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Genetica del cancro
Lezione 12
By NA
1
Il tumore come network
Carcinoma del colon
Le cellule mutate
iniziano a duplicarsi in
modo incontrollato
Displasia. Le
cellule perdono
morfologia
Cancro invasivo
Le cellule
divengono
invasive e
metastatizzano
Processo di vascolarizzazione
Iperplasia Le
cellule
conservano
morfologia
Cancro in situ
Le cellule
perdono il
contatto con il
tessuto
Esempio di progressione a tappe da tumore benigno a tumore maligno
By NA
2
Un punto di vista diverso
La selezione agisce attraverso la fitness di un gruppo di individui: chi
si riproduce di piu’ per effetto di mutazioni favorevoli in quel
momento e in quel luogo prendera’ il sopravvento
trasferiamo questo concetto ad un gruppo di cellule : una cellula muta,
acquisisce un vantaggio proliferativo sfuggendo anche parzialmente al
sistema di controllo, si riprodurra’ piu’ rapidamente
la cellula nell’organismo e’ sottoposta ad un controllo a molti livelli e
difficilmente potra’ in breve tempo prendere il sopravvento…… almeno
finche’ i sistemi di controllo sono efficienti
By NA
3
Due forze contrastanti
Una spinge la cellula mutata a prendere il sopravvento e l’altra protegge
l’organismo nel suo insieme (apoptosi, meccanismi di riparo)
questo fa si che almeno fino al momento in cui un organismo si riproduce
il numero di mutazioni somatiche che si accumulano nella cellula non
raggiungano il livello di guardia: si pensa 6-7 (con le dovute eccezioni), e
soprattutto con la nuova generazione si rincomincia.
con il tempo i meccanismi di controllo si attenuano e vengono meno………
By NA
4
e allora come mai il cancro?
se la possibilita’ di accumulare in una cellula o in un suo clone e’ bassa
come mai ci sono i tumori cosidetti maligni?
sostanzialmente ci sono due meccanismi che permettono la progessione:
 mutazioni che aumentano la capacita’ proliferativa incrementando il
numero di “individui” in cui potrebee manifestarsi una seconda, terza ……
mutazione
 mutazioni che intaccano la stabilita’ del genoma aumentando il livello
di mutazioni nel loro insieme
By NA
5
riarrangiamenti multipli
By NA
6
riarrangiamenti multipli
By NA
7
percorsi che portano alla cancerogenesi
possiamo ridurre a due i percorsi che sviando, portano al tumore:
percorsi che controllano la nascita di nuove cellule (geni del ciclo
cellulare) e percorsi che portano alla morte (geni che controllano
l’apoptosi)
al primo percorso appartengono quei geni (protoncogeni) che nella forma
wt promuovono la proliferazione. Quando l’effetto della mutazione provoca
un ”gain of function” il risultato e’ un prodotto inappropriato nella sua
attivita’ o nello spazio o nel tempo.Vista la loro funzione wt basta la
mutazione di un allele
vi ricordo che non e’ la mutazione in se’, ma l’effetto che la mutazione ha
sulla funzione. il cancro e’ un fenotipo come gli altri, viene meno una
funzione dell’individuo cellula.
By NA
8
percorsi che portano alla cancerogenesi
al secondo appartengono quei geni che nella versione wt impediscono la
progressione del ciclo cellulare (definiti TS tumor suppressor), stimolano
l’apoptosi , controllano la stabilita’ del genoma, garantiscono l’accuratezza
della replicazione, del riparo e della segregazione. Il fenotipo mutante
compare quando tutti e due gli alleli sono mutati nella stessa cellula.
Il nostro organismo e’ come un auto in cui i protooncogeni
sono l’accelleratore e i TS i freni.
By NA
9
Oncogeni
Era noto che alcuni tumori animali originassero da infezioni virali, questa informazione
derivava da esperimenti in vivo ed in vitro. Nell’uomo sono pochi quelli dimostrati ad
eziologia esogena
By NA
10
Oncogeni
Quello che ci interessa e’ che geni portati da virus possono trasformre le cellule
ospite. lo studio di questi geni ha permesso di capire cosa sono gli oncogeni. Test in
vitro come il NIH-3T3 hanno permesso di chiarire che in tumori di origine non virale
sono presenti oncogeni endogeni attivati
By NA
11
Oncogeni
Il primo oncogene virale identificato (1983) e’ stato v-sis che corrisponde al gene
PDGFB fattore di crescita delle piastrine. La sua espressione incontrollata e’
concordante con l’idea che l’eccesso di un grow factor porti ad un’iperproliferazione.
L’analisi di altri oncogeni ha confermato che la loro funzione e’ indispensabile per la
cellula e che la loro alterata espressione e’ all’origine dei tumori.
Grossolanamente possiamo suddividere gli oncogeni in 5 classi:
 fattori di crescita secreti
 recettori di membrana
 componenti dei sistemi di trasduzione del segnale intracellulare
 proteine DNA-binding compresi i fattori di trascrizione
 componenti del network delle cicline, delle chinasi-ciclino dipendenti e degli
inibitori delle kinasi. Tutti componenti che controllano il normale svolgimento del ciclo
cellulare
By NA
12
Oncogeni
Viral and cellular oncogenes
Viral diseas e
v-onc c-onc Location
Function
Simian sarcoma
v-sis
PDGF B 22q13. 1
Platelet-derived growth factor B subuni t
Chicken erythroleukemia
v-erbb
EGF R 7p13-q22
Epidermal growth factor recep t o r
McDonough feline
sarcom a
v-fm s CSF1R 5 q 3 3
Macrophage colony-stimulating factor
receptor
Harvey rat sarcom a
v-ras H R A S 1 11p 15
Component of G-protein signal transductio n
Abelson mouse leukemi a
v-abl
ABL
9q34. 1
Protein tyrosine kin a s e
Avian sarcoma 17
v-jun
JUN
1p32-p31
AP-1 transcription factor
Avian myelocytomatosis
v-m yc MYC
8q24. 1
DNA-binding protein (transcription factor;
see
Rabbitts, 1994)
Mouse osteosarcom a
By NA
v-fos
FOS
14q24.3q31
DNA-binding transcription fac t o r
13
Attivazione protoncogeni
Un protoncogene diventa oncogene quando la mutazione provoca un aumento di funzione
che puo’ essere :
 quantitativo di un prodotto normale
 qualitativo: prodotto leggermente mutato che non puo’ rispondere al suo
controllore, prodotto chimerico originato da un riarrangiamento genomico
Le mutazioni sono sempre somatiche, ci sono alcune eccezioni, ma la predisposizione
alla comparsa di tumori e’ un aspetto di sindromi polimalformative a trasmissione
auosomica dominante (RAS)
Anche il protoncogene RET e’ particolare: le sue mutazioni con attivazione provocano la
MEN2A neoplasia delle ghiandole endocrine che si puo’ presentare come familiare. Si
ritiene che questo comportamento derivi dalla ristrettezza dell’espressione del
prodotto mutato di RET nello spazio e nel tempo. Da notare che mutazioni con perdita
di funzione di questo gene provocano una sindrome neonatale:Morbo di Hirschprung.
Anche il protoncogene KIT mutato con perdita di funzione provoca una sindrome
familiare
con depigmentazione il piebaldismo.
14
By NA
Attivazione protoncogeni
Amplificazione genica
conseguenza di errori casuali nella replicazione del DNA
Esempio: cromosomi double minutes e homogeneously staining regions (HSR)
double minutes
By NA
15
Attivazione protoncogeni
Mutazione puntiforme
Esempio: nel carcinoma della vescica, il gene ras
presenta una mutazione nella sostituzione di una singola
base che, a sua volta, provoca la sostituzione di un
amminoacido. Tali cambiamenti avvengono in punti
caratteristici del gene che conducono a trasformazione
cellulare
By NA
16
Attivazione protoncogeni
Riarrangiamento cromosomico:linfoma di Burkitt t(8;14)
traslocazione
c-myc
gene catena
pesante Ig
 c-myc si viene a trovare sotto il controllo del promotore del Ig
che e’ un promotore forte e nella serie bianca funziona ad un ritmo
elevato: il proto-oncogene perde la propria regolazione e assume quella del
Ig. La cellula perde il controllo
 QUESTO AVVIENE SOLO SE LA TRASLOCAZIONE SI VERIFICA
NEI LINFOCITI!
By NA
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Attivazione protoncogeni
Nel 95% dei casi di CML
ABL
ABL/BCR
BCR
BCR/ABL
cromosoma non normale
chr Philadelphia (1961)
Indagini FISH E MOLECOLARI
Traslocazione reciproca braccio lungo
chr.9 e il braccio lungo chr.22:
t(9;22)(q34;q11).
CML, Leucemia Mieloide Cronica
SI FORMANO DUE GENI DI FUSIONE:
- ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta)
- BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone
cellulare)
By NA
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Attivazione protoncogeni
By NA
19
Attivazione protoncogeni
Chimeric genes produced by cancer-specific chromosomal rearrangements
Tumor
Rearrangemen t
Chimeric gen e
CML
t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL
Tyrosine kina s e
Ewing sarcoma
t(11;22)(q24;q12) EWS-FL I 1
Transcription factor
Ewing sarcoma (varian t )
t(21;22)(q22;q12) EWS-E R G
Transcription factor
Malignant melanoma of soft
parts
t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF 1
Transcription factor
Desmoplastic small round
cell tumo r
t(11;22)(p13;q12) EWS-WT 1
Transcription factor
Liposarcom a
t(12;16)(q13;p11) FUS-CHOP
Transcription factor
AML
t(16;21)(p11;q22) FUS-E R G
Transcription factor
Papillary thyroid carcinom a
inv(1)(q21;q31)
Pre-B cell ALL
t(1;19)(q23;p13. 3 ) E2A-PBX 1
Transcription factor
ALL
t(X;11)(q13;q 2 3 ) MLL-AFX 1
Transcription factor
ALL
T(4;11)(q21;q 2 3 ) MLL-AF4
Transcription factor
ALL
t(9;11)(q21;q23) MLL-AF9
Transcription factor
ALL
t(11;19)(q23;p13) MLL-ENL
Transcription factor
Acute promyelocytic
leukem i a
t(15;17)(q22;q12) PML-RARA
Transcription factor+retinoic
acid receptor
NTRK1-TPM3(TRK
oncogen e )
Alveolar rhabdomyosarcom a t(2;13)(q35;q14) PAX3-FKHR
Nature of chimeric produc t
Tyrosine kina s e
Transcription factor
Note how the same gene may be involved in several different rearrangements. For further details see
Rabbitts (1994). CML, chronic myeloid leukemia; ALL, acute lymphoblastoid leukemia.
By NA
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Modalita’ di espressione
Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche?
Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi
gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse)
Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della
cellula non dell’individuo!
Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismo
ci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno
un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l’allele
wild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore
Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile
alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne
pregiudica la funzione.
By NA
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Oncosoppressori gatekeepers
Questi oncosoppressori vengono definiti “gatekeepers”:
(guardiani) perche’ regolano funzioni cellulari fondamentali
come l’innesco della proliferazione, del differenziamento e
dell’apoptosi. La conoscenza del loro meccanismo di azione ha
introdotto il concetto di APLOINSUFFICENZA.
APLOINSUFFICENZA: condizione in cui la mancata
funzionalita’ di un allele non provoca la comparsa del fenotipo,
ma mette la cellula in condizioni di “debolezza”. La cellula e’
eterozigote e il gene puo’ ancora svolgere la funzione, ma e’
una funzione non completamente efficace
By NA
22
Oncosoppressori gatekeepers
esempi
La perdita del prodotto del gene NF1, mutato nella neurofibromatosi di
tipo 1, conduce ad una incontrollata attivita’ di ras.
APC, coinvolto nella FAP, regola la trasmissione di un segnale dalla
superficie cellulare al nucleo, che porta all’espressione di c-MYC
La perdita di
p53 genera la
sindrome di Li-Fraumeni, sottraendo
le cellule al processo di apoptosi
By NA
23
Altri oncosoppressori
By NA
24
Perdita di eterozigosita’ LOH
famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D
Cellule
tumorali
omozigote
By NA
eterozigote
eterozigote
LOH
25
Meccanismi di acquisizione della seconda
mutazione
+
+
Rb --
+ Rb
Non disgiunzione
e duplicazione
mutazione
puntiforme
C.O mitotico
+
delezione
Rb
Conversione genica
Rb
By NA
Rb
+ Rb
Rb
Rb
+
Rb
Rb
x
Rb
26
Perdita di eterozigosi per identifiare un TS
By NA
27
Perdita di eterozigosi / instabilita’
By NA
28
come funzionano i TS
By NA
29
controllo dell’integrita’
del genoma
By NA
30
Carney Complex (CNC) de novo
Diagnosi clinica:
19 anni, lieve ritardo mentale, difficolta’ di apprendimento,
iperpigmentazione, mixomi al seno e all’ipofisi
By NA
31
Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante,
suscettibilita’ al cancro
Mixoma: tumore benigno connettivale quando localizzato nel cuore puo’ provocare
alterazioni cardiache
By NA
32
Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante,
suscettibilita’ al cancro
PRKAR1A(17q24): gene codificante
l’unita’ regolatoria della proteinchinasi
A.L’80% degli affetti ha mutazioni in
questa sequenza
La paziente non ha
mutazioni nel gene
By NA
33
Cariotipo
By NA
A 10 anni era stato eseguito il cariotipo per il ritardo mentale: presenza
di un piccolo marcatore de novo non identificato nel 70% delle metafasi
34
2009: array-CGH
alla comparsa del fenotipo
del Carney Complex e’
stata eseguita un arrayCGH per
chiarire se ci fosse
relazione con il piccolo
marcatore
last norm
82999282
first trip
83061240
last trip
84663025
first norm
84713307
chr1:83061240-84663025
1.6 Mb Log2ratio 1.08
(triplicatione)
By NA
35
FISH
FISH with probe(s) of the unbalanced region
confirmed that the triplicated material
is located on the
marker chromosome
La FISH con i BAC della regione triplicata conferma l’origine del
piccolo marcatore sovrannumerario e lo sbilanciamento genomico
By NA
36
Domanda
Il materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale e
Carney Complex disease della proposita?
By NA
37
Domanda
Il materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale e
Carney Complex disease della proposita?
Is the genetic material contained within the de novo marker chromosome responsible for the
phenotype of the proband(mental retardation, Carney complex disease)??
From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme
might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life
No information for increased dosage of the gene
According to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype
since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease
By NA
38
The genes in the triplication portion not known as disease-gene
Sterile alpha motif
domain???
urate oxidase urate oxidase
Tubulin tyrosin ligase-like highly expressed
in the nervous system
cAMP-dependent protein kinase
catalytic subunit
From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme
might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life
No information for increased dosage of the gene
According to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype
since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease
By NA
39
Triplication of the
PRKACB
cAMP-dependent protein
kinase
catalytic subunit
Same effect of PRKAR1A
mutation?
By NA
40
By NA
… The net effect of all these changes in CNC cells is an increase in
DNA transcription and/or activation of other pathways leading to
abnormal growth and proliferation.
41
PKA Activity
Real Time PCR on lymphocytes
and fibroblasts
from the patient and two controls
Normalized to actin
Normalized to gapdh
We know now that the Carney
phenotype of our patient is linked
to the triplication of the catalytic subunit
of the protein kinase A gene
By NA
42
Array analysis must be done having in mind
the phenotype
and not in a blind way
Genome-wide array analysis requires noteworthy ability
in using public genomic databases
a similar case in a prenatal diagnostic setting could have been
interpreted as without any clinical consequences since none of
the triplicated genes was known to be pathogenic when
amplified
By NA
43