Download Jurkat celler

KJB220
Oversikt over oppgaven
Forsøk 1
±RT for å sjekke
kvaliteten av RNA
Jurkat celler
(T-lymfocytter)
HL60 celler
(Myeloide celler)
HeLa celler
(Cervix celler)
RNA isolering
RT: cDNA-syntese med revers transkriptase
Forsøk 2
Test av referanse-mRNA
(husholdningsgen)
PP1
Forsøk 3
Test av celletype- spesifikk
mRNA
c-myb
Real-time
PCR
Lightcycler
Kvantitering av spesifikke mRNAs
KJB220
Ulike mønstre av mRNA uttrykk

Ulike celler uttrykker
et spektrum av mRNA



Noen er de samme i alle celler og
blir uttrykt i rimelig like mengder
overalt (husholdningsgener)
Andre er spesifikke for noen få
celletyper og bidrar til disse
cellenes særlige egenskaper
(celletypespesifikke gener).
I real-time kvantitering
av mRNA brukes de
første som referanse
mRNA
mRNA
cDNA
cDNA
Kvantitering
Referanse
Ukjent
KJB220
The quantitative assay
- step by step
1
2
3

4
5
6
7

8






Primer design
RNA isolation
cDNA synthesis
Set up of the experiment
Programming and running the LightCycler
Optimizing the PCR reaction
Interpretation of the results
Troubleshooting
KJB220
Stage 1: Primer design
1
2
3
4
5
6
7
8

Length: 18-24 bp


Try to make the two primers equal in length
GC content:
Between 40% and 60% with equal GC content in both primers
 Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains


Sequence:
3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences,
palindromes, and highly degenerate sequences
 Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C


Melting temperatures
Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded.
 Depends on primer sequence and buffer composition
 Tm between 55-65oC, primers used together should have similar Tm value

KJB220
2. step: RNA isolation

Several methods
1
 GTC metoden
2
 Trizol metoden
 Ulike kommersielle kit
3
4
5
 Kits for cultured cells
6
 5 x 106 cells/prep,
7
 expected yield: 10-20 ug/ 106
cells
8
KJB220
Arbeid med RNA er krevende
pga RNA lett degraderes
1
2
3
4
5
6
7
8

RNA er et labilt molekyl
som lett degraderes





Pga 2´-OH som deltar i degraderingsmekanismen
Pga RNAser som finnes overalt
(fingre etc) og som er svært robuste
enzymer (noen tåler koking).
RNA er derfor langt mer ustabilt enn
DNA
I cellene er mRNA beskyttet dels med
ende-modifikasjoner, dels via
assosiasjon med protein
Arbeid med RNA krever
derfor særlig forsiktighet
Pre-mRNA
(hnRNA)
AAAAAAAAAAAAA
cap
mRNA
KJB220
Tiltak for å unngå RNA degradering

Unngå RNaser (allestedsnærværende)
1
 Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er)
 Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate)
2
 Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter)
3
 Elektroforesekar behandles med H2O2
4
 Glass og metall varmebehandles: 180 oC minst 8 timer
5  Bruk RNase inhibitorer
 DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens
6
 Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må
7
fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser
 Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein
8
isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser
(kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc)
KJB220
Inhibitorer av Rnaser - DEPC
1
2
3
4
5
6
7
8

DEPC (diethylpyrocarbonate)





DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser i O
buffere og på glassutstyr.
C-CH2-CH3
Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl
O
DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor C-CH -CH
2
3
ikke brukes under isolering.
O
Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og
omdannes til CO2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med
Tris.
Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time
37oC) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og
autoklavering
KJB220
Hvordan isolerer
vi RNA?

Kit for RNA isolering


The Absolutely RNATM RT-PCR
miniprep kit
Prinsipp
Celler lyseres i nærvær av guanidin
thiocyanat, en av de sterkeste kjente
protein denaturanter, som inaktiverer
Rnaser
 Pre-filter spin fjerner partikler og noe
DNA
 RNA blir absorbert til en silika-basert
fiber-matriks i nærvær av høye
konsentrasjoner chaotropiske salter
(mens kontaminanter vaskes ut).

KJB220
Hvordan isolerer vi RNA?

Prinsipp forts.





Vask med lav-salt buffer
Rester av DNA fjernes med DNase
behandling
Videre vask fjerner protein og rester
av DNase
Høy-renset RNA isoleres i et lite
volum ved eluering med en buffer
med lav ionestyrke og samles opp i
mikrosentrifuge-røret
Renset RNA
Har lavere DNA-innhold enn mange
metoder
 Er derfor velegnet for RT-PCR og
real-time PCR analyser

KJB220
3. step: cDNA synthesis
Omdanning av mRNA til cDNA
1
2
3
4
cap
5
6
7
8

AAAAAAAAAAAAA
5´
3´
mRNA
oligo dT
3´
RT: Reverse transcriptase
Ulike kommersielle
RT-enzymer
Omniscript RT-kit (Qiagen)
 Kit from Roche: Master RNA
Cybergreen
 Superscript (Life Technol.)
mRNA
mRNA

cDNA
Templat for
Real-time PCR
5´
KJB220
Reaction mix for the LightCycler
1
2
3
4
5
6
7
8

Template DNA


Primers


0.3-1.0 uM of each primer
MgCl2


cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50
1-5 mM
Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA
Polymerase

Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I
KJB220
Samples to run
1
2  A series of dilutions are made to construct a
standard curve for target gene
3
 Using a subclone of the target
4
5  Sample (cDNA) with primers for target gene
 In the form of cDNA made from the isolated RNA
6
 Sample (cDNA) with primers for
7
housekeeping genes for normalization
8
purposes
KJB220
Standard curve
1

2
3
4

5
6
7
8

Use at least 3 concentrations for a standard
curve
Use serial dilutions that are one order of
magnitude apart
_ 1:10, 1:100, 1:1000,...
For medium and high concentrations, a
single point per concentration is sufficient
KJB220
Programming the Lightcycler
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Programming the Lightcycler
1  Preincubation
2  Denaturation
3  Amplification
4
 Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec),
cycle number (may be increased during run)
5
6  Melting curve
 Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp
7
8  Cooling

Edit samples
KJB220
Optimization - an important step
1
2  Finding optimal MgCl2
 Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity
3
and slope
4

Annealing temperature?
5
 Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of
annealing temp
6
7  Controls - positive and negative
 Always include a NTC (non template control, here water) to see
8

primer-dimers
Also include a positive control to see that the reaction works
KJB220
Optimizing PCR conditions
1  Template dilution
 Use dilution that gives crossing points in the 20-30 range
2
3  Programming
 Annealing temp, elongation time
4
5
6  Improve your primer design?
 If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long
7
optimalization experiments)
8
KJB220
Interpretation of the results
1

2
3
4

5
6
7
8
Quantification by one or several
standard curves
Ratio: target gene/housekeeping gene in
each sample


Assumption: housekeeping gene expression = constant in the
samples
Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed
housekeeping genes
Jurkat/Myb
Jurkat/PP1
= 2.351
HeLa/Myb
HeLa/PP1
= 0.107
KJB220
Interpretations of the results
1
2
3
4

Evaluation Parameters



Error < 1
r = -1.00
Slope
E = 10 -1/slope
E = 10 -1/-3.407
= 1.97
5  Melting curve analysis
 Primer dimers
6
 Expected melting point
7
 Calculations
8
Jurkat/Myb
Jurkat/PP1
= 2.351
22 fold
HeLa/Myb
HeLa/PP1
= 0.107
KJB220
Troubleshooting:
Problem 1: primer dimers
1
2
3
4
5
6
7
8

Primer-dimers interferes with
quantitation



LC with SYBR-green measures all DNA produced
Primer-dimer is a template-independent product that also
produces fluorescence
Identifying primer-dimers: melting
curve analysis

Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply
defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers
melt at relatively low temperatures and have broader peak
KJB220
How to avoid primer/dimers?
1


2
3
4
5
6
7
8
General approaches



Reduce delays in workflow
Optimize primers - may be more important with LC than in conventional
PCR
Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec.
Use hot start


inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat
exposure
LC-specific approaches
Increase the temperature for fluorescence registration
 Use of hybridization probes rather than SYBR-green
 Reduce number of cycles, e.g. to 40.

KJB220
Problem 2: RNA contaminated with
genomic DNA
1

2
3
4

5
6
7
8
Identify by running ± reverse transcriptase,
compare Cps
Traces of genomic DNA will work as
templates interfering with quantitation, may
reduce reproducibility
KJB220
How to avoid problems with
genomic DNA?
1
2
3
4
5
6
7
8

Always include a DNase I purification step
in the RNA isolation procedure


Included in the kit used here
Always run a ±reverse transcriptase
reaction to check the quality of the RNA

Used as the first experiment here
KJB220
Mandag
Forsøk 1
•±RT for å sjekke
kvaliteten av RNA
Jurkat celler
(T-lymfocytter)
HL60 celler
(Myeloide celler)
HeLa celler
(Cervix celler)
Forsøk 2
•Test av referanse-mRNA
(husholdningsgen)
RNA isolering
• PP1
RT: cDNA-syntese med revers transkriptase
Forsøk 3
•Test av celletype- spesifikk
mRNA
Real-time
PCR
•c-myb
Lightcycler
Kvantitering av spesifikke mRNAs
KJB220
Forsøk 1
•±RT for å sjekke
kvaliteten av RNA
Jurkat celler
(T-lymfocytter)
HL60 celler
(Myeloide celler)
HeLa celler
(Cervix celler)
Forsøk 2
•Test av referanse-mRNA
(husholdningsgen)
• PP1
RNA isolering
RT: cDNA-syntese med revers transkriptase
Real-time
PCR
Tirsdag
Lightcycler
Kvantitering av spesifikke mRNAs
Forsøk 3
•Test av celletype- spesifikk
mRNA
•c-myb
KJB220
Ulike mønstre av mRNA uttrykk

Ulike celler uttrykker
et spektrum av mRNA



Noen er de samme i alle celler og
blir uttrykt i rimelig like mengder
overalt (husholdningsgener)
Andre er spesifikke for noen få
celletyper og bidrar til disse
cellenes særlige egenskaper
(celletypespesifikke gener).
I real-time kvantitering
av mRNA brukes de
første som referanse
mRNA
mRNA
cDNA
cDNA
Kvantitering
Referanse
Ukjent
KJB220
Criteria for single standard curve
Equal Efficiency Required for Accurate Analysis
Prerequisite:
EfficiencyStandard = EfficiencyTarget
Efficiency depends on:
- fragment length - advantage with short PCR-products (100-200 bp)
- intervening sequence


- spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene
KJB220
Prerequisites of a suitable
housekeeping gene

RNA-specific detection



No regulation of expression level in the
system analysed



pseudogene free
amplification / detection specific for active target
normal vs. tumor tissue
unstimulated vs. stimulated cells
Similar expression level compared to the
target analysed
KJB220
Housekeeping Genes
Gene
Genomic structure / pseudogenes
Regulation e.g.
ß-actin
: hormones of tyroid gland
: stomach tumor
5.8S,18S, 28S RNA
ß2-microglobulin
multigene family; > 20 genes; 1 active locus
20 pseudogenes
multigene family; pseudogenes
multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse
mostly pseudogenes
pseudogenes
no pseudogenes
G6PDH
no pseudogenes
PBGD
aldolase
HPRT
U3, U8, ...
ornithin
decarboxylase
...
no pseudogenes
pseudogenes
pseudogenes
Pseudogenes
g-actin
GAPDH
: lung, pancreatic, colon cancer
: insulin, EGF
: Non-Hodgkin lymhoma
abnormal expression in tumors
: kidney, stomach tumor
: hormones, oxidant stress,
growth factors
: tumors