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Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Procedure for performing fermentation tests 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA O/F GLUCOSE TEST Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Escherichia coli Oxidative-Fermentative (O/F) Test 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA O/F GLUCOSE TEST Interpretazione del O/F Glucose Test Risultato Interpretazione Anaerobico Aerobico GIALLO GIALLO Metabolismo fermentativo ed ossidativo VERDE GIALLO Metabolismo ossidativo VERDE VERDE Zucchero non metabolizzato (non-saccarolitico) 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA The well-established method for manual microorganism identification to the species level, bioMérieux’s API® identification products are test kits for identification of Gram positive and Gram negative bacteria and yeast. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Gli enterobatteri, o famiglia delle Enterobacteriaceae, includono un numero ampio di - Proteobacteria, il cui habitat naturale è costituito dall'intestino dell'uomo e di altri animali. Questi batteri sono accomunati da caratteristiche antigeniche e biochimiche tipiche dell'intero gruppo. Resta difficile classificare gli stessi, in base a queste caratteristiche, in gruppi nettamente distinti, in quanto molti batteri presentano caratteri intermedi, ma dal punto di vista pratico questo è comunque necessario nella diagnostica medica. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Tutti gli enterobatteri sono bastoncelli Gram-negativi, asporigeni. Possono essere mobili o immobili, quasi tutti provvisti di pili. Sono aerobi-anaerobi facoltativi e normali terreni di coltura consentono la loro crescita. Se coltivati in presenza di ossigeno, ovvero in aerobiosi, gli enterobatteri sono produttori di citocromi e attraverso il ciclo di Krebs ricavano energia ossidando l'acido piruvico. Al test delle ossidasi risultano tuttavia negativi, non possedendo la citocromo c ossidasi nelle loro catene di trasporto degli elettroni. Per i generi Escherichia, Shigella, e Salmonella il cianuro di potassio a piccole concentrazioni ne impedisce la crescita nel terreno di coltura. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Il test dell’ossidasi serve per determinare se un batterio produce la citrocromo c ossidasi. Viene utilizzato come indicatore redox la TMPD (N,N,N',N'-tetramethyl-pphenylenediamine). Il reagente si presenta blu scuro sino a marrone quando nello stato ossidato ed incolore quando ridotto. I batteri ossidasi positivi posseggono la citocromo-ossidasi o la indofenolo-ossidasi. Entrambi questi enzimi catalizzano il trasporto di elettroni dal donatore (NADH) all’accettore finale (normalemente l’O2). La TMPD agisce da donatore artificiale di elettroni. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Oxidase Test: A. Pseudomonas aeruginosa - Purple color indicates positive. B. Escherichia coli - Negative. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Catalase Test 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI The Indole Test The amino acid tryptophan is found in nearly all proteins. Positive Indole: Bacteria that contain tryptophanase can hydrolyse tryptophan to its metabolic products (indole, pyruvic acid, ammonia) Tryptophan ----Tryptophanase-----> Indole + Pyruvic Acid + Ammonia The bacteria use the pyruvic acid and ammonia to satisfy nutritional needs; indole is not used and accumulates in the medium. This will form a layer of red color on the surface of the medium when added with Kovac’s reagent due to the combination of the 4dimethylamino-benzaldehyde in the Kovac’s reagent and indole. Indole + added Kovac’s reagent = Red color Negative Indole: There would be no red color formation on the agar surface when added with Kovac’s solution. Tryptophan ----No Tryptophanase-----> Tryptophan Tryptophan + added Kovac’s reagent = no red color 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Alcaligenes sp. Citrobacter sp. Enterobacter sp. Escherichia coli Salmonella sp. Vibrio sp. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Hydrogen Sulphide Test Using SIM (Sulfide-Indole-Motility) Medium Likewise, some bacteria are capable of breaking down sulfur containing amino acids (cystine, methionine) or reducing inorganic sulfur-containing compounds (such as sulfite, sulfate, or thiosulfate) to produce hydrogen sulfide (H2S). This reduced sulfur may then be incorporated into other cellular amino acids, or perhaps into coenzymes. The ability of an organism to reduce sulfur-containing compounds to hydrogen sulfide can be another test for identifying unknown organisms such as certain Proteus and Salmonella. To test for hydrogen sulfide production, a medium with a sulfur-containing compound and iron salts is inoculated and incubated. If the sulfur is reduced and hydrogen sulfide is produced, it will combine with the iron salt to form a visible black ferric sulfide (FeS) in the tube. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA SIM (Sulfide-Indole-Motility) Medium Soft Agar Stabbing (Tube Method) It is too dangerous to attempt to determine the motility of pathogenic microorganisms (such as the typhoid bacillus) by slide techniques. A much safer method is to culture the organisms in a special medium that can demonstrate the presence of motility. The medium mainly used for this purpose is SIM medium ( Sulphide – Indole - Motility - medium) which is a combination differential medium that tests three different parameters, Sulfur Reduction, Indole Production and Motility. This media has a very soft consistency that allows motile bacteria to migrate readily through them causing cloudiness. The non-motile bacteria will only grow in the soft agar tube and only the area where they are inoculated. But in the case of motile bacteria, they will grow along the area of stab and will also swim out away from the stabbed area. Thus, a negative result is detected by growth in a distinct zone directly along the stab. A positive result is indicated by diffuse or cloudy growth mostly at the top and bottom of the stab. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI succinate Generation of hydrogen with simultaneous production of lactate, succinate, acetate, and even ethanol, CO2 and H2 (mixed acid fermentation), via glycolysis. This reaction is catalysed by the enzyme pyruvate-formate lyase, and is typical of the metabolism of enterobacteria such as Escherichia coli under anaerobic conditions. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Butanediol Fermentation 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Citrate, a Krebs cycle (i.e., TCA cycle or citric acid cycle) intermediate, is generated by many bacteria; however, utilization of exogenous citrate requires the presence of citrate transport proteins (permeases). Upon uptake by the cell, citrate is cleaved by citrate lyase to oxaloacetate and acetate. The oxaloacetate is then metabolized to pyruvate and CO2. The carbon dioxide that is released will subsequently react with water and the sodium ion in the medium to produce sodium carbonate, an alkaline compound that will raise the pH. In addition, ammonium hydroxide is produced when the ammonium salts in the medium are used as the sole nitrogen source. The bromothymol blue pH indicator is a deep forest green at neutral pH. With an increase in medium pH to above 7.6, bromothymol blue changes to blue. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA [DRNA] The first, most important stage in the chain of nitrate reduction to nitrite is catalyzed by nitrate reductase (NRase). There are four types of NRases: an eukaryotic assimilatory NRase (Euk-NR) and three different bacterial enzymes, namely cytoplasmatic assimilatory NRases (i.e. Nas), membrane-bound respiratory NRases (i.e. Nar), and periplasmic dissimilatory (i.e. Nap) RNases. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Membrane-bound NRase for respiratory reduction of nitrate is widespread among enterobacteria 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Dissimilatory periplasmic nitrate reductase 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA Nitrate reduction by means of assimilatory nitrate reductase activity 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Biochemical nitrate reduction pathway and detection of nitrite in medium 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI w/ zinc A red color will be produced in the medium only when nitrite is present in the medium. Lack of a red color in the medium after the addition of sulfanilic acid and alpha-naphthylamine means only that nitrite is not present in the medium. There may be two explanations for this observation. 1) - The nitrate may not have been reduced; the strain is nitrate-negative. 2) - The nitrate may have been reduced to nitrite which has then been completely reduced to nitric oxide, nitrous oxide, or nitrogen which will not react with the reagents that react with nitrite; the strain is nitrate-positive. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Reaction Observed with Uninoculated Nitrate Medium 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Reaction Observed with Nitrate-Negative Species 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI Neisseria Branhamella Kingella Reactions Observed with Nitrate-Positive Species 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA ENTEROBATTERI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA MICROCULTURES for GROWING FUNGI A block of inoculated nutrient agar sandwiched between two sterile cover glasses is placed in a plastic petri dish containing water agar. 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA MICROCULTURES for GROWING FUNGI 2014 Giovanni Vallini Università degli Studi di Verona – Dipartimento di Biotecnologie Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie a.a. 2013-2014 ● Corso di Metodologie di Microbiologia e Genetica METODOLOGIE di MICROBIOLOGIA MICROCULTURES for GROWING FUNGI 2014 Giovanni Vallini
