzymer (noen tåler koking). RNA er derfor langt mer ustabilt enn DNA I cellene er mRNA beskyttet dels med ende-modifikasjoner, dels via assosiasjon med protein Arbeid med RNA krever derfor særlig forsiktighet Pre-mRNA (hnRNA) AAAAAAAAAAAAA cap mRNA KJB220 Tiltak for å unngå RNA degradering Unngå RNaser (allestedsnærværende) 1 Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er) Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate) 2 Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter) 3 Elektroforesekar behandles med H2O2 4 Glass og metall varmebehandles: 180 oC minst 8 timer 5 Bruk RNase inhibitorer DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens 6 Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må 7 fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein 8 isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser (kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc) KJB220 Inhibitorer av Rnaser - DEPC 1 2 3 4 5 6 7 8 DEPC (diethylpyrocarbonate) DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser i O buffere og på glassutstyr. C-CH2-CH3 Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl O DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor C-CH -CH 2 3 ikke brukes under isolering. O Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og omdannes til CO2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med Tris. Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time 37oC) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og autoklavering KJB220 Hvordan isolerer vi RNA? Kit for RNA isolering The Absolutely RNATM RT-PCR miniprep kit Prinsipp Celler lyseres i nærvær av guanidin thiocyanat, en av de sterkeste kjente protein denaturanter, som inaktiverer Rnaser Pre-filter spin fjerner partikler og noe DNA RNA blir absorbert til en silika-basert fiber-matriks i nærvær av høye konsentrasjoner chaotropiske salter (mens kontaminanter vaskes ut). KJB220 Hvordan isolerer vi RNA? Prinsipp forts. Vask med lav-salt buffer Rester av DNA fjernes med DNase behandling Videre vask fjerner protein og rester av DNase Høy-renset RNA isoleres i et lite volum ved eluering med en buffer med lav ionestyrke og samles opp i mikrosentrifuge-røret Renset RNA Har lavere DNA-innhold enn mange metoder Er derfor velegnet for RT-PCR og real-time PCR analyser KJB220 3. step: cDNA synthesis Omdanning av mRNA til cDNA 1 2 3 4 cap 5 6 7 8 AAAAAAAAAAAAA 5´ 3´ mRNA oligo dT 3´ RT: Reverse transcriptase Ulike kommersielle RT-enzymer Omniscript RT-kit (Qiagen) Kit from Roche: Master RNA Cybergreen Superscript (Life Technol.) mRNA mRNA cDNA Templat for Real-time PCR 5´ KJB220 Reaction mix for the LightCycler 1 2 3 4 5 6 7 8 Template DNA Primers 0.3-1.0 uM of each primer MgCl2 cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50 1-5 mM Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA Polymerase Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I KJB220 Samples to run 1 2 A series of dilutions are made to construct a standard curve for target gene 3 Using a subclone of the target 4 5 Sample (cDNA) with primers for target gene In the form of cDNA made from the isolated RNA 6 Sample (cDNA) with primers for 7 housekeeping genes for normalization 8 purposes KJB220 Standard curve 1 2 3 4 5 6 7 8 Use at least 3 concentrations for a standard curve Use serial dilutions that are one order of magnitude apart _ 1:10, 1:100, 1:1000,... For medium and high concentrations, a single point per concentration is sufficient KJB220 Programming the Lightcycler 1 2 3 4 5 6 7 8 KJB220 Programming the Lightcycler 1 Preincubation 2 Denaturation 3 Amplification 4 Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec), cycle number (may be increased during run) 5 6 Melting curve Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp 7 8 Cooling Edit samples KJB220 Optimization - an important step 1 2 Finding optimal MgCl2 Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity 3 and slope 4 Annealing temperature? 5 Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of annealing temp 6 7 Controls - positive and negative Always include a NTC (non template control, here water) to see 8 primer-dimers Also include a positive control to see that the reaction works KJB220 Optimizing PCR conditions 1 Template dilution Use dilution that gives crossing points in the 20-30 range 2 3 Programming Annealing temp, elongation time 4 5 6 Improve your primer design? If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long 7 optimalization experiments) 8 KJB220 Interpretation of the results 1 2 3 4 5 6 7 8 Quantification by one or several standard curves Ratio: target gene/housekeeping gene in each sample Assumption: housekeeping gene expression = constant in the samples Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed housekeeping genes Jurkat/Myb Jurkat/PP1 = 2.351 HeLa/Myb HeLa/PP1 = 0.107 KJB220 Interpretations of the results 1 2 3 4 Evaluation Parameters Error < 1 r = -1.00 Slope E = 10 -1/slope E = 10 -1/-3.407 = 1.97 5 Melting curve analysis Primer dimers 6 Expected melting point 7 Calculations 8 Jurkat/Myb Jurkat/PP1 = 2.351 22 fold HeLa/Myb HeLa/PP1 = 0.107 KJB220 Troubleshooting: Problem 1: primer dimers 1 2 3 4 5 6 7 8 Primer-dimers interferes with quantitation LC with SYBR-green measures all DNA produced Primer-dimer is a template-independent product that also produces fluorescence Identifying primer-dimers: melting curve analysis Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers melt at relatively low temperatures and have broader peak KJB220 How to avoid primer/dimers? 1 2 3 4 5 6 7 8 General approaches Reduce delays in workflow Optimize primers - may be more important with LC than in conventional PCR Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec. Use hot start inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat exposure LC-specific approaches Increase the temperature for fluorescence registration Use of hybridization probes rather than SYBR-green Reduce number of cycles, e.g. to 40. KJB220 Problem 2: RNA contaminated with genomic DNA 1 2 3 4 5 6 7 8 Identify by running ± reverse transcriptase, compare Cps Traces of genomic DNA will work as templates interfering with quantitation, may reduce reproducibility KJB220 How to avoid problems with genomic DNA? 1 2 3 4 5 6 7 8 Always include a DNase I purification step in the RNA isolation procedure Included in the kit used here Always run a ±reverse transcriptase reaction to check the quality of the RNA Used as the first experiment here KJB220 Mandag Forsøk 1 •±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 •Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) RNA isolering • PP1 RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 •Test av celletype- spesifikk mRNA Real-time PCR •c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs KJB220 Forsøk 1 •±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 •Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) • PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Real-time PCR Tirsdag Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs Forsøk 3 •Test av celletype- spesifikk mRNA •c-myb KJB220 Ulike mønstre av mRNA uttrykk Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering Referanse Ukjent KJB220 Criteria for single standard curve Equal Efficiency Required for Accurate Analysis Prerequisite: EfficiencyStandard = EfficiencyTarget Efficiency depends on: - fragment length - advantage with short PCR-products (100-200 bp) - intervening sequence - spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene KJB220 Prerequisites of a suitable housekeeping gene RNA-specific detection No regulation of expression level in the system analysed pseudogene free amplification / detection specific for active target normal vs. tumor tissue unstimulated vs. stimulated cells Similar expression level compared to the target analysed KJB220 Housekeeping Genes Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g. ß-actin : hormones of tyroid gland : stomach tumor 5.8S,18S, 28S RNA ß2-microglobulin multigene family; > 20 genes; 1 active locus 20 pseudogenes multigene family; pseudogenes multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse mostly pseudogenes pseudogenes no pseudogenes G6PDH no pseudogenes PBGD aldolase HPRT U3, U8, ... ornithin decarboxylase ... no pseudogenes pseudogenes pseudogenes Pseudogenes g-actin GAPDH : lung, pancreatic, colon cancer : insulin, EGF : Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors : tumors