Download N 2 - คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น

NITROGEN
METABOLISM
Nitrogen Metabolism
- Phycocyanin
- 78% ปัจจัยจำกัดกำร
- Phycoerytrin
เจริญเติบโตของพืช
- ATP
- Protein
- Coenzyme
- Chlorophyll
- Alkaloid
- Nucleic acid
- Vitamine
- Phytochorme
- Hormone บำงชนิด
# พืชไม่ สำมำรถใช้ N2 ในรูปของ gas ได้
# N2
#
NO3
reduced
NO3
,
+
NH4
+
สูญหำยไปจำกดินได้ งำยกว่ ำ NH4
Nitrogen Cycle
N2 ในบรรยำกำศ ดิน นำ้ และในสิ่ งมีชีวติ มีกำร
เปลีย่ นรู ปไปมำโดยกระบวนกำรทำงกำยภำพและชีวภำพ
ซึ่งเกีย่ วข้ องกับสิ่ งมีชีวติ และไม่ มชี ีวติ เรียกกำร
เปลีย่ นแปลงสำรประกอบ
ไนโตรเจนนีว้ ่ ำ วัฏจักรไนโตรเจน (Nitrogen cycle)
วัฏจักรไนโตรเจนอย่ ำงง่ ำย (Lea and Leegood, 1993)
วัฏจักรไนโตรเจน (Taiz and Zeiger, 1991)
ปฏิกริ ิยำทำงเคมีในวัฏจักรไนโตรเจน
1. Nitrogen fixation
- nonbiological fixation
Haber-Bosch process (high temp., high pressure)
simplest equation for nitrogen fixation
N2 + 3H2
2NH3
- Biological nitrogen fixation
N2 + 8H - + 8e - + 16 ATP
2NH4+ + H2+ + 16ADT + 16Pi
2. Assimilation of ammonia
NH4+
amino acid
3. Nitrification
nitrifying bacteria
+
NH4
4. Denitrification
NO3
-
anaerobic
NO3-
N2
denitrifying bacteria
5. Nitrate reduction
NO3NH4+
6. Ammonification (mineralization)
+
organic matter
NH4
Nitrogen fixing organism
microbe
Symbiosis
Rhizobium, Actinomycetes
Associations
Azospirillum, Azotobacter
Free living
Azotobacter, Klebsiella
(non-symbiotic organism) Rhodospirillum
vegetative cells
and heterocysts of
nitrogen-fixing
cyanobacterium
Anabena cylindrica
Symbiotic nitrogen fixers
สิ่ งมีชีวติ 2 ชนิดอยู่ร่วมกัน และต่ ำงก็ทำประโยชน์ ให้ แก่ กนั
1. Symbiosis ระหว่ ำงพืชตระกูลถั่ว (Fam. Fabaceae หรื อ
Leguminosae) กับแบคทีเรียพวก Rhyzobium
ถั่ว
: Carbon source
Rhizobium : NH3
ตัวอย่ ำงกำรอยู่ร่วมกันระหว่ ำง Rhizobium กับพืชตระกูลถั่ว
(Taiz and Zeiger, 1991)
Rhizobium species
R. leguminosarum
R. trifolii
R. phaseoli
R. meliloti
R. japonicum
Preferred host genus
Pisum (pea), Vicia (broad bean)
Lens (lentil), Cicer (chick pea)
Trifolium (clover)
Phaseolus (kidney bean)
Medicago (alfalfa)
Melilotus (sweet clover)
Glycine (soy bean)
2. Symbiosis ระหว่ ำง Klebsiella กับพืชทีอ่ ยู่ในเขต
ร ้อน (tropical plants) เช่ น Psychotria sp.
3. Symbiosis ระหว่ ำง สำหร่ ำยสี เขียวแกมนำ้ เงินกับ
พืชพวก gymnosperm เช่ น cycad
4. Symbiosis ระหว่ ำง สำหร่ ำยสี เขียวแกมนำ้ เงิน
Anabaena กับแหนแดง (Azola)
- มีควำมสำคัญต่ อนำข้ ำวในเขต Southeast Asia
- Anabaena azolae ตรึง N2 ได้ สูงถึง
450 kg/N/ha/yr
5. Symbiosis ระหว่ ำงสำหร่ ำยสี เขียวแกมนำ้ เงิน
กับ Fungi - ( Lichen)
* สำหร่ ำยทำหน้ ำทีส่ ั งเครำะห์ ด้วยแสง + ตรึง
N2
* Fungi ปล่ อยกรดบำงชนิดทำให้ หินผุ
6. Symbiosis ระหว่ ำงพวก Frankia (actinomycetes
bacteria) กับพืชพวก alder (Alnus)
* ควำมสั มพันธ์ แบบ actinorhizal association
* มักพบในพืชพวก shurbs หรื อ tree
Root nodule in Soybean
Root nodule of Alder tree
infected by Rhizobium japonicum
infected by actinomycetes bacteria
7. Symbiosis ระหว่ ำง Fungi พวก mycorrhiza กับรำกพืช
พวก Alder โดย Fungi จะให้ สำรพวกอนินทรีย์แก่ พืช
โดยเฉพาะ P
ประเภทของ Mycorrhiza
1. Ectomycorrhiza
- สร้ ำง mycelium นอกรำกพืช
- พบใน woody perennial species
2. Endomycorrhiza
- สร้ ำง mycelium ใน cortex
- ส่ วนใหญ่ พบในพืชพวก annual และ biennial
พืชเศรษฐกิจส่ วนใหญ่ มี Fungi แบบ endomycorrhizal type
Root infected by ectotrophic
mycorrhizal fungi
symbiosis ระหว่ ำง mycorrhiza กับรำก
พืช
(Taiz and Zeiger, 1991)
กำรอยู่ร่วมกันของสิ่ งมีชีวติ แบบพึง่ พำกัน
(Lea and Leegood, 1993)
1. Host : Legumes and Parasponia
Rhizobiaceae
Azorhizobium
(fixes N2 eg planta)
Bradyrhizobium (usually slow growing,some strains fix
N2 eg planta)
Photorhizobium (photosynthetic)
Rhizobium
(fast growing, most strains do not fix
N2 eg planta)
Sinorhizobium
(fast growing)
2. Host : Non - legumes (actinorhizal plants)
Alnus, Casuarina, Elaeagnus, Myrica
Actinomycetales (Frankia)
3. Host : Various e.g. Gunnera (angiosperm), Macrozamia
(cycad), Azolla (pteridophyte), Blasia (bryophyte),
Rhizosolenia (diatom), Certain lichens (fungi),
Siphonochalina (sponge)
Cyanobacteria
Associative
nitrogen fixers
เป็ นกำรตรึง N2 ทีเ่ กิดจำกกำรอยู่ร่วมกัน
แบบ loosely symbiotic
ฝ่ ำยหนึ่งได้ ประโยชน์ แต่ อกี ฝ่ ำย
ไม่ ได้ เสี ยประโยชน์
กำรตรึง N2 ของพืชตระกลู ถัว่
ปมรำกถั่วมักมีแบคทีเรียพวก Rhizobium
อยู่แบบได้ ประโยชน์ ท้งั สองฝ่ ำย
พืชตระกูลถั่วได้ รับสำรประกอบไนโตรเจน
(amino acid ชนิดต่ ำงๆ)
แบคทีเรียได้ รับสำรพวก reduced carbon
(แหล่ งพลังงำน)
bact. เข้ ำสู่ รำกพืชทำง root hair
สร ้างปมลักษณะกลมหรือรี
่ bact. อยู่รอบ root hair ทำให้ root hair ปลดปล่อยสำร
เมือ
บางอย่างออกมา
้ ผลให้ bact. เกิดกำรแบ่ งเซลล์ เพิม่ จำนวน
สารนี มี
bact. ผ่ ำน root hair ไปยัง cortex
เรียก infected thread
bact. เข้ ำไปอยู่ใน cytoplasm ของเซลล์พร้ อมกับปล่อยสำร
ออกมา มีผลทาให้ป ริมาณ DNA ใน nucleuse ของเซลล
้ั cortex เพิม่ มำกขึน้ เกิดปมทีร่ ำก
ในชน
bact. ทีร่ วมกันอยู่เป็ นกลุ่มเรียกว่ ำ Bacteroid
ภายใน bacteroid มีเอนไซม์ ทจี่ ำเป็ นต่ อกำรตรึง
N2 จำกบรรยำกำศ
@ กำรตรึง N2 ในภำคอุตสำหกรรมต้ องใช้ temp. สู ง
และความด ันมาก
@ Biological reduction of N2
NH3
เป็ นปฏิกริ ิยำ highly endergonic process ต้ องกำรพลังงำน
960 K.J mol-1 N fixed (Sprent and Raven, 1985)
กลไกกำรตรึงไนโตรเจนโดยสิ่ งมีชีวติ
(Mechanism of Biological Nitrogen Fixation)
ลักษณะของสิ่ งมีชีวติ ที่สำมำรถตรึง N2 ได้
1. มี enz. nitrogenase ในรู ป active form
(ลักษณะเฉพำะของ N2 - fixing microorganism)
2. มีกลไกป้องกันไม่ ให้ enz. nitrogenase ทำปฏิกริ ิยำกับ O2
3. มีแหล่ งให้ electron และ proton
4. มีปฏิกริ ิยำกำรตรึงไนโตรเจน
5. มีสำรทีด่ กั ทำปฏิกริ ิยำกับแอมโมเนียที่เกิดจำกกำรตรึง N2
เอนไซม์ ไนโตรจีเนส
* กำรศึกษำกระบวนกำรตรึง N2 เริ่มโดย Mc coy Wilson และ
Burris มหำวิทยำลัย Wisconsin ในช่ วงปี 1930
* enz. nitrogenase เป็ น enz. ทีส่ ำคัญในกำรตรึง N2
* แยกได้ในปี 1959 โดย Carnahan, Mortensen และ Valentine
* สกัด enz. นีจ้ ำก Clostridium pasteurianum
* หลังจำกนั้นมีผู้สกัด enz. จำกสำหร่ ำยสีเขียวแกมนำ้ เงินที่
สามารถตรึง N2 ได้
กำรที่ไม่ สำมำรถแยก nitrogenase อำจเนื่องมำจำก
1. กำรแยก enz. ส่ วนใหญ่ ทำที่ temp. ต่ำๆ เพื่อป้องกันกำรเกิด
inactivation แต่ enz. nitrogenase มักถูก inactivate
โดย temp. ต่ำ (cold labile)
2. ต้ องแยก nitrogenase ในสภำพทีไ่ ม่ มี O2 (anaerobic condition)
เพรำะ nitrogenase ถูก inactivate โดย O2
3. กำรทำงำนของ nitrogenase ต้ องกำร ATP ด้ วย
4. กำร reuced N2 ไปเป็ น NH3 ต้ องอำศัย strong reducing agent
ซึ่งในอดีตยังไม่ พบ biological reduceing agent ที่เหมำะสม
ต่อมาพบว่า ferredoxin เป็ น reducing agent ที่เหมำะสม
สิ่ งที่จำเป็ นต่ อกำรตรึงไนโตรเจน (in vitro)
1. gas N2 (molecular nitrogen)
2. reducing agent คือ ferredoxin
3. ATP หรื อสำรอื่นที่ให้ ATP ได้
4. non heme iron protein (NHI) ซึ่งมี Mo
เป็ นองค์ ประกอบ
5. NHI protein อีกชนิดทีไ่ ม่ มี Mo ซึ่งสลำยได้ ง่ำย
ใน low temp. (cold labile)
กำรทดลองของ Evans และคณะ ในค.ศ. 1966
ทดลองสกัด nitrogenase จำกปมถั่วเหลือง
ทดลองทีร่ ัฐโอเรกอน สหร ัฐอเมริกา
ความสาเร็จของการทดลองเกิดเนื่ องจา
ไม่ มี O2 เกีย่ วข้ องกับกำรทดลอง
ป้ องกันไม่ ให้ มี phenol oxidase ในระบบ
ใช้ gas-liquid chromatography เป็ นเครื่ องมือ
สำหรับทดสอบ (assay) โดยใช้ ระบบกำร
reduced ก๊ ำซ acetylene เป็ นก๊ ำซ ethylene
โครงสร้ ำงและหน้ ำที่ของเอนไซม์ ไนโตรจีเนส
(Structure and function of nitrogenase enzyme)
ชนิดของ nitrogenase
1. Fe-Mo-protein (iron molybdenum protein)
- เป็ นโปรตีนที่ไวต่ อควำมเย็น
- Fe-Mo-protein มี MW ระหว่ ำง 100,000-200,0
- มี subunit ย่ อยคือ a2 กับ b2 ทีป่ ระกอบด้ วย Fe
และ Mo เรียก component I
- เมื่อถูกควำมเย็นจะสู ญเสี ย activity เป็ น cold labile
2. Fe-S protein (iron-sulfur protein)
- sensitive ต่ อ O2
- มี MW 50,000-80,000
- ประกอบด้ วย 2 subunit
ทีเ่ หมือนกัน
เรียก component 2
บำงระบบจำแนก nitrogenase เป็ น 3 ชนิดดังนี้
1. ชนิดที่ประกอบด้ วย Mo และเหล็ก (Mo-nitrogenase)
2. ชนิดที่ประกอบด้ วย Vanadium และเหล็ก (V-nitrogenase)
(แทน Mo) (Rosendahl et al., 1992)
3. ชนิดที่ประกอบด้ วยเหล็ก แต่ มี Mo และ V น้ อย
(Fe-nitrogenase) หรื ออำจเรียก alternative nitrogenase
(Eady et al., 1987)
N2 + 8H+ + 8e- + 16Mg. ATP
2NH3 + H2 + 16Mg. ADP + 16Pi
โครงสร้ ำงของ nitrogenase ทั้ง 3 ชนิด
Mo-nitrogenase V-nitrogenase
Fe-protein
MW
57-72 kDa
subunit str. g2
Metal cont. 4Fe : 4S
MoFe-prot.
subunit str. a2b2
a = 50 kDa
b = 60 kDa
Fe-protein
63 kDa
g2
4Fe : 4S
VFe-prot.
a2b2 d2
a = 50 kDa
b = 60 kDa
d = 14 kDa
‘Alternative’
nitrogenase
Fe-protein (2)
65 kDa
g2
4Fe : 4S
Fe-prot. (1)
a2b2 d2
a = 50 kDa
b = 60 kDa
d = 15 kDa
โครงสร้ ำงของ nitrogenase ทั้ง 3 ชนิด (ต่ อ)
Mo-nitrogenase V-nitrogenase
Fe-protein
Metal cont. 2Mo : 24-32
Fe : 24-30S
Product of
C2H2 reduct. C2H4
% electron
flux to NH3
75
(balance to H2)
Fe-protein
2V : 17-21
Fe : 18-20S
C2H4 + C2H6
50
‘Alternative’
nitrogenase
Fe-protein (2)
24Fe : 18S
C2H4 + C2H6
50
Molybdenum nitrogenase
# Carnahan et al (1960) สกัด Mo-nitrogenase จำก
Clostridium pasteurianum
# ทำให้ inactive โดย O2 และควำมเย็น
# ถ้ ำแยก enz. นีท้ อี่ ุณหภูมิ 4o C จะทำให้ สูญเสี ย activity
# Mo-nitrogenase ประกอบด้ วยโปรตีน 2 ชนิด
1. Molybdenum iron protein หรื อ protein 1 หรื อ
dinitrogenase (the larger Mo-Fe protein)
2. iron protein หรื อ protein 2 หรื อ dinitrogenase
reductase (the smaller)
@ Mo-Fe protein ประกอบด้ วย a2b2 tetramer
@ มี MW ประมำณ 220 kDa (a 50 kDa และ b 60 kDa)
@ ในโมเลกุล Mo-nitrogenase ประกอบด้ วย molybdenum,
เหล็ก และซัลเฟอร์ ในอัตรำส่ วน
2Mo : 24-32Fe : 30S ต่ อโมเลกุล
# Fe protein nitrogenase ion g2 diner มี MW 57-72 kDa
# ประกอบด้ วยกลุ่มของ Fe4S4
ปฏิกริ ิยำกำรคะตะไลซ์ โดย
nitrogenase
8(SO2) + 8OH- +8HSO3-
N2 + 10H+
2NH4+ + H2
16MgATP2- + 16H2O+ 16MgADP- + 16H2PO4-
สรุปคุณสมบัตขิ องเอนไซม์ ไนโตรจีเนส
1. ประกอบด้ วยโปรตีน 2 ชนิด
2. ถูกทำลำยโดย O2 ได้ ง่ำย
3. มี Fe และ Mo เป็ นส่ วนประกอบของโมเลกุล
4. ต้ องกำร Mg ion ในกำรทำงำน
5. ในขณะที่ทำงำนจะเปลีย่ น ATP ไปเป็ น ADP
6. ถูกยับยั้งกำรทำงำน (inhibit) โดย ADP
nitrogenase ทีพ่ บในสิ่ งมีชีวติ ทั้งหลำยจะมีคุณสมบัติ
่
และหน้าทีเหมื
อนหรือคล้ายคลึงกัน
nitrogenase มีคุณสมบัตทิ ำงเคมีทสี่ ำคัญคือ ทำปฏิกริ ิยำ
กับ O2 ได้ ง่ำย
หลังจำกถูกออกซิไดส์ แล้ ว nitrogenase จะเปลีย่ นเป็ น
่ และหมดหน้าที่
สารประกอบชนิ ดอืน
nitrogenase ทำหน้ ำที่สำคัญในกำรตรึง N2 คือช่ วย
reduced N2 ให้ เป็ น NH3
สำมำรถ reduce สำรประกอบทีม่ ี triple bond ได้ เกือบ
ทุกชนิ ด เช่น nitrogen (N N) , acetylene (HC CH)
ชนิดของสำรประกอบทีถ่ ูก reduced ด้ วย nitrogenase ได้ (Taiz and Zeiger, 1991)
Substrate
Dinitrogen (N N)
Azide[N N N]Nitrous oxide (N N O)
Cyanide ([C N]----)
Alkyl cyanides (R C N)
Cynamide (N CNH2)
Acetylene (HC CH)
Alkynes (R C CH)
Allene (H2C C CH2)
Proton (H+)
Products
NH3, H2
N2, N2H4, NH3
N2
CH4, NH3, CH3NH2
R CH2, NH3
CH4 , NH3, CH3NH2
H2C CH2
R HC CH2
H3C CH CH2
H2
ปฏิกริ ิยำหลำยปฏิกริ ิยำก็สำมำรถถูก reduced โดย nitrogenase ได้
N2
N 2O
N 3C 2H 2
2H+
ATP
NH3
H 2 + H 2O
N2 + NH3
C 2H 4
H2
ADP + Pi
Dinitrogen fixation
Nitrous oxide reduction
Azide reduction
Acetylene reduction
H2 production
ATP hydrolytic activity
* nitrogenase ไวต่ อ free O2 มำก พืชหรื อจุลนิ ทรีย์ทสี่ ำมำรถ
ตรึง N2 ได้ ต้องมีกลไกปัองกันกำรทำลำย nitrogenase ของ O2
กลไกกำรป้ องกันไม่ ให้ nitrogenase สั มผัสกับ free O2
(Protective mechanism for nitrogenase)
@ ในพืชตระกูลถัว่ มีสำร leghaemoglobin ในปมรำก
มีทองแดง (Cu) เป็ นองค์ ประกอบทำให้ มีสีชมพู
มีคุณลักษณะคล้ำย haemaglobin ในสั ตว์
@ ยังไม่ ทรำบหน้ ำทีข่ อง leghaemoglobin อย่ ำงชัดเจน
@ leghaemoglobin ทำหน้ ำที่นำ O2 ทีอ่ ยู่ใน intercellular
space ออกไปห่ ำงจำกที่ (site) ที่มีกำรตรึง N2
@ ในปมรำกทีไ่ ม่ มี leghaemoglobin จะไม่ สำมำรถตรึง N2 ได้
@ สำหร่ ำยทีต่ รึง N2 ได้ มักมี cell wall หนำ ป้องกัน O2 ซึมเข้ ำ
บทบำทของ Leghaemoglobin ในกำรตรึง N2
- ภำยในปมรำกถั่วมีสีแดง เนื่องจำกมีีี Leghaemoglobin
ซึ่งปมรำกที่มี Leghaemoglobin อยู่เท่ ำนั้นทีจ่ ะตรึง N2
- Leghaemoglobin มีควำมสำคัญต่ อกำรทำงำนของ
เอนไซม ์ไนโตรจีเนส
Rhizobium จะทำหน้ ำที่สร้ ำง precursor ของ heme group
Leghaemoglobin ทำหน้ ำที่จับ O2 แล้ ว transport O2
่
ไปยังส่วนต่างๆของปมเพือใช้
ใน
กระบวนกำรหำยใจ
การ reduced N2 ให้ เป็ น NH3 ในปฏิกริ ิยำกำรตรึง N2 ใช้
พลังงานในรู ปของ ATP ถึง 15-20 โมเลกุล
การตรึงไนโตรเจน 1 โมเลกุลทั้งอิเลคตรอน
โปรตรอน
และ ATP อำจได้ มำจำกปฏิกริ ิยำกำรสั งเครำะห์ แสงหรื อ
จากการหายใจ
แหล่ งที่มำของอิเลคตรอน, โปรตอน
กำรตรึงไนโตรเจน
( Nitrogen Fixing Reaction )
ปฏิกริ ิยำกำรตรึง N2 แบ่ งเป็ น 3 ขั้นตอนดังนี้
1. ไนโตรเจนถูก reduced เป็ น diimide (HN=NH)
2. Diimide ถูก reduced เป็ น hydrazine (H2N-NH2)
3. Hydrazine ถูก reduced เป็ น NH3
N=N
ATP
Reduced ferredoxin 2e- nitrogenase
HN=NH diimide
2e- nitrogenase
H2N-NH2 (hydrazine)
2e-
nitrogenase
2NH3
แสดงปฏิกริ ิยำกำรตรึง N2
* Nitrogenase เป็ นเอนไซม์ ทไี่ ม่ เฉพำะเจำะจงกับ
substrate สำมำรถ reduce สำรอื่นได้ ด้วย เช่ น
acetylene, CO, CN และ N2O
* สำรเหล่ ำนีจ้ ะเป็ น competitive inhibitor ของกำร
reduced N2
ควำมสั มพันธ์ ของพืชตระกูลถั่วกับ Rhizobium
(Legume-Rhizobium association)
มีข้อดีดงั นี้
1. พืชตระกูลถั่ว สำมำรถตรึงไนโตรเจนได้ ในปริมำณมำกที่พืช
จะนาไปใช้ประโยชน์
2. ไนโตรเจนที่ตรึงได้ จะถูกเปลีย่ นให้ อยู่ในรู ปโปรตีนที่อยู่
ในรู ปของ dry seed
3. โปรตีนที่ได้ มคี ุณค่ ำทำงอำหำรสู ง เพรำะมี essential amino
acid ครบ แต่ มี methionine, cystine และ cystein ต่ำ
4. ไนโตรเจนที่ตรึงได้ บำงส่ วนจะเหลืออยู่ในดิน
กระบวนกำรสร้ ำงปมในพืชตระกูล
ถั่ว
1. สำรบำงอย่
งที่ขบั ออกมำจำกรำกพื
ำให้ Rhizobium
(The ำformation
of rootชจะท
nodule)
เคลื่อนที่เข้ ำไปหำและแบ่ งตัวรอบๆบริเวณขนรำก (root
hair)
2. ขนรำกจะม้ วนตัวงอ เนื่องจำก Rhizobium ผลิตสำรพวก
wall degrading enzyme
3. แบคทีเรียจะไปเกำะตรงบริเวณที่มกี ำรม้ วนงอ ก่ อให้ เกิดกำร
break down ของ cell wall ของขนรำก แบคทีเรียเข้ ำไป
ใน
เซลล ์ของขนรากในรู ป infection thread
4. infection thread จะห่ อหุ้ม reproducing bacteria และ
5. infection thread จะบุกรุ กเข้ ำไปหำ polyploid
cell
ใน root cortex เท่ ำนั้น
6. infection thread จะหยุดกำรเจริญเติบโตเมื่อไป
ถึง
polyploid cell และกระตุ้นให้ มีกำรแบ่ งเซลล์
7. ผลที่ได้ จำกกำรแบ่ งตัวของเซลล์ จะก่ อให้ เกิดปม
ขึน้
้ วย
ประกอบขึนด้
- core region
8. Core region bacteria จะถูกเปลีย่ นเป็ น bacteroid
ซึ่งมีขนำดเพิม่ ขึน้ จำกเดิม 10-40 เท่ ำ
9. Leghaemoglobin ถูกสร้ ำงในเซลล์ พืชและถูกส่ ง
มำยัง
vesicle ที่ห่อหุ้มแบคทีเรีย
* ในกำรสร้ ำงปมรำกถั่ว Rhizobium กับรำกถั่วต้ องมี
ความ specificity เนื่องจำกพืชจะมี lectin ซึ่งเป็ น
plant protein ที่จับกับ Rhizobium
* lectin จะทำหน้ ำที่คล้ ำยกับสะพำนเชื่ อม Rhizobium
ให้ จับกับ root hair ของพืช เช่ น พืชพวก clover จะมี
lectin ที่เรียกว่ ำ trifolin เป็ นตัวเชื่ อม Rhizobium กับ
root hair ของ clover
ประสิ ทธิภำพในกำรสร้ ำงปมของพืชตระกลู ถัว่
ปัจจัยที่ทำให้ กำรทำงำนของปมมีประสิ ทธิภำพ
คือ
เอนไซม์
Nitrogenase ซึ่งจะรีดวิ ส์ N2 ให้ เป็ น NH3 แล้ วรีดิวส์
+
2H
ไปเป็ น H2 (และกำรเกิด H2 นีจ้ ะเกิดพร้ อมๆกับกำรรีดวิ ส์
N
)
2
ปริมาณ H2 ทีผ่ ลิตได้ จะขึน้ กับสิ่ งแวดล้ อมภำยใน
กำรวัดอัตรำกำรตรึงไนโตรเจน
(measurment of nitrogen fixation)
วิธีกำรวัดกำรตรึงไนโตรเจน แบ่ งได้ ดงั นีค้ ือ
1. วัดจำกกำรเจริญเติบโตของจุลนิ ทรีย์ทสี่ ำมำรถตรึง
N2 ได้
2. วัดจำกปริมำณกำรเพิม่ N2 ในเซลล์ ของจุลนิ ทรีย์
3. วัดจำกปริมำณ acetylene ทีถ่ ูก reduce
Ammonia trapping
* NH3 ทีเ่ กิดจำกกำรตรึง N2 จะระเหยออกจำกเซลล์
่
ได้ หากไม่ทาปฏิก ิรย
ิ าก ับสารอืน
* แอมโมเนียและแอมโมเนียมสำมำรถ เปลีย่ นกลับไป
มาได้ง่าย จึงเรียกรวมก ันว่า Ammonia
nitrogen
NH3 + H2O
NH4+ + OH-
* ในธรรมชำติ Ammonium nitrogen เกิดได้ หลำยทำง
เช่นจากการ reduced nitrate, กำรสลำยตัวของ
กำรวัดอัตรำกำรตรึงไนโตรเจนจำกกำร
เจริญเติบโต
ของจุลนิ ทรีย์ทสี่ ำมำรถตรึงไนโตรเจนได้
method) ในอำหำร
* กำรเลีย้ งจุ(growth
ลนิ ทรีย์ทสี่ estimation
ำมำรถตรึงไนโตรเจนได้
้
้ ปราศจากธาตุไนโตรเจน
่
เลียงเชื
อที
และวัดปริมำณจุลนิ ทรีย์
่ มขึ
่ นในเวลาที
้
่ าหนด
ทีเพิ
ก
* วัดนำ้ หนักแห้ งหรื อวัด optical density ทีเ่ ปลีย่ นแปลง
กำรนำแอมโมเนีย (NH3) ไปสร้ ำงสำรประกอบอินทรีย์
(Assimilation of Ammonia)
* แอมโมเนีย (NH3) หรื อแอมโมเนียมอิออน (NH4+) จะไม่ มี
การสะสมในเซลล ์พืชเพราะเป็ น
สำรพิษต่ อกระบวนกำร
เมแทบอลิซม
ึ
* แอมโมเนียจะถูกนำไปสร้ ำงเป็ นสำรประกอบอินทรีย์ พวก
กรดอะมิโน และ amide เพื่อนำไปใช้ ในกำร
สั งเครำะห์ โปรตีน
่ เรียก
และสารประกอบไนโตรเจนอืนๆ
ปฏิกริ ิยำที่เปลีย่ นแอมโมเนียเป็ นสำรอินทรีย์
ประกอบด้ วย 3 ปฏิกริ ิยำ
ดังนี้
1. ปฏิกริ ิยำทีถ่ ูก catalyst โดยเอนไซม์ glutamine
systhethase (GS) ดังสมกำร
glutamine
glutamate + NH3 + ATP
glutamine + ADP + Pi
Synthetase (GS)
2. ปฏิกริ ิยำทีถ่ ูก catalyst โดยเอนไซม์ glutamate
synthase (GOGAT) ดังสมกำร
glutamine+a -ketoglutarate + 2NADH GOGAT 2glutamate+2NAD+
สำหรับปฏิกริ ิยำที1
่ และ 2 อำจเขียนรวมได้ ดังนี้
Glutamine
a Ketogutaric acid
Glutamic acid
Glutamic acid
NH3
3. ปฏิกริ ิยำทีถ่ ูก catalyst โดยเอนไซม์ glutamic acid
dehydrogenase (GDH) และมี NADH+H+ เป็ นตัวให้
ไฮโดรเจน
HOOC-CH2-CH2CO-COOH + NH3
(a -ketoglutaric acid)
NADH+H+
GDH
HOOC-CH2-CH2(NH2)-COOH glutamic acid + NAD + H2O
Glutamine synthetase (GS)
GS จะคะตะไลซ์ glutamate ไปเป็ น glutamine
โดยใช้ ATP
GS ในพืชชั้นสู งจะมีลกั ษณะเป็ น octameric protein
มี MW 350-400 kDa
GS มีมำกในรำกพืชทีม่ ีกำรตรึงไนโตรเจน เช่ นในถัว่
(Phaseolus vulgaris)
Glutamic acid dehydrogenase (GDH)
GDH ถูกสร้ ำงในสำรละลำยทีม่ ี ammonia-nitrogen ต่ำมำก
GS (Glutamine synthetase ช่ วยให้ ammonia-nitrogen ทำ
ปฏิกริ ิยำกับ glutamic ได้ ดีกว่ ำ
ถ้า GS อยู่ในเซลล์ของใบจะอยู่ภำยในคลอโรพลำสต์ แต่ ถ้ำอยู่
้ อที
่ ไม่
่ มส
ในเนื อเยื
ี เี ขียวจะอยู ่ภายในไซโตพลา
ซึม
GS มีควำมว่ องไวในกำรจับตัวกับแอมโมเนียสู ง
เป็ นเอนไซม์ ที่มีขนำดใหญ่ MW 350-400 kDal ประกอบด้ วย
polypeptide หน่ วยย่ อย 8 หน่ วย
Enzyme nitrogenase
กำรศึกษำกระบวนกำรตรึง N2 เริ่มในช่ วงปี
1930 โดย Mc coy Wilson และ Burris แห่ ง
มหำวิทยำลัย W i s c o n s i n
enzyme nitrogenase เป็ น enzyme ทีใ่ ช้ ตรึง
N 2 กลุ่มแรกทีแ่ ยกได้ สำเร็จในหลอดทดลองในปี
ค.ศ. 1959 คือ Caronahan, Mortensen และ
V a l e n t i n e โดยสกัดจำก C l o s t r i d i u m
p a s t e u r i a n u m
กำรที่ไม่ สำมำรถแยก nitrogenase ได้ อำจเนื่องจำก
1. Enzyme nitrogenase จะถูก inactivate โดย
อุณหภูมิตำ่ (cold labile) ปกติในกำรแยก enzyme
มักทำที่ low temp .
2. Nitrogenase จะถูก inactivate โดย O2 ถึงแม้
O2 จะมีในปริมำณที่ต่ำๆ ก็ตำม
ดังนั้นกำรแยก enzyme นีต้ ้ องทำในสภำพที่
ไม่ มี O 2 ( a n a e r o b i c c o n d i t i o n )
3. กำรทำงำนของ nitrogenase ต้ องกำร ATP ด้ วย
4. ในกำร reduced N2 ไปเป็ น NH3 ต้ องอำศัย
s
t
r
o
n
g
r e d u c i n g
a g e n t
ต่ อมำพบว่ ำ ferredoxin เป็ น reducing agent
ในกระบวนกำรตรึง
N
สิ่ งที่จำเป็ นต้ องกำรตรึง N2 ในหลอดทดลอง
ประกอบด้ วย
1. Gas N2 (molecular nitrogen)
2.ต้ องมีสำรทีเ่ ป็ นตัว reduced กำลังสู งคือ ferredoxin
3.ATP หรื อ หรื อสำรที่ให้ ATP
4. Non heme iron protein (NHI) ซึ่งมี Mo เป็ นองค์
ประกอบ และ NHI อีกชนิดซึ่งไม่ มี Mo เป็ น
1966 Evans และคณะทดลองสกัด enzyme
nitrogenase จำกปมถั่วเหลือง ทำกำรทดลองที่ Oregen
USA ประสบควำมสำเร็จเนื่องจำกเทคนิค 3 ประกำรคือ
1. ไม่ ให้ O2 เข้ ำมำเกีย่ วข้ องกับกำรทดลอง
2. ป้องกับ phenol oxidase ไม่ ให้ มีในระบบเพรำะจะยับยั้ง
การตรึง N2
3. ใช้ gas liguid chromatog eraphy เป็ นเครื่ องมือในกำร
ทดสอบ ใช้ระบบ reduced gas acetylene ให้
เป็ น gas
ethylene
่
โครงสร ้างและหน้าทีของ
enzyme
Nitrogenase
(Structure and function of nitrogenase enzyme)
แบ่ ง nitrogenase เป็ นชนิดต่ ำงๆ คือ
1. Fe-Mo-protein (iron molybdenum protein)
อำจเรียกว่ ำ Azofermo เป็ น protein ทีไ่ วต่ อควำม
เย็น (cold labile) เดิมเรียก molybdoferredoxin มี MW
ระหว่ ำง 100,000-200,000 เป็ น protein ทีม่ ี
subunit ย่ อย
คือ a2 b2 ประกอบด้ วย Fe และ Mo บำงทีเรียกว่ ำ
component 1
ทำหน้ ำที่ reduce N2 ได้ เป็ น NH3
2. Fe-S protein (iron-sulfur protein)
เรียก Azofer เดิมเรียก Azoferredoxin เป็ น
protein ที่ sensitive ต่ อ O2 มี MW-50,000 - 80,000
ประกอบด้ วย 2 subunit ทีเ่ หมือนกันเรียก component
2
บำงระบบแบ่ ง enzyme nitrogenase เป็ น 3 ชนิด
คือ
1. Enzyme nitrogenase ทีป่ ระกอบด้ วย
molybdenum
และ Fe (Mo-nitrogenase)
2. Enzyme nitrogenase ทีป่ ระกอบด้ วย vanadium
และ
Fe (V-nitrogenase)
Molybdenum nitrogenase
Carnahan et al (1960) สกัด molybdenum
nitrogense จำก Clostridium pasteurianum
ทำให้ inactive โดย O2 และควำมเย็น
molybdenum nitrogenase ประกอบด้ วย protein
2 ชนิด
1. Molybdenum iron protein หรื อ
เรียกว่ ำ
protein 1 หรื อ dinitrogenase
2. Iron protein หรื อเรียกว่ ำ protein 2
หรื อ dinitrogenase reductase
Mo-Fe protein ประกอบด้วย a b
tetramer
มี MW 220 KDa โดย a -subunit มี MW 50 KDa
และ b - subunit มี MW 60 KDa Molecule ของ
molybdenum nitrogenase ประกอบด้วย
molybdenum, Fe, S ในอัตราส่ วน 2 Mo : 24-32 Fe
: 24-30 S ต่อโมเลกุล
Fe protein nitrogenase ion g2 dimer มี MW 5772 KDa ประกอบด้วย Fe4S4
2
2
สรุปคุณสมบัตขิ อง enzyme nitrogenase
1. ประกอบด้ วย protein 2 ชนิดคือ molybdenum
iron protein กับ iron protein
2. ถูกทำลำยโดย O2 ได้ ง่ำย
3. จะมี Fe และ Mo เป็ นส่ วนประกอบของ
molecule
4. ต้ องกำร Mg ion ในกำรทำงำน
5. ในขณะที่ทำงำนจะเปลีย่ น ATP ไปเป็ น ADP
6. ถูกยับยั้งกำรทำงำน โดย ADP
่
หน้าทีของ
enzyme nitrogenase คือ
reduced N2
ให้ เป็ น NH3
enzyme nitrogenase สำมำรถ reduced
สำรประกอบที่มี triple bond ได้ เกือบทุกชนิด
Eg
nitrogen
N
acetylene
HC
hydrogencyanide HC

H

N
N
กลไกที่ใช้ ในกำรป้องกัน ezyme nitrogenase ไม่ ให้
สั มผัสกับ O2 อิสระ
(Protective mechanism for nitrogenase)
enzyme nitrogenase จะถูก Oxidise ได้ ง่ำย
สำหรับพืชตระกูลถัว่ จะมีกลไกป้องกันไม่ ได้
enzyme nitrogenase ถูก oxidise โดยจะมีสำร
leghaemoglobin ในปมรำก
Leghaemoglobin จะมี cu เป็ นองค์ ประกอบทำ
ให้ มี
สี ชมพู
Leghaemoglobin ทำหน้ ำที่นำ O2 ทีอ่ ยู่ใน
intercellular space ออกไปห่ ำงจำกที่มีกำรตรึง
N2
่ ม ี leghaemoglobin
ในปมรากทีไม่
จะไม่ สำมำรถ
สำหร่ ำยทีต่ รึง N2 ได้ มักจะมีผนัง cell
หนำ
ซึ่งเป็ นโครงสร้ ำงทีป่ ้ องกันกำรซึมผ่ ำน
ของ O2 เข้ ำไปใน cell ได้ เป็ นอย่ ำงดี
สรุปกลไกกำรป้องกันไม่ ให้ enzyme nitrogenase
ถูก inactivate โดย free O2 คือ
1. มี leghaemoglobin เพื่อจับ O2 ไว้
2. มีอตั รำกำรหำยใจสู ง ทำให้ เกิดสภำพ anaerobic
condition
3. สร้ ำง heterocyst ซึ่ง cell ของ heterocyst จะมีผนัง
หนำ
4. สร้ ำงเมือก
enzyme nitrogenase จะถูก Oxidise ได้ ง่ำย
สำหรับพืชตระกูลถัว่ จะมีกลไกป้องกันไม่ได้
enzyme nitrogenase ถูก oxidise โดยจะมีสำร
leghaemoglobin ในปมรำก
บทบำทของ Leghaemoglobin ในกำรตรึง N2
leghaemoglobin ทีอ่ ยู่ทปี่ มรำกของพืช
ตระกูลถัว่ จะทำหน้ ำทีจ่ ับ O2 เพื่อให้ มี free O2 ใน
ปมน้ อยทีส่ ุ ด
ในปมรำกของพืชตระกูลถัว่ จะมีอตั รำกำร
หำยใจสู งเพื่อใช้ O2 และเพื่อให้ ได้ พลังงำนเพื่อ
นำไปใช้ ในกำรตรึง N2
ขั้นตอนกำรตรึง N2 (nitrogen fixing reaction)
ปฏิกริ ิยำกำรตรึง N2 แบ่ งเป็ น 3 ขั้นตอน
1. ไนโตรเจนถูก reduced เป็ น diimide (HN = NH)
2. Diimide ถูก reduced เป็ น hydrazine (H2N-NH2)
3. Hydrazine ถูก reduced เป็ น NH3
ปฏิกริ ิยำแต่ ละขั้นตอนมี e-, H-, ATP และ
enzyme nitrogenase เข้ ำทำปฏิบัติด้วยสำร diimide
และ hydrazine เป็ น intermediate
N=N
reduced
ferredoxin
2e-
ATP nitrogenase
HN-NH (diimide)
2enitrogenase
H2N-NH2 (hydraine)
2enitrogenase
2NH3
Intermediate คือ diimide และ hydrazine
จะติดแน่ นกับ enzyme และไม่ สำมำรถพบในรู ป
อิสระ เป็ นข้ อดี เพรำะ diimide และ hydrazine จะเป็ นพิษ
ต่ อเซลล์ พืช หำกอยู่ในรู ปอิสระ
nitrogenase เป็ น enzyme ทีไ่ ม่ เจำะจงกับ substrate
มำกนัก สำมำรถ reduced สำรอื่นได้ เช่ น acetylene, CO,
CN, และ N2O ดังนั้นสำรเหล่ ำนีถ้ ือเป็ น competitive
inhibitor ของกำร reduced N2
สรุปสมกำรกำรตรึง N2 ทีถ่ ูก catalyst
โดย nitrogenase
N2+8e-+8H++16ATP
2NH3+H2+16ADP+16Pi
Ammonia trapping
NH3 ทีเ่ กิดจำกปฏิกริ ิยำกำรตรึง N2 จะระเหยออก
จำก cell ได้ หำกไม่ ทำปฏิกริ ิยำกับสำรอื่น ดังนั้นเซลล์ จะ
มีกำรนำผลผลิตจำกกำรตรึงไนโตรเจนไปสร้ ำง
สำรประกอบอินทรีย์
ปกติ NH3 และ NH4+ สำมำรถเปลีย่ นกลับไปมำได้
ง่ ำย จึงเรียกรวมกันว่ ำ ammonia nitrogen ดังสมกำร
NH3+H2O
N H
+
4
+ O H
-
กำรนำผลผลิตกำรตรึงไนโตรเจน (NH3) ไปสร้ ำง
สำรประกอบอินทรีย์ (Assimilation of Ammonia)
NH3 ที่ได้ จำกกำรตรึง N2 ของแบคทีเรียและ
cyanobacteria จะไม่ มีกำรสะสมในเซลล์ พืช เพรำะ
เป็ นสำรพิษต่ อกระบวนกำร m e t a b o l i s m
NH3 จะถูกนำไปสร้ ำงสำรประกอบอินทรีย์
พวก amino acid และ amide เพื่อนำไปสั งเครำะห์
โปรตีนและสำรประกอบไนโตรเจนอื่นๆ
เรียกปฏิกริ ิยำนีว้ ่ ำ
assimilation of ammonia
หรื อ ammonia assimilation
ไนโตรเจนทีจ่ ะเข้ ำสู่ โมเลกุลของสำรอินทรีย์ได้
ต้ องถูกเปลีย่ นเป็ น NH3 ก่ อน
ปฏิกริ ิยำที่จะเปลีย่ น NH3 ให้ เป็ นสำรอินทรีย์มี 3
ปฏิกริ ิยำคือ
1. ปฏิกริ ิยำทีถ่ ูก catalyst โดย enzyme
glutamine synthethase (GS)
ในเซลล์ พืชเกือบทุกชนิดจะเก็บสะสม N2 ไว้
ในสำร glutamine เนื่องจำก cell พืชมี enzyme
glutamine synthetase (Miflin and Lea, 1987)
Glutamine
glutamate+NH3+ATP
synthetase
ADP+Pi
(GS)
glutamine +
2. ปฏิกริ ิยำทีถ่ ูก catalyst โดย enzyme
glutamate synthase (GOGAT) หรื อ glutamine :
2-oxoglutarate amino transferase
glutamine+ a -ketoglutarate + 2 NADH
glutamate
(GOGAT)
synthase
2 glutamate + 2 NAD+
ปฏิกริ ิยำ 1 และ 2 อำจเขียนรวมได้ ดงั นี้
Glutamine
NH3 GS
Glutamic acid
a -ketoglutaric acid
(oxoglutarate)
GOGAT
Glutamic acid
3. ปฏิกริ ิยำทีถ่ ูก catalyst โดย enzyme glutamic
caid dehydrogenase (GDH) และมี NADH+H+
หรื อ NAD(P)H เป็ นตัวให้ H+
a -ketoglutaric acid
G,H NADH+H+
glutamic acid+NAD+H2O
สรุป enzyme ทีเ่ กีย่ วข้ องกับกำร
เปลีย่ น
NH3 ให้ เป็ นสำรอินทรีย์คือ enzyme
glutamine synthase (GS)
glutamic acid dehydrogenase (GDH)
และ glutamate synthase (GOGAT)
Glutamine synthetase (GS)
GS จะ catalyst glutamate ไปเป็ น
glutamine โดยใช้ ATP ดังสมกำร
ATP
glutamate + NH3
glutamine
Mg+2
+ ADP+Pi
Enzyme GS มีขนำดใหญ่
มี MW 350-400 KDa
ประกอบด้ วย polypeptide
8 หน่ วยย่ อย
Glutamate synthase (GOGAT)
GOGAT หรื อเรียกว่ ำ glutamineoxoglutarate amino transferase GOGAT มีอยู่ 2
form คือ
1. ชนิดทีใ่ ช้ ferredoxin เป็ นตัวให้ e- (ferredoxindependent glutamate synthase) พบใน chloroplast
เป็ น protein ชนิด iron-sulfur favoprotein เป็ น
polypeptide มี MW ประมำณ 140-160 KDa
2. ชนิดที่ใช้ NADH เป็ นตัวให้ e- (NADHdependent glutamate synthase) พบใน plastid
ของ cell รำก
บำงตำรำกล่ ำวว่ ำ GOGAT มีอยู่ 3 form
คือ
1. Photosynthetic form
เป็ นชนิดที่ใช้ ferredoxin เป็ นตัวให้ e
(ferredoxin-dependent glutamate synthase)
พบใน chloroplast
2. อีก 2 form เป็ น non-photosynthetic form
ใช้ NADH หรื อ NADPH เป็ นตัวให้ e NADHdependent glutamate synthase พบใน plastid
ของรำก (Oaks and Hirel, 1981)
สำหรับ enzyme ที่เปลีย่ น amino acid
glutamate ไปเป็ น amino acid ชนิดอื่นๆ คือ
enzyme amino transferase
Amino transferase
รู้จักกันในชื่ อของ transaminase จะเป็ นตัว
catalyst และ transfer amino group จำก
ตำแหน่ งที่ 2 ของ amino acid ไปเป็ น 2 oxo
acid ให้ amino acid และ oxo acid ตัวใหม่
ปฏิกริ ิยำทีม่ ีกำรเพิม่ หมู่ amino ให้ กบั สำรอินทรีย์
ชนิดอื่น เรียก transamination และมี enzyme
aminotransferase เป็ นตัวเร่ งปฏิกริ ิยำ
glutamate จะถูกเปลีย่ นเป็ น amino acid
ชนิดอื่นๆอีก 19 ชนิด โดยมีกำรย้ ำยหมู่ amino
จำก glutamic โดย
transamination

ให้ แก่
a - keto acid
Amino acid 1
a ketoacid1
+a
keto acid2
+ amino acid2
R1
NH2
C COOH
+
R2 C
O
COOH
H
amino acid1
O
R1 C COOH
a -keto acid1
a -keto acid2
+
N
N
H2
R2
COOH
H
a m i n o a c i d2
Glutamate เป็ น major amino donor
aminotransferase enzyme สำมำรถ
catalyst ให้ เป็ น protein amino acid ทุกชนิด
ยกเว้ น proline ตัวอย่ ำงนำ้ หนักโมเลกุลของ
aspartate amino transferases จะมีค่ำระหว่ ำง
95-110 KDa ประกอบด้ วย 2 subunits แสดง
ปฏิกริ ิยำที่มี aspartate aminotransferase เป็ นตัว
catalyst ในกำรสร้ ำง amino acid
Glutamate + oxaloacetate
aspartate aminotransferase
2-oxoglutarate + Aspartate
glutamate + pyruvate
alanine aminotransferase
2-oxoglutarate + alanine
ตัวอย่ ำงปฏิกริยำกำรสร้ ำง aspartate
โดย enzyme aspartate aminotransferase
glutamate + oxaloacetate (OAA)
aspartate aminotransferase
a
- ketoglutarate + aspartate
หลังจำกนั้น aspartic acid ทำปฏิกริ ิยำกับ NH3
ได้ รับพลังงำนจำก ATP และมี enzyme
asparagine synthetase ได้ asparagine ดัง
สมกำร
ATP
aspartic acid + NH3
asparagine
ตัวอย่ ำงกำรสร้ ำง amino acid alaine
glutamate + pyruvate
alanine aminotransferase
a
- ketoglutarate + alanine
Glutamate เป็ นสำรตั้งต้ นของ amino
acid
หลำยชนิด เช่ น
aspartate
alanine
arginine
proline
glutamine เป็ นต้ น
Aspartate เป็ นสำรตั้งต้ น amino acid 5 ชนิด
คือ
asparagine
lysine
threonine
methionine
และ isoleucine
Pyruvate เป็ นสำรตั้งต้ นกำรสร้ ำง
alanine
Serine
Cysteine
Glycine
ใน cell พืช กำรสร้ ำง arginine นอกจำกจะเริ่มต้ นจำก
glutamate ยังอำจเริ่มต้ นจำก amonia ทำปฏิกริ ิยำกับ
CO2 ได้ Carbamyl phosphate ซึ่งถ้ ำทำปฏิกริ ิยำกับ
ornithine จะได้ arginine กับ citrulline
NH4+ + CO2
H2N-CO-OPO3H2
carbamyl phosphate
ornithine
arginine + citrulline
กำรขนส่ งสำรประกอบไนโตรเจนออกจำกปมรำก
พืชตระกูลถัว่
ถัว่ ทีอ่ ยู่ในเขตอบอุ่นเช่ น ถัว่ ลันเตำ และ
clover จะขนส่ งสำรประกอบ N2 ออกจำกปมรำก
เพื่อไปเลีย้ งส่ วนอื่นๆ ของพืชในรูปของ
asparagine
ดังนั้นพืชพวกนี้ glutamate จะถูกเปลีย่ นไป
เป็ น asparagine ตำมขึน้ ตอนต่ อไปนี้
glutamate + oxaloacetate (OAA)
aspartate aminotransferase
a -ketoglutarate + aspartate
ต่ อมำ aspartate ทำปฏิกริ ิยำกับ glutamine
ได้ asparagine ดังสมกำร
glutamate + aspartate
ATP
asparagine synthetase
glutamate + asparagine + ADP+Pi
ถัว่ ทีเ่ จริญในเขตร้ อน เช่ น ถัว่ เหลือง ถัว่ พุ่ม จะขนส่ ง
สำรประกอบไนโตรเจนออกจำกปมรำกในรู ปของสำร
ureides ซึ่งเป็ นอนุพนั ธุ์ของ Urea เช่ น allantoin, allantoic
acid และ citrulline
NH3 ซึ่งเป็ นผลผลิตจำกกำรตรึง N2 โดย enzyme
nitrogenaseใน rhizobium จะเคลื่อนทีผ่ ่ ำน plasma
membrane ของ Rhizobium และผ่ ำน peribacteroid
membrane ออกสู่ cytoplasm ของ cell เจ้ ำบ้ ำน ซึ่งจะมี
enzyme GS และ GOGAT และ NH3 จะนำไปสร้ ำงเป็ น
glutamate
ต่ อมำ glutamate จะเปลีย่ นไปเป็ น
glutamine และจะเปลีย่ นต่ อไปเป็ น purine ซึ่ง
จะถูก oxidise ไปเป็ น uric acid
Uric acid จะเคลื่อนที่จำก infected cell
เข้ ำสู่ ปมรำกทีไ่ ม่ มี rhizobium (uninfected cell)
แล้ วเปลีย่ นไปเป็ น allantoin โดยกิจกรรมของ
enzyme ภำยใน microbody
allantoin จะเปลีย่ นไปเป็ น allantoic
ภำยใน endoplasmic reticulum และ
ขนส่ ง allantoic acid ไปตำมท่ อ xylem
ไปให้
ส่ วนต่ ำงๆ ของพืชต่ อไป
ถึงแม้ ว่ำวิถีกำรสั งเครำะห์ ureides เช่ น allantoic
acid หรื อ allantoin จะยุ่งยำกกว่ ำกำรสั งเครำะห์
asparagine แต่ ureides เป็ นสำรประกอบที่
เหมำะสมในกำรขนส่ งไนโตรเจนในแง่ ประหยัด C
มำกกว่ ำ เพรำะแต่ ละโมเลกุลของ allantoic acid
หรื อallantoin มี C 4 atom และขนส่ ง N2 ได้ 4
atom ส่ วน asparagine 1 Molecule มี C atom
ขนส่ งไนโตรเจนได้ เพียง 2 atom เท่ ำนั้น
กระบวนกำร Nitrification
เป็ นกระบวนกำร oxidise NH3 ให้ เป็ น NO3โดย nitrifying bacteria มีข้นั ตอนเกิดขึน้ 2
ขั้นตอนคือ
ขั้นตอนที่ 1
nitrifying bacteria จะ oxidise NH3 ให้
เป็ น NO2- (nitrite)
ตัวอย่ ำง bacteria คือ nitrosomonase ในขั้นตอน
ที่ 1 ได้ ATP
++
NH4 3/2 O2
-+2H++H
NO2
2O
+ATP (66 kcal)
ปฏิกริ ิยำของกระบวนกำร nitrification ขั้นตอนที่
1 เป็ นกำรเปลีย่ น NH3 ให้ เป็ น NO2- เป็ นปฏิกริ ิยำ
กำรปลดปล่ อยพลังงำน bacteria พวก nitrifying
bacteria เป็ นสิ่ งมีชีวติ ที่สร้ ำงอำหำรได้ เองจำก
CO2 โดยใช้ พลังงำนจำกปฏิกริ ิยำเคมีเรียก
สิ่ งมีชีวติ พวกนี้
ว่ ำ Chemosynthetic autotroph หรื อ chemo
autotrophic microorganism
ขั้นตอนที่ 2
bacteria Nitrobacter oxidise nitrite ให้
เป็ น nitrate ได้ พลังงำนสร้ ำง ATP Nitrobacter
มี 2 specics คือ
Nitrobacter Winogradskyi
และ N. agilis
สมกำร oxidise nitrite ได้ เป็ น nitrate คือ
NO2 +1/2 O2
NO3 +ATP
(energy=18 Kca)
nitrification ที่เกิดขึน้ ต้ องใช้ O2 ดังนั้นในดินหรื อ
ในน้ำต้ องมี O2 ในปริมำณที่มำกพอที่ bact จะ
เจริญเติบโตได้
Nitrification จะเกิดได้ ดใี นบริเวณผิวดิน
หรื อผิวนำ้ เท่ ำนั้น เนื่องจำกต้ องกำร O2
ถ้ ำในดินหรื อนำ้ ที่ลกึ ลงไปมี O2 น้ อย
nitrification จะเกิดได้ น้อย
มักพบ bact พวก nitrifying bacteria ในดิน
ทั่วไปแต่ พบมำกในดินที่มี pH ตั้งแต่ 6 ขึน้ ไป
ดินที่มี Nitrosomonase อำศัยอยู่มักพบ
bact พวก Nitrobacter เสมอ
ถ้ ำในดินที่มี bacteria กลุ่มนีน้ ้ อยแล้วเติม
ammonia ลงไป ทำให้ bacteria เพิม่ ปริมำณอย่ ำง
รวดเร็ว
ในดินที่มี pH ต่ำกว่ ำ 6 หรื อดินที่เป็ นกรด จะมี
bact กลุ่มนีใ้ นปริมำณตำ่ หรื อไม่ มเี ลย
แต่ ถ้ำในทีม่ ีควำมเป็ นด่ ำงสู งเกินไปเช่ น pH
9.5 และมีปริมำณแอมโมเนียสู ง Nitrobacter จะ
ไม่ สำมำรถเจริญได้ ทำให้ มีกำรสะสมของ nitrite
ซึ่งเป็ นพิษต่ อพืชและจุลนิ ทรีย์ซึ่งจะเป็ น
ผลกระทบต่ อกำรเกษตร
ในดินที่มี pH ต่ำกว่ ำ 6 หรื อดินที่เป็ นกรด จะมี
bact กลุ่มนีใ้ นปริมำณตำ่ หรื อไม่ มเี ลย
แต่ ถ้ำในทีม่ ีควำมเป็ นด่ ำงสู งเกินไปเช่ น pH
9.5 และมีปริมำณแอมโมเนียสู ง Nitrobacter จะ
ไม่ สำมำรถเจริญได้ ทำให้ มีกำรสะสมของ nitrite
ซึ่งเป็ นพิษต่ อพืชและจลินทรีย์ ซึ่งจะเป็ น
ผลกระทบต่ อกำรเกษตร
ในกำรเปลีย่ นแอมโมเนียให้ เป็ น nitrite นั้น
จะมีกำร intermediate คือ hydroxylamine
และ hyponitrite ดังสมกำร
1/2O2
NH3
HO-NH2
1/2HO-N=N-OH
Hydroxylamine
hyponitrite
1/2 O2
HO-N=O nitrite
หลังจำกนั้น nitrite จะถูกเปลีย่ นเป็ น nitrate โดย
Nitrobacter
H2O
HO-N=O
nitrite
OH
HO-N
OH
-2H
HO-N
nitrate
O
O
Glutamate synthase (GOGAT)
(2-glutamine-oxoglutarate amino transferase)
* ถ้ ำอยู่ในเซลล์ ใบจะอยู่ภำยในคลอโรพลำสต์
* ถ้ ำอยู่ในเนื้อเยื่อทีไ่ ม่ มีสีเขียวจะอยู่ภำยในพลำ
สติด
* มี 3 form (isoenzyme) (ในพืชมี 2 ชนิดที่
- ชนิดที่ใใช้
ช้ ferredoxin เป็ นตัวให้ อเิ ลคตรอน
ferredoxine เป็glutamate
นตัวให้ e-)synthase) พบ
(ferredoxin-dependent
ใน
chloroplast เป็ นโปรตีนชนิด iron-sulfur favoprotein
MW ~ 140-160 KDa
- อีก 2 form เป็ น non photosynthetic form ใช้ NADH หรื อ
NADPH เป็ นตัวให้ e- (NADH-dependent glutamate synthase)
พบในพลำสติดของรำก
* Glutamate และ glutamine ทีไ่ ด้ จำกกิจกรรมของ
GS/GOGAT ดังสมกำร
Glutamate + NH3 + ATP
GS
Glutamine+a-ketoglutarate+2NADH
Glutamine + ADP + Pi
GOGAT
2Glutamate+2NAD+
* Glutamate เป็ นต้ นตอ ในกำรสั งเครำะห์ amino aicd ชนิดต่ ำงๆ
Glutamine
- Tryptpphan - Arginine
- Histidine - Ureides
- Asparagine
Glutamate
- Proline
- Arginine
* เอนไซม์ ที่เกีย่ วข้ องกับกำรเปลีย่ น amino acid glutamate
ไปเป็ น amino acid ชนิดอื่นๆ คือ เอนไซม์ amino transferase
Amino transferase หรื อ transaminase
* มีกำร catalyse และ transfer ของ amino group จำกตำแหน่ งที่
2 ของ amino acid ไปเป็ น 2 oxo acid ได้ amino acid ตัวใหม่
และ oxo acid ตัวใหม่
* glutamate เป็ น major amino donor เกิดปฏิกริ ิยำสำคัญ 2 ปฏิกริ ิยำ
* ทั้ง 2 ปฏิกริ ิยำให้ 2-oxoglutarate (เข้ ำ glutamate synthase cycle)
* aminotransferase ในพืชสำมำรถสั งเครำะห์ เป็ น protein
amino acid ทุกชนิด (ยกเว้ น proline)
* ดังนั้น N2 สำมำรถ distributed จำก glutamate เพื่อนำไปสร้ ำง
amino acid ทุกชนิด
แสดงปฏิกริ ิยำ aspartate aminotransferase และ alanine aminotransferase
Transamination
่ การเพิมหมู
่
เป็ นปฏิก ิรย
ิ าทีมี
่อมิโน (amino
่ โดยมีเอนไซ
ให้ก ับสารอินทรีย ์ชนิ ดอืน
เป็ นตัวเร่ งปฏิกริ ิยำ
glutamate จะถูกเปลีย่ นเป็ นกรดอมิโน ชนิดอื่น 19 ชนิด
่ าเป็ นสาหร ับการสร ้างโปรตีน
ทีจ
O
NH2
R - C - COOH + R2 - C - COOH
H
amino acid1
a- keto acid2
O
R1 - C - COOH
a - keto acid1
+
NH2
R2 - C - COOH
H
amino acid2
แสดงปฏิกริ ิยำ transamination
Glutamate + oxaloacetate (OAA)
Aspartate aminotransferase
α- ketoglutarate + arpartate
HOOC - CH2 - CH(NH2) - COOH (aspartic acid)
+ NH3
+ ATP
- ADP
-P
HOOC - CH2 - CH2CH(NH2) - CO(NH2) asparagine
glutamate + pyruvate
Alanine aminotransferase
α- ketoglutarate + alanine
NH4+
+ CO2
+ ATP
- ADP
- H+
H2N - CO - OPO3H2
Carbamyl phosphate
+ ornithine
- citrulline
HOOC - CH(NH2) - CH2 - CH2 - CH2 -NH C(NH2) - NH2
arginine
กำรขนส่ งสำรประกอบไนโตรเจนออกจำกปมรำกพืชตระกูล
* ถั่วทีเ่ จริญอยู่ในเขตอบอุ่น เช่ น ถั่วลันเตำ และ
clover
จะมีกำรขนส่ งสำรประกอบไนโตรเจนออกจำกปม
รำก
นอื่นๆ ในรูจะถู
ปของ
asparagine
* ไปยั
ดังนัง้ นส่ วglutamate
กเปลี
ย่ นเป็ น asparagine
้
ในขันตอน
ต่อไปนี ้
ขั้นตอนกำรเปลีย่ น glutamate เป็ น Asparagine
* ถัว่ ทีเ่ จริญในเขตร้ อน เช่ นถัว่ เหลือง ถัว่ พุ่ม จะมีกำรขน
ส่งสารประกอบไนโตรเจนในรู ปสาร
ureides (อนุพนั ธ์
ของยูเรีย เช่ น allantoin, allantoic acid และ citrulline)
* ใน Rhizobium ทีอ่ ยู่ในปมรำกถัว่ ไม่ มี GS และ GOGAT
* นักวิทยำศำสตร์ เชื่ อว่ำ แม้ ว่ำวิถีกำรสั งเครำะห์ ureides
จะยุ่งยำกกว่ ำกำรสั งเครำะห์ asparagine แต่ ureides
เป็ นสำรประกอบทีเ่ หมำะสมสำหรับกำรขนส่ ง N2
ในแง่ ทปี่ ระหยัด C มำกกว่ำ
กระบวนกำร Nitrification
* เป็ นกระบวนกำร oxidise ammonia (NH3) ให้ เป็ น NO3- โดย
nitrifying bacteria (เช่ น Nitrosomonas) มีข้นั ตอนเกิดขึน้ 2 ขั้นตอน คือ
ขั้นตอนที่ 1
NH4+ + 3/2 O2
NO2- + 2H+ + H2O + ATP (energy, 66 Kcal)
* nitrifying bacteria จะ oxidise NH3 ไปเป็ น NO2- (nitrite)
* ได้พลังงานมาสร้าง ATP
* นาพลังงานนี้ไปใช้ reduced CO2 เป็ นน้ าตาล แทนที่จะใช้ พลังงำนแสง
* bact. พวกนี้สร้างอาหารได้เองจาก CO2 เป็ น
“Chemosynthetic autotroph หรื อ
Chemoautotrophic microorganism”
ขั้นตอนที่ 2
* แบคทีเรีย Nitrobacter จะ oxidise nitrite ให้ เป็ น nitrate
* ได้ พลังงำนพอที่จะสร้ ำง ATP
* Nitrobacter มี 2 ชนิด คือ N. winogradskyi และ N. agilis
NO2- + 1/2O2
NO3- + ATP (energy = 18 Kcal)
* nitrification จะต้ องใช้ O2 ในปริมำณมำกพอที่ bact. จะเจริญได้
* bact. จะ oxidize ammonia-nitrogen ให้ เป็ น nitrate ดังนั้น
nitrification จะเกิดขึน้ ได้ ดีในบริเวณผิวดิน หรื อผิวนำ้ เท่ ำนั้น
* ถ้ ำดินมีควำมเป็ นด่ ำงสู งเกินไป และมี ammonia สู ง จะมีกำรสะสม
ไนไตรท ์ ส่งผลเสียต่อการเกษตร เพราะ ไน
ไตรท์ เป็ นพิษต่ อพืชและ
จุลน
ิ ทรีย ์
* ในกระบวนกำรเปลีย่ นแอมโมเนียเป็ นไนไตรท์ คำดว่ ำมีสำรที่
เป็ น
intermediate คือ hydroxylamine
และ hyponitrite ดัง
-2H
NH3 1/2 O2 HO-NH2
1/2HO-N=N-OH 1/2 O2 HO-N=O
สมกำร Hydroxylamine
hyponitrite
nitrite
* สำรพวก hyponitrite เป็ นสำรที่ไม่ stable
H2O
HO-N=O
HO-N
OH
-2H
O
HO-N
OH
nitrite
O
nitrate
Nitrate Reduction
กำรนำไนเตรทไปสร้ ำงเป็ นสำรประกอบอินทรีย์ (nitrate
assimilation)
* กำรดูดไนเตรทในเซลล์ รำกเป็ นกระบวนกำรขนส่ งแบบ active ที่
ต้องใช้พลังงานและต้องมีสารตัวพา (carrier)
ที่จำเพำะเจำะจง
* สำมำรถเพิม่ ปริมำณ carrier protein( ที่จะพำ NO3- )ในรำกพืชที่
ยัง
ไม่ เคยได้ รับ NO3- ได้ โดยกำรให้ ป๋ ุย NO3* NO3- ที่เข้ ำสู่ รำกอำจจะถูกขนส่ งสู่ ลำต้ นทำง xylem
* พืชไม่ สำมำรถนำ NO3- ไปใช้ ได้ โดยตรง ต้ อง reduced เป็ น NH4+
ก่ อน โดยกระบวนกำร nitrate reduction
* พืชบำงชนิดอำจ reduced NO - ที่รำกหรื อใบ แต่ ส่วนมำกเกิดขึน้
* กำร reduced NO3- ให้ เป็ น NH3 จะต้ องใช้ อเิ ลคตรอน 8
อนุภำค/1
โมเลกุ
ล
ของ
NO
* กำร reduction ของ NO -3 ประกอบด้ วยปฏิกริ ิยำ 2 ขั้นตอน คือ
3
ขั้นตอนที่ 1
# คือกำร reduced nitrate (NO3-) เป็ น nitrite (NO2-) โดยกิจกรรม
ของเอนไซม ์ nitrate reductase (NR)
NO3- + 2H+ + 2e-
NO2- + H2O
# NR เป็ นเอนไซม์ ทอี่ ยู่ใน cytoplasm ของรำกหรื อใบ และมีสำร
่ e- และโปรตอนที่มำจำกปฏิกริ ิยำกำรสั งเครำะห์ แสงและกำร
ทีให้
หายใจ
ขั้นตอนที่ 2
- NO2- จะเคลื่อนที่เข้ ำสู่ พลำสติดแล้ วถูก reduced ให้ เป็ น NH4+
โดยกิจกรรมของเอนไซม์ nitrite reductase ดังสมกำร
NO2- + 8H+ + 6e-
NH4+ + 2H2O
แสดงวิถี nitrate reduction (Dennis and Turpin, 1990)
เอนไซม์ Nitrate reductase
* เป็ นเอนไซม์ ที่พบทั้งในแบคทีเรียและพืช
* MW 200-270 Kdal ประกอบด้ วยหน่ วยย่ อยที่เหมือนกัน 2
หน่ วย
* จัดเป็ น molybdoflavo protein หรื อพวก flavin nucleotide
มี Mo และ flavin เป็ นส่ วนประกอบเกำะแน่ นอยู่กบั เอนไซม์
้ า flavo protein และมี Mo
เรียกสารประกอบนี ว่
* flavin ทีร่ วมอยู่กบั เอนไซม์ ได้ แก่ FAD (ทำหน้ ำทีเ่ ป็ น
เป็ น cofactor
prosthetic group)
แสดงโครงสร้ ำงของ
nitrate reductase
* เอนไซม์ nitrate reductase จะได้ รับอิเลคตรอนจำก
NADH ซึ่งเป็ นสำรที่ได้ จำกปฏิกริ ิยำกำรหำยใจ ดังนี้
NO3- + NADH + H+
2e+ NAD+ + H2O
NO2-
* NADH ถ่ ำยทอดe- ไปยังหมู่ flavin ของเอนไซม์ ทำให้
FAD
ถูก reduced ไปเป็ น FADH2 ซึ่ง FADH2 จะถูกถ่ ำยทอด
eไปยัง Mo (อยู่ในรู ปของ oxidise MO+6) ทำให้ สำรนี้
ถูก
+5
+5 +5
NADH
FAD
MO
NO
reduced เป็ น MO (ในรู ป reduced) จะถูกถ่ ำยทอด3 e
ให้แก่ nitrate ทำให้ nitrate ถูก reduced เป็ น nitrite
NAD
FADH2
MO+6
NO2-
* ลำดับกำรถ่ ำยทอด e- จำก NADH ไปยัง NO3- ผ่ ำน
หมู่
prosthetic ของเอนไซม์ nitrate reductase คือ
NADH
FAD
heme
molybdenum complex
* สำหรับเอนไซม์ nitrate reductase ที่อยู่ใน
แบคทีเรีย
จะใช้ ferredoxin เป็ นตัวให้ อเิ ลคตรอน
NO3-
องค์ ประกอบทีม่ ีอทิ ธิพลต่ อ
nitrate reductase ได้ แก่
1. NO32. Mo
3. แสง
4. ฮอร์ โมน
Nitrate Reduction
กำรนำไนเตรตไปสร้ ำงเป็ นสำรประกอบ
อินทรีย์ (nitrate assimilation)
กำรดูด nitrate ใน cell ของรำก เป็ น
กระบวนกำรขนส่ งแบบ active ต้ องใช้ พลังงำน
และต้ องมีสำรตัวพำ (carrier) ที่เฉพำะเจำะจง
จากการศึกษาพบว่า plasma
membrane ของรำกพืชที่ยงั ไม่ เคยได้ รับ nitrate
มำก่ อนจะมี carrier protein ที่จะพำ NO3- อยู่
เพียงเล็กน้ อยทำให้ รำกพืชดูด NO3- ได้ ในอัตรำที่
ต่ำ ถ้ ำให้ NO3- ไประยะเวลำหนึ่ง พบว่ ำกำรดูด
NO3- จะเพิม่ ขึน้ 2-5 เท่ ำ เนื่องจำกมีกำร
สั งเครำะห์ carrier protein เพิม่ ขึน้ เมื่อถูกชักนำ
โดยกำรให้ ป๋ ยุ NO3-
NO3- ทีเ่ ข้ ำสู่ รำกพืชจะถูกขนส่ งขึน้ สู่ ลำต้ นทำง
xylem และสะสมไว้ ในรำกหรื อถูก reduced ภำยใน
cell ของรำก
พืชไม่ สำมำรถนำ NO3 ไปใช้ ในกำรสร้ ำง
สำรอินทรีย์ได้ โดยตรง NO3- จะต้ องถูก reduced เป็ น
NH4+ เสี ยก่ อน
กำร reduced NO3- ได้ เป็ น NH4+ เรียก nitrate
reduction เป็ นขั้นตอนทีเ่ กิดในพืชทุกชนิ
พืชบำงชนิด reduced NO3- ภำยใน cell ของรำกพืชบำง
ชนิดขนส่ ง NO3- ไปที่ cell ของใบแล้ว reduced
NO3- ได้ เป็ น NH4+ ภำยใน cell ของใบพืชบำงชนิด
สำมำรถ reduced NO3- ได้ เป็ น NH4+ ได้ ท้งั ใน cell
ของรำกและ cell ของใบ
แต่ ส่วนใหญ่ กระบวนกำร nitrate reduction เกิด
ทีใ่ บเนื่องจำกพบ enzyme ทีเ่ กีย่ วข้ องกับกระบวนกำร
nitrate reduction เป็ นจำนวนมำกทีใ่ บ
มีผู้ศึกษำพบว่ ำกิจกรรมของ enzyme nitrate
reductase ในใบจะสู งกว่ ำในรำก (ถ้ ำหำกคิดเป็ น
กิจกรรมของ nitrate reductase ต่ อหน่ วย
น้ำหนักสด)
แต่ ถ้ำคิดเป็ นกิจกรรมต่ อหนึ่งหน่ วย
protein ในเนื้อเยื่อรำกจะพบมำกกว่ ำในใบแต่ ถ้ำ
ในระดับ cell จะพบ enzyme นีใ้ น cytoplasm
กำร reduced NO3- ได้ เป็ น NH3 ต้ องใช้ e- 8
อนุภำค/1 โมเลกุลของ NO3กำร reduction ของ nitrate ประกอบด้ วย 2
ขั้นตอนคือ
ขั้นตอนที่ 1
กำร reduced nirtrate (NO3- ) ให้ เป็ น nitrite
(NO2- ) โดยกิจกรรมของ enzyme nitrate reductuse
(NR) (Beevers and Haquneman, 1983)
NO3- + 2H+ + 2e-
NO2 + H2O
enzyme nitrate reductase เป็ น enzyme
ทีอ่ ยู่ใน cytoplasm ของ cell รำกหรื อ cell ใบ
มีสำรทีใ่ ห้ e- และ H+ มำจำกปฏิกริยำ
กำรสั งเครำะห์ ด้วยแสงและกำรหำยใจ เช่ น
NADPH+H+ หรื อ NADH+H+
ดังสมกำร
NO3
-+NAD(P)
+
H+H
-+NAS(P)
NO2
+ H
2
O
ขั้นตอนที่ 2
NO2- จะเคลื่อนทีเ่ ข้ ำสู่ plastid ในกรณีของ cell
รำกหรื อ chloroplast ในกรณีของ cell ใบ
จำกนั้น NO2- จะถูก reduced ให้ เป็ น NH4+
โดยกิจกรรมของ enzyme nitrite reductase ดัง
สมกำร
NO3- + 8H+ + 6eNH4 + 2H2O
จำกกำรศึกษำปฏิกริ ิยำกำร reduce NO3- ให้
เป็ น NH3 ปฏิกริ ิยำ oxidation reduction ที่เกิดขึน้
จะเกีย่ วข้ องกับ e- ขั้น 2 อนุภำค ดังนั้นน่ ำจะมี
intermediate อย่ ำงน้ อย 3 ตัวมำเกีย
่ วข้ อง
ดังนั้นปฏิกริ ิยำที่น่ำจะเป็ นไปได้ คือ
NAPH or NADH
NO3nitrate
NO2
nitrite
N2O2
hyponitrite
NH2OH hydroxyamine
reduetase
NH3 ammonia
NO2- เป็ นอิออนที่เป็ นพิษต่ อ cell พืชดังนั้นกำร
+
reduced NO2 ให้ เป็ น NH4 จะเกิดอย่ ำงรวดเร็ว
พืชจะสร้ ำง enzyme nitrite reductase ไว้ ใน
+
ปริมำณทีส่ ู งมำก NH4 ที่เกิดขึน้ จะเปลีย่ นเป็ น
สำรประกอบอินทรีย์อย่ ำงรวดเร็วโดยกิจกรรม
ของ enzyme glutamine synthethase (GS) และ
glutamate synthase (GOGAT)
Enzyme Nitrate reductase
Nitrate reductase เป็ น enzyme ที่พบ
ทั้งใน bacteria และในพืช
nitrate reductase เป็ น molybdoflavo
protein เป็ นพวก flavin nucleotide มี Mo และ
flavin เป็ นส่ วนประกอบเรียกสำรประกอบนีว้ ่ ำ
flovo protein มี Mo เป็ น cofactor
Flcvin ทีร่ วมอยู่กบั enzyme คือ FAD ทำหน้ ำที่เป็ น
prosthetic group
nitrate reductase ในพืชมีขนำด
molecule ประมำณ 200-270 kdal
ประกอบด้ วย two identical subunit (หน่ วย
ย่ อย 2 หน่ วยที่เหมือนกัน) แต่ ละหน่ วยย่ อยมี
นำ้ หนักโมเลกุลประมำณ 100-120 kdal
Nitrate reductase เป็ น enzyme ประเภท
adaptive enzyme คือ
ถ้ ำพืชเจริญอยู่ในสภำพทีม่ ี N2 หรื ออยู่
ในรูปของ NH4+ หรื อสำรอินทรีย์ชนิดต่ ำงๆ
enzyme ชนิดนีจ้ ะไม่ ถูกสร้ ำงขึน้
สรุป nitrate reductase แต่ ละหน่ วยย่ อย
ประกอบด้ วย 3 prosthetis groups คือ
1. FAD (Flavin adenine
dinucleotide)
2. Heme (cytochrome 557 (cyt6)
3. Molybdenum cofactor (Moco)
ถ้ ำปลูกพืชในดินทีข่ ำด Mo กิจกรรมของ
nitrate reductase จะตำ่ มำกทำให้ พืชใช้ ป๋ ุย
NO3 ไม่ ได้
ถ้ ำพืชเจริญในที่มี nitrate พืชจะสร้ ำง
enzyme nitrate reductase ขึน้ มำจะ reduce
nitrate ให้ เป็ น nitrite
enzyme nitrite reductaec ในพืชจะได้ รับ e
จำก NADH ซึ่งเป็ นสำรที่ได้ จำกกำรหำยใจ
ดังสมกำร
2e
NO3
+
+
NADH+H
+NAD++H2O
NO2
NADH ถ่ ำยทอด e- ไปยังหมู่ flavin ของ
enzyme ให้ FAD ถูก reduced ไปเป็ น FADH2
และถ่ ำยทอด e- ไปยัง Mo ซึ่งอยู่ในรูปของ
oxidise form Mo+6 ซึ่งจะถูก reduced เป็ น
Mo5 ซึ่งจะถูกถ่ ำยทอด e- ให้ nitrate ทำให้
nitrate ถูก reduced เป็ น nitrite
NADH
FAD
Mo+5
NO3+5
NAD
FADH2
MO+6
N O
2
-
ลำดับกำรถ่ ำยทอด e- จำก NADH ไปยัง NO3ผ่ ำนหมู่ prosthetic ของ enzyme nitrate
reductase คือ
NADH
FAD
heme
molybdenum
complex
NO3
-
องค์ ประกอบที่มีอทิ ธิพลต่ อ nitrate reductase
ได้ แก่
1. NO3ถ้ ำมีน้อย กำรกระตุ้นกำรสร้ ำง enzyme มี
น้ อย เนื่องจำก nitrate reductase เป็ น
inducible enzyme คือ substrate กระตุ้นกำร
สร้ ำง enzyme ถ้ ำไม่ มี substrate จะไม่ มี
enzyme
2. Mo
กระตุ้นกำรสร้ ำง enzyme เช่ นเดียวกับ NO3
3. แสง
ไม่ ได้ มีอทิ ธิพลโดยตรงต่ อกำรสร้ ำง
nitrate reductase ถ้ ำให้ glucose แทนแสง
ก็ทำให้ มีกำรสร้ ำง nitrate reductase ได้ เช่ นกัน
อำจกล่ ำวว่ ำกระบวนกำรหำยใจมีผลต่ อ
กำรสร้ ำง nitrate reductase
4. ฮอร์ โมน
Cytokinin จะกระตุ้นกิจกรรมของ
nitrate reductase มำกกกว่ ำฮอร์ โมนอื่น
Enzyme Nitrate reductase
Nitrate reductase เป็ น enzyme ทีอ่ ยู่ใน
chloroplast ของ cell ของใบหรื ออยู่ใน plastids
ของ cell รำก
เป็ น enzyme ที่ทำหน้ ำที่เปลีย่ น nitrate ให้
เป็ น NH4+ เป็ น enzyme พวก Flavoprotein
เช่ นเดียวกับ nitrate reductase แต่ มี Fe และ Cu
เป็ นส่ วนประกอบที่สำคัญ
Electron จำก ferredoxin จะถูกถ่ ำยทอดให้ แก่
iron-sulfur cluster ต่ อจำกนั้นจะถ่ ำยทอดให้
หมู่ heme ซึ่งจะนำ e- ไป reduced NO2- ได้
เป็ น NH4ในส่ วนของพืชที่ไม่ มีกำรสั งเครำะห์ ด้วย
แสง สำรที่ให้ e- แก่ nitrite อำจเป็ น NADH
และ NADPH
Nitrite reductase ใน chloroplast ของใบจะ
catalyst ปฏิกิริยา reduction ของ nitrite โดย
จับ e- จาก ferredoxin ดังปฏิกิริยา
6e
NO2-+6Fdred+8H+
NH4++6Fd(ox)+2H2O
้
ขันตอนการ
reduced nitrite ให้ เป็ น NH3+
้
อาจเขียนได้ตามขันตอนต่
อไปนี ้
2eNO2-
(HNO)
(H2NOH)
NH3
hyponitrous
hydroxyl
+H2O
acid
amine
hyponitrous acid และ hydroxyl amine เป็ น
intermediate ทีต่ ดิ แน่ นอยู่กบั enzyme แยกออกยำก
กระบวนกำร Denitrification
nitrate จะละลำยนำ้ ได้ ดมี ำก จึงสู ญเสี ยไปกับ
กำรไหลของน้ำเป็ นปริมำณมำก
nitrate บำงส่ วนจะสู ญเสี ยไปจำกดิน
(Volatilization) โดยกำร reduced ของ bacteria
บำงชนิดกลำยเป็ น gas N2 ระเหยไปในบรรยำกำศ
เรียกกระบวนกำรนีว้ ่ ำ denitrification
Bacteria ที่สำมำรถ reduced nitrate หรื อ nitrite
ให้ เป็ น nitrogen เรียกว่ ำ denitrieying bacteria
ต.ย. Bacteria พวกนีค้ ือ Thiobacillus
denitrificans Pseudomonas denitrificans
Micrococcus, deniftrificans
ปฏิกริ ิยำกำร reduce Nitrate ให้ เป็ น N2
ประกอบด้ วย 4 ขั้นตอนคือ
NR
ขั้นตอนที่ 1
ขั้นตอนที่ 2
ขั้นตอนที่ 3
ขั้นตอนที่ 4
NO2NO2NO
N 2O
NO2NO
N 2O
N2
กำร reduced nitrate ให้ เป็ น nitrite ในขั้น
แรกต้ องใช้ nitrate reductase เช่ นเดียวกับที่
เกิดในปฏิกริ ิยำ nitrate reduction
สิ่ งมีชีวติ เกีย่ วข้ องกับกระบวนกำร denitrification
bacteria ทีม่ สี ่ วนเกีย่ วข้ องกับกระบวนกำร
denitrification ของ nitrate คือ Pseudomonas
Aoehromobacter, Bacillus, Micrococcus, Thiobacillus
และ Denitrificans
สำหรับ Pseudomonas และ Achromobacter เป็ น
bact ทีส่ ำคัญมำก มีกจิ กรรมมำกทีส่ ุ ดในดิน
สำหรับ bacteria ที่เกีย่ วข้ องกับ
denitrification ของ nitrite คือ
Bacillus pyocyaneus
Peudomonas aeruginosa
Thiobacillus denitrificans
Bacillus Subtillis
ปฏิกริ ิยำ denitrification จะเกิดขึน้ เฉพำะในที่ที่
ขำด O2 เท่ ำนั้น ซึ่งตรงข้ ำมกับปฏิกริ ิยำ
nitrification ซึ่งเกิดเฉพำะในที่มี O2 เท่ ำนั้น
ปฏิกริ ิยำ denitrification อำจเรียกว่ ำ
dissimilation of nitrate โดย NO3- จะถูก
เปลีย่ นเป็ น N2 โดย bacteria พวก denitrifying
bacteria
NO3 ถูกชะล้ ำงออกจำกดินได้ ง่ำย นอกจำกนีย้ งั
สู ญหำยจำกดินโดย denitrifying bacterin ซึ่ง
จะเปลีย่ น NO3 ให้ เป็ น N2 ดังนั้นดินซึ่งมักขำด
N2
ดังนั้น biological N2 fixation จึงเป็ น
กระบวนกำรที่มีควำมสำคัญในกำรเพิม่ N2
ได้ แก่ ดิน
เอนไซม์ Nitrite reductase
๏ อยู ่ในคลอโรพลาสต ์ของเซลล ์ใบ
หรื อในพลำสติคของเซลล์ รำก
่
่
๏ ทาหน้าทีเปลี
ยน
nitrite ให้ เป็ น NH4+
๏ เป็ นเอนไซม์ พวก Flavoprotein มี Fe และ Cu เป็ น
ส่ วนประกอบสำคัญ
่ MW ประมำณ 60 Kdal มีหมู่
๏ เป็ นโปรตีนทีมี
prosthetic 2 หมู่
(4Fe 4S ironsulfur Cluster) กับหมู่ heme
๏ สำรทีใ่ ห้ e- แก่ nitrite ได้ แก่ ferredoxin
๏ Ferredoxin อยู่ในสภำพทีถ่ ูก reduced ได้ จำก
ปฏิกริ ิยำแสงจำกกระบวนกำรสั งเครำะห์ แสง
๏ Ferredoxin จัดว่ ำเป็ นสำรทีม่ กี ำลัง reduced สู ง
มำก สำมำรถ reduced nitrite ให้ เป็ น NH4+
Light
Light reactions
in photosynthesis
Ferredoxin
(reduced)
e-
H+
(Fe4S4) Heme
Nitrite reductase
Ferredoxin
(oxidized)
NO-2
nitrate
NH4+
ammonia
แสดงกระบวนกำรรีดวิ ส์ nitrite โดย nitrite reductase
(Taiz and Zeiger, 1990)
@ พืชที่ไม่ มีกำรสั งเครำะห์ แสง สำรที่ให้ e- แก่ nitrite
อำจเป็ น NADH และ NADPH
@ Nitrite reductase ในคลอโรพลำสต์ ของใบจะ catalyst
ปฏิกริ ิยำ reduction ของ nitrite ดังปฏิกริ ิยำ
6eNO2- + 6Fered + 8H+
NH4+ + 6Fd(ox) + 2H2O
@ Nitrite ที่มีปริมำณมำกเกินไปจะเป็ นอันตรำย
้ ช และสัตว ์
ทังพื
NO2-
2e-
2e-
(HNO)
hyponitrous acid
2e-
(H2NOH)
NH3 + H2O
hydroxyl amine
@ HNO และ H2NOH เป็ น intermediate
แยกออกจำกเซลล์ ไม่ ได้
กระบวนกำร Denitrification
# ไนเตรทบำงส่ วนอำจสู ญเสี ยไปจำกดินโดยกำร reduced
ของแบคทีเรียบางชนิ ดกลายเป็ นก๊าซ
N2 ระเหยไปใน
้ า
บรรยากาศ เรียกกระบวนการนี ว่
#
แบคทีเรียที่ reduced nitrate หรื อ nitrite ให้ เป็ นไนโตรเจน
Denitrification
เรียก denitrifying bacteria ได้ แก่ Thiobacillus
denitrificans,
Pseudomonas denitrificans, Micrococcus denitrificans
# ในสภำพที่ขำด O2 แบคทีเรียจะใช้ nitrate
ในกำร oxidize substrate แทนกำรใช้ O2
# ปฏิกริ ิยำกำร reduce ไนเตรทให้ เป็ น N2
ประกอบด้ วย 4 ขั้นตอน ดังนี้
ขั้นตอนที่ 1 NO3NO2ขั้นตอนที่ 2 NO2NO
ขั้นตอนที่ 3 NO
N2O
ขั้นตอนที่ 4 N2O
N2
สิ่ งมีชีวติ ที่เกีย่ วข้ องกับกระบวนกำร denitrification
แบคทีเรียที่เกีย่ วข้ องในกระบวนกำร denitrification
ของไนเตรต คือ Pseudomonas, Achromobacter,
Bacillus, Mirococcus, Thiobacillus และ Denitrificans
จุลนิ ทรีย์บำงพวกที่เป็ น chemoautotrops คือพวกที่ใช้ อนิ
นทรีย์สำรเป็ นแหล่ งของพลังงำน และใช้ อนินทรีย์
คำร์ บอนเป็ นแหล่ งของคำร์ บอน เช่ น Mirococcus
denitrificans และ Thiobacillus denitrificans
ตัวอย่ ำงของปฏิกริ ิยำ denitrification โดยแบคทีเรีย
Thiobacillus denitrificans จะเปลีย่ น nitrate ให้ เป็ น N2
ในสภำพที่มี H2O และ S
5S + 6KNO3 + 2H2O
3N2 + K2SO4 + 4KHSO4
5K2S2O3 + 8KNO3 + H2O
4N2 + 9K2SO4 + H2SO4
กลไกของกระบวนกำร denitrification
เกิดจำกจุลนิ ทรีย์ใช้ ไนไตรท์ หรื อไนเตรตเป็ นตัวรับ eเมื่อ O2 ไม่ เพียงพอหรื อขำด O2ไนเตรตหรื อไนไตรท์
จะถูกลด O2 จนได้ N2 ดังสมกำร
NO-3
nitrate
NO-2
nitrite
(HNO)
nitroxyl
NO
nitric oxide
-H2O
H2N2O2
N2O
hyponitrite
N2
กระบวนกำร Ammonification
่
กระบวนการเปลียนแปลง
สำรอินทรีย์ให้ เป็ น
ammonia ammonia ที่ได้ อำจทำปฏิกริ ิยำกับสำรอื่น
เช่ น H2O หรื อ CO2 ได้ ammonia ion หรื อเกลือ
แอมโมเนีย เช่ น (NH4)2CO3
Ammonifiers เป็ นจุลนิ ทรีย์ที่เกีย่ วข้ องกับกำรแปร
สภำพจำกสำรอินทรีย์เป็ นสำรอนินทรีย์ ประกอบด้ วย
แบคทีเรีย รำ และแอคติโนมำยซีท
N-oxides
gas N2
Organic N
denitrification
mineralization
NH3
nitrification
NO3
NH4
Bound to
exchange complex
leach
แสดงกระบวนกำร mineralization,
nitrification และ denitrification
Plants
Immobilization
- กำรแปรสภำพจำกสำรอนินทรีย์ไนโตรเจนเป็ น
สารอินทรีย ์ไนโตรเจน
- เป็ นกระบวนกำรทีจ่ ุลนิ ทรีย์ดูดเอำสำรอนินทรีย์
ไนโตรเจนในดินไปใช้ (assimilation) เพื่อสร้ ำง
เซลล์ ใหม่
- กระบวนกำรนีเ้ ป็ นกำรสู ญเสี ยไนโตรเจนไปจำกดิน
- อินทรีย์ไนโตรเจนในรู ปของแอมโมเนียม เป็ นรู ป
่ กดู ดนาไปใช้โดยแบคทีเรีย แอคติ
ทีถู
โนมำยซีท
วิธีกำรหำค่ ำไนโตรเจนที่สิ่งมีชีวติ บำงชนิดตรึงไว้
(Method of nitrogen estimation)
Kjeldahl method
การหาปริมาณ N2 ที่เพิม่ ขึน้ อำจทำได้ โดย
วิธี
ของ Kjeldahl หรื อ Dumas
อีกวิธีหนึ่งคือกำรใช้
เทคนิคกัมตภำพรังสี ด้ วยเครื่ อง mass spectrometer,
วิธีที่ใช้ เครื่ องมือแบบง่ ำย คือวิธีหำปริมำณ N2
ในเซลล์
Acetylene Reducing Technique
Nitrogenase ที่พบในสิ่ งมีชีวติ ที่ตรึง N2 สำมำรถ
reduced acetylene ให้ เป็ น ethylene ได้ ใช้
ควำมสั มพันธ์ นีใ้ นกำรวัดกำรตรึง N2 ของสิ่ งมีชีวติ
โดยวัดจำก ethylene ที่เกิดขึน้ มำจำกสิ่ งมีชีวิต
ควำมสำคัญของ nitrogenous compound
1. Amino acid มีสูตรโครงสร้าง ดังนี้
H
R
C
COOH
NH2
2. Amide มีสูตรโครงสร้าง ดังนี้
NH2 H
H
HOOC
C
C
C
C
H
H
H
O
glutamine
สำรประกอบ
ที่มี nitrogen
ที่สำคัญต่ อสิ่ ง
มีชีวติ สำมำรถ
แบ่ งได้ ดงั นี้
NH2
3. Peptide เกิดจำกกำรต่ อกันระหว่ ำงหมู่ COOH
ของกรดอมิโน 1 ตัวและ NH2 ของกรดอมิโนอีก
1 ตัว
O
C
C
R
R
C
N
H
H
N
C
O
C
R
4. โปรตีน แบ่ งเป็ น 2 ประเภทคือ
1. Simple protein เช่ น albumin, globulin
2. Conjugate protein เช่ น glycoprotein
5. นิวคลีอกิ แอซิด
มี 2 ชนิดคือ RNA และ DNA เป็ น polymer
ของ nucleotide ซึ่งประกอบด้ วย nitrogenous base,
ribose
หรื อ deoxyribose และฟอสฟอรัส
แหล่งเก็บสะสมโปรตีนในเมล็ด
และกำรนำไปใช้
(Protein Storage and Utilization in Seed)
โปรตีนที่สะสมอยู่ในเมล็ด จะประกอบด้ วยสำยโพลี
เปปไทด์ หลำยสำยประกอบกันเป็ นโมเลกุลเชิงซ้ อน
ขนำดใหญ่
พืชใบเลีย้ งเดีย่ วมักสะสมโปรตีนไว้ ในรู ป prolamin
หรื อ glutelin
พืชใบเลีย้ งคู่มักสะสมโปรตีนพวก globulin
โปรตีนเหล่ ำนีจ้ ะสะสมอยู่ในโครงสร้ ำงที่เรียกว่ ำ
aleurone bodies หรื อ protein bodies
ในระหว่างการเจริญ (development) เมล็ด
จะมีกำรสะสมอำหำรไว้ ในปริมำณมำก เก็บไว้ ในเนื้อเยื่อสะสม
อำหำร เช่ น ใบเลีย้ ง (cotyledons) หรื อ endosperm
่
้
อาหารทีสะสมไว้
จะขึนอยู
่กบ
ั ออ
กำแนลล์ ที่ใช้ ในกำร
สะสม เช่น
- โปรตีนจะเก็บสะสมไว้ ใน protein bodies บำงครั้ง
จะรวมอยู่กบั minor reserve คือ Phytin
- ไลปิ ดจะเก็บสะสมไว้ ใน lipid bodies
- แป้งจะสะสมไว้ ใน starch grains (amyloplast)
ชนิดของโปรตีนและส่ วนประกอบ
(Protein types and their composition)
Osborne แบ่ งชนิดของโปรตีนตำมควำมสำมำรถ
ในกำรละลำย ได้ เป็ น 4 ชนิด คือ
1. Albumins
2. Globulins พบใน legumes และ ข้ ำว oats
3. Glutelins พบใน cereal seed
4. Prolamins พบใน cereal seed
Storage protein เป็ น Oligomeric haloprotein
ประกอบด้ วย 2 ถึงหลำยๆ subunit
Subunit ประกอบด้ วย 2 ถึงหลำยๆ polypeptide
chain ต่ อกันด้ วย hydrogen bonding หรื อ disulfide bonds
ระหว่ ำง cysteine residues
Globulin ของ legume
แบ่ งเได้ โดยใช้ sedimentation coefficients (s)
แบ่ งออกเป็ น
- globulin ขนำดใหญ่ คือ (11S หรื อ legumin protein)
มี MW ~ 320000-360000 ประกอบด้ วย 6 subunit
มี MW ตั้งแต่ จำก 35000-80000 Subunit ของ legumin
ประกอบด้วย acidic และ basic polypeptides ใน
ปริมำณ
เท่ ำๆกัน
Storage Legumins ของพืชบำงชนิดจะค่ อนข้ ำงแตกต่ ำง
กัน (heterogenous)
- globulin ขนำดเล็ก (7S หรื อ vicilin protein)
vicillin จะไม่ รวมตัวไปเป็ นส่ วนประกอบของ sulfur-containing
amino acid และไม่ มี disulfide bridging ระหว่ ำง subunit มีเพียง
hydrogen bonding
๏ Storage protein ของ cereal ส่ วนใหญ่ คือ prolamin
๏ Storage protein ในข้ ำวโพดคือ Zein ประกอบด้ วย 2
subunit เกิดจำกกำรรวมตัวของโพลีเปปไทด์ ประมำณ 30
polypeptides
๏ Storage protein ในข้ ำวสำลี คือ gliadin มีอย่ ำงน้ อย
46 polypeptides
๏ เมล็ดบางชนิ ดประกอบด้วย unusual storage
albumin เช่ น ureaseใน jack bean เป็ นสำรยับยั้งกำรสร้ ำง
โปรตีน (proteolytic inhibitors)
้ งมีพวก toxic เช่ น ricinD ในพวก
๏ นอกจากนี ยั
caoter bean หรื อพวกทีม่ ีคุณสมบัตทิ ำงชีวภำพทีน่ ่ ำสนใจคือ
lectins ทีร่ วมตัวอยู่กบั erythrocytes
๏ Storage globulins และ albumins ส่ วนใหญ่ เป็ นพวก
glycoprotein ประกอบด้ วย mannose, glucose และ Nacetyl glucosamine (Murray, 1984)
แสดงเปอร์ เซนต์ ของโปรตีนชนิดต่ ำงๆใน cereal และ legumes
บำงชนิด (Dennis and Turpin, 1990)
ชนิดของพืช Albumin
Globulin
Prolamin
Glutelin
Wheat
9
5
40(gliadin)
46(glutenin)
Maize
4
2
55(zein)
39
Rice
5
10
5(oryzin)
80(oryzenin)
Oat
11
56
9(avenin)
23
Pea
40
0
0
Soy bean
30
60(vicillin, convicillin,
legumin
70(glycinin,
b-conglycinin
0
0
Protein body
่ าหน้าทีเก็
่ บสะสมโปรตีนใน
๏ แหล่งทีท
เมล็ด
๏ unit membrane bound
่
๏ โดยทัวไปมี
รูปร่างกลม (spherical)
m
๏ เส้นผ่าศู นย ์กลางประมาณ 0.1-25
๏ โปรตีนอยู่ในรู ป inclusion เช่ น Phytin-containing
globoids หรื อ proteinaceous crystalloids
๏ ชนิดของ proteinaceous matrix ของ protein bodies
ขึน้ อยู่กบั species และ tissue
กำรสั งเครำะห์ โปรตีนสะสม
(Storage protein synthesis)
๏ ในเมล็ด การสังเคราะห ์ Storage protein เกิด
หลังจำกกำรแบ่ งเซลล์ ช่ วง 2/3 ตอนท้ ำยของกำร
development
๏ หยุดสร้ ำงในช่ วงขั้นสุ ดท้ ำยของ maturation drying
(Higgins, 1984)
่ น
๏ ความแตกต่างของการเริมต้
สั งเครำะห์ Storage protein ชนิดต่ ำงๆ ขึน้ อยู่กบั กำร
ควบคุมทำงด้ ำนพันธุกรรมและสิ่ งแวดล้ อม
กำรสร้ ำง protein body ในเมล็ดพืชพวก legume
(Protein body formation in legume seeds)
๏ Protein body ใน storage parenchyma cell ของ legume seed
m 1-10
๏ เส้นผ่าศูนย ์กลางประมาณ
๏ ส่ วนใหญ่ รูปร่ ำงและโครงสร้ ำงจะเหมือนกัน (homogenous)
๏ Proteinaceous matrix ประกอบด้ วย small globoid inclusion ขนำดเล็ก
๏ Protein body เหมือนแวคิวโอลขนำดเล็กมีหน้ ำทีเ่ ฉพำะในกำรเก็บโปรตีน
้
๏ ช่วงการพัฒนาของใบเลียงมี
RER จำนวนมำกในช่ วงที่มี
กำรสะสม storage protein
กำรสร้ ำง protein body ในพวก cereal
(Protein body formation in cereal grains)
๏ โครงสร ้างของ protein body จะอยู่ในเซลล์ของ
endosperm
๏ รูปร่ ำงกลม (spherical)
m
๏ ขนำดเส้ นผ่ ำศูนย์ กลำงประมำณ 2-5
๏ ประกอบด้
ย globoid
และ crystalloid
protein
body ใน วstarchy
endosperm
มีรูปร่ ำงinclusion
3 แบบ คือ
1. Protein body ขนำดใหญ่ เส้ นผ่ ำศูนย์ กลำงประมำณ 1-3 m
2. Protein body ขนำด่ เส้ นผ่ ำศูนย์ กลำงประมำณ 0.1-1 m
3. Crystalline protein body มีลกั ษณะ spherical bodies และ angular
เส้ นผ่ ำศูนย์ กลำงประมำณ 1-5 m
กำรเคลื่อนย้ ำยไนโตรเจนสะสม
(Nitrogen storage and Transport)
่
๏ ในการเคลือนย้
ายไนโตรเจนสะสมจาก
อวัยวะหนึ่งไปยังอีกอวัยวะหนึ่ง เช่ น
1. กำรเคลื่อนย้ ำยจำก nitrogen-fixing root noduleไปยัง
ใบและผล
2. จำกใบทีแ่ ก่ กำลังจะร่ วงไปยังใบอ่ อนและผล
3. จำกใบเลีย้ งของเมล็ดที่กำลังงอกไปยังปลำยยอดและ
ปลำยรำก
ปริมำณของ C จำกัดกำรเคลื่อนย้ ำยไนโตรเจน
้ั งจะเก็บไนโตรเจนสะสมไว้ใน
๏ พืชชนสู
รู ป asparagine และมีกำรเคลื่อนย้ ำยในรู ปของ asparagine
๏ Amide nitrogen มำจำก amide group ของ glutamine
โดยตรง สั งเครำะห์ โดยเอนไซม์ asparagine synthetase
NH2 O
O
OH
O
OH
NH2
CH2
C
C
AMP +
CH2 ATP PPi CH2
CH2
CH2
CH2
CHNH2
CHNH2
CHNH
COOH
2
C
CHNH2
COOH
Glutamine
+
COOH
Aspartate
O
C
+
CH2
COOH
Glutamate Asparagine
แสดงกำรสั งเครำะห์ Asparagine (Lea and Leegood, 1993)
๏ ข้อสังเกต N : C ratio ของ
asparagine คือ 2 : 4 ซึ่งตรงข้ ำมกับ 1 : 5
ใน glutamate
้
๏ ใบเลียงของ
germinating seed เป็ น
แหล่ งของ asparagine synthetase (เป็ น
เอนไซม์ ทตี่ ้ องกำร Cl- สำหรับกำรเกิดปฏิกริ ิยำ
และถูกยับยั้งโดย Ca+)
กลไกของกระบวนกำร denitrification
เกิดจำกจุลนิ ทรีย์ใช้ nitrite หรื อ nitrate
เป็ นตัวรับ e- เมื่อ O2 ไม่ เพียงพอหรื อขำด O2
nitrate หรื อ nitrite จะถูกลด O2
ตำมลำดับจนกลำยเป็ น N2 ดังสมกำร
NO3
- nitrate
nitrite NO2
(HNO)
nitrous
nitroxyl
-
NO
H2N2O2
nitric acid
-H2O
N2O
hypo nitrite
N2 nitrogen
กระบวนกำรกำร ammonification
กระบวนกำรเปลีย่ นแปลงสำรอินทรีย์ให้
เป็ นสำรอนินทรีย์ (ammonia ) คือ
ammonification หรื อ mineralization
จุลนิ ทรีย์ทเี่ กีย่ วข้ องกับกำรแปรสภำพ
สำรอินทรีย์ไปเป็ นสำรอนินทรีย์คือพวก
ammonifiers ซึ่งประอบด้ วย bacteria รำและ
actinomycetes ชนิดต่ ำงๆ
แสดงกระบวนกำร mineralization, nitrification
และ denitrification ดังนี้
denitrification
N
2
organic N
NH3
nitrification
mineralization
NH4
bound to exchange complex
NO3
leach plants
Immobilization
กำรแปรสภำพจำกสำรอนินทรีย์ nitrogen
เป็ นสำรอินทรีย์ nitrogen
เป็ นกระบวนกำรทีจ่ ุลนิ ทรีย์ดูดเอำ
อนินทรีย์ไนโตรเจนในดินไปใช้ (assimilation)
ถือเป็ นกำรสู ญเสี ยไนโตรเจนไปจำกดิน
จุลนิ ทรีย์จะนำทั้ง NH3 และ nitrate
ไปใช้ สร้ ำง cell ได้ (แนวโน้ มจะใช้
NH3 ก่ อนแล้ วใช้ nitrate เมื่อ NH3
หมด)
แหล่ งเก็บสะสม protein ในเมล็ดและกำรนำไปใช้
Protein Storge and Utilization in Seed
เมล็ด-one of the richest source of plant protein
มี protein ประมำณ 10-15%
เมล็ด-ประกอบด้ วยสำย p o l y p e p t i d e หลำยๆ
สายประกอบกันเป็ น molecule
เชิงซ้ อน
ขนาดใหญ่
เมล็ดธัญพืชของพืชเลีย้ งเดี่ยว เช่น
ข้ ำว ข้ ำวโพด สะสม protein ในเมล็ดในรูป
prolamin หรื อ glutelin ส่ วนเมล็ดพืชใบเลีย้ งคู่
เช่ นพืชตระกูลถัว่ สะสม protein ในรุป globulin
storage protein เหล่ ำนีส้ ะสมอยู่ในรู ป
ของ insoluble form ในโครงสร้ ำงที่เรียกว่ ำ
aleurone bodies หรื อ protein bodies
เมื่อเมล็ดจะงอก enzyme endopeptidase
จะย่ อยพันธะ peptide ภำยใน ทำให้ สำย
polypeptide สั้ นลง
้ enzyme exopeptidase จะ
จากนัน
ย่ อยพันธะ peptide จำกส่ วนปลำย ซึ่งจะปล่ อย
amino acid เป็ นอิสระทีละโมเลกุล
Exopeptidase จะย่ อย peptide bond
จำกปลำยด้ ำน amino (amino terminus)
เรียกว่ ำ aminopeptidase ส่ วน enzyme
exopeptidase ที่ย่อย peptide bond จำก
ปลำยด้ ำน carboxy terminus เรียก
carboxypeptidase
Proein จะเก็บสะสมไว้ ใน protein bodies
บำงครั้ง protein จะสะสมรวมกับ minor
reserve คือ phytin
lipid จะสะสมไว้ ใน lipid bodies แป้งจะ
สะสมไว้ ใน starch grains (amyloplast)
ชนิ ดของ protein และ
ส่ วนประกอบ
(Protein types and their composition)
Osborne แบ่ งชนิดของ protein เป็ น 4
ชนิด โดยแบ่ งตำมควำมสำมำรถในกำรละลำย
คือ
1. Albumin ละลำยได้ ในน้ำ (soluble in
water) และ dilute buffers ที่ pH เป็ นกลำง
2. Globulins ละลำยได้ ใน salt solution แต่
ไม่ละลายในน้ า พบใน legumes
และข้ ำว
oats
3. glutelins ละลำยในกรดเจือจำง (dilute
acid) และด่ ำง (alkali) พบใน cereal seed
4. Prolamins ละลำยใน 70-90% aqueous
ethanol พบใน cereal seed
Glutelins และ prolamins พบมำกในเมล็ด
ธัญพืช globulin จะพบมำกในพวก legumes
และข้ ำว oat
Storage protein เป็ น oligomeric
haloprotein ที่ประกอบด้ วย 2 ถึง หลำยๆ
subunit
The nutritional problem with cereal
and legume is that they contain limited
amounts of certain amino acid which
essential to man and monogastric animals
Most cereal are deficient in lysine
and threonine
Legume-are deficient in sulfur amino acid
rice-have low overall protein level แต่ มี better
amino acid balance
amino acid ทีข่ ำดในธัญพืช
ข้ ำวโพด ขำด Threonine, tryptophan, lysine
ข้ ำว
ขำด Threonine, thryptophane
ข้ ำวสำรขำว มี lysine ต่ำ
ถั่วเหลือง มี methionine ต่ำ
โครงสร ้างและส่วนประกอบของ
globulin
globulin ใน legume แบ่ งเป็ น 2 ชนิด คือ
haloprotein ซึ่งจะแยกได้ โดยใช้ sedimentation
coefficientes ซึ่งหำค่ ำได้ โดยใช้ ultracentrifugation แบ่ ง
ได้ เป็ น
1. Globulin ขนำดใหญ่ คือ legumin protein มีขนำด
11S MW ประมำณ 320,000-360,000 มี 6
subunits ซึ่งมี MW ตั้งแต่ 35,000-80,000
subunit ของ legumin ประกอบด้ วย
acidic และ basic polypeptides ในปริมำณ
เท่ ำๆ กัน
ในถั่วพวก pea และ Soybean acidic
polypeptide ส่ วนใหญ่ จะมี MW ~ 40,000
และจะต่ ออยู่โดย disulfide bond สำหรับ basic
polypeptide จะมี MW~ 20,000
2. Globulin ขนำดเล็ก เรียก vicilin protein
มีขนำด 7S จะมีลกั ษณะเป็ น heterogenous
Storage protein ของ cereal ส่ วนใหญ่ คือ
prolamins storage protein ในข้ ำวโพดคือ Zeatin
ซึ่งประกอบด้ วย 2 subunit ที่มีขนำดใหญ่ ขนำด
เล็ก อย่ ำงละ 2 subnit เกิดจำกกำรรวมตัวของ
polypeptide ประมำณ 30 polypeptide storge
protein ในข้ ำวสำลีคือ gliadin มี 46 polypeptide
Storage protein ในทำนตะวันคือ albumin
storage proein ใน jack bean มี unusual
storage albumin เช่ น urease ซึ่งเป็ น
proteolytic inhibitor
storage globulins และ albumins ส่ วน
ใหญ่ เป็ นพวก glycoprotein ซึ่งมีส่วนประกอบ
ของ mannose glucose และ N-acetyl
glucosamine
Glycinin and conglycinin (in soybean)
ในพืชพวก legumes, soybean seeds จะมี
protein ประมำณ 40% โดยน้ำหนัก ซึ่ง protein
มี 4 ชนิดที่สำคัญคือ
glycinin (11S), a b และ g conglycinin
(7S) glycinin และ b conglycinin จะมีมำก
ประมำณ 70% ของ total seed protein
อัตรำส่ วนของ glycinin และ b conglycinin
จะมีอตั รำส่ วนเช่ น 1 : 1
ถึง 3 : 1 ใน soybean แต่ ละ cultivars
ค่ ำเฉลีย่ ของglycinin : conglycinin = 1.6 : 1
ในกำรแยก glycinin จำก soybean seed
ค่ อนข้ ำงยำก
glycinin ที่แยกได้ จำกเมล็ดจะเป็ น
hexameric complex มี MW 360,000
ประกอบด้ วย six nonidentical subunits
มีค่ำ MW เฉลีย่ 60,000
แสดงเปอร์ เซนต์ protein ชนิดต่ ำงๆใน cereal และ legumes บำงชนิด
ชนิดของพืช
Albumin Globulin Prolamin
ข้ าวสาลี (Wheat)
9
5
45(gliadin)
ข้ าวโพด(maize)
4
2
55(Zein)
ข้ าว (rice)
5
10
5 (ozyzin)
ข้ าวโอ๊ ต (oat)
11
56
9 (avenin)
ถัว่ (pea)
40
60(vicilin 0
convicillin legumin)
ถัว่ (soybean)
30
70 (glycinin) 0
b -conglycinin
Glutelin
46(glutenin)
39
80 (oryzenin)
23
0
0
Proteinbody
แหล่ งที่ทำหน้ ำที่เก็บสะสม protein แหล่ ง
ใหญ่ ในเมล็ดคือ protein bodies
Protein body - organelles ที่เป็ น unit
membrane bound มีรูปร่ ำงกลม (spherical) มี
เส้ นผ่ ำศูนย์ กลำงประมำณ 0.1-25 m
Protein จะอยู่ในรูป inclusion
เช่ น phytin-containing globoids
หรื อ proteinaceous crystalloids
กำรสร้ ำง protien body ในเมล็ดพืชพวก legume
(Protein body formation in legume seeds)
protein body ใน storage paranchyma cell
ของ legume seed ทัว่ ไปจะมีเส้ นผ่ ำศูนย์ กลำง 110 m ส่ วนใหญ่ รูปร่ ำง โครงสร้ ำงจะ
เหมือนกัน
protein body เหมือน vacuole ขนำดเล็กมี
หน้ ำทีเ่ ฉพำะในกำรเก็บ protein
ในช่ วงกำรพัฒนำของใบเลีย้ งพวก legume จะมี
rough endoplasmic reticulum (RER) เป็ น
จำนวนมำกในช่ วงที่มีกำรสะสม storage
protein
อำจกล่ ำวได้ ว่ำ RER เป็ นบริเวณที่เกิดกำร
สั งเครำะห์ protein
กำรสร้ ำง protein body ในพวก cereal
(Protein body formation in cereal grain)
โครงสร้ ำง ของ protein ของ cereal grain
ซึ่งอยู่ที่ endosperm จะมีรูปร่ ำงกลม (spherical)
ขนำดเส้ นผ่ ำศูนย์ กลำง~2-5
m
ประกอบด้ วย globoid และ crystalloid inclusion
Prtoein body ใน starchy endosperm จะมีรูปร่ ำง
เป็ น 3 แบบ คือ
1. Protein body ใน starchy endosperm ทีม่ ขี นำดใหญ่
เส้ นผ่ ำศูนย์ กลำง ~1-3 m
2. Protein body ขนำดเล็กเส้ นผ่ ำศูนย์ กลำง ~ 0.1-1 m
3. Crystalline protein body ทีม่ ลี กั ษณะ spherical
protein body และ angular มีขนำดเส้ นผ่ ำศูนย์ กลำง ~
m
1-5
The Molecular Biology of N2
metabalism
ยีนทีค่ วบคุมกระบวนกำร nitrogen fixation ใน
สิ่ งมีชีวติ พวก free living bacteria เช่ น Klebsiella
พบมีกลุ่มยีน 17 gene ที่เรียกว่ ำ nitrogen fixing
(nif) gene ควบคุมกระบวนกำร nitrogen fixation
Nif gene สำมำรถจำแนกได้ ตำมหน้ ำที่ดังนี้
1. Stnectural protcin fer nitro genase
nif gene กลุ่มนีจ้ ะควบคุมกำรสั งเครำะห์
enzyme nitrogenase gene กลุ่มนีค้ ือ nifH, nitD
และ nif K
2. Gene ทีค่ วบคุมกำรสั งเครำะห์ protein ที่
เกีย่ วข้ องกับกำรสร้ ำง Mo Fe cofacter
gene ในกลุ่มนีค้ ือ nif B, nifV, nifN, nifE และ
nifQ
3. Gene ทีค่ วบคุมกำรสั งเครำะห์ flavodoxin
electron tansport protlin ยีนในกลุ่มนีค้ ือ nif f และ
nif J
4. Gene ทีค่ วบคุมกำรสั งเครำะห์
Protein ที่ช่วยในกระบวนกำรต่ ำงๆ ของ
enzyme nitrogenase ยีนในกลุ่มนีค้ ือ gene
nif M และ nif S
5. Gene กลุ่มทีค่ วบคุมกำรสั งเครำะห์ protein
ทีท่ ำหน้ ำทีค่ วบคุมหรื อมีผลต่ อ nif gene ตัว
่ gene ในกลุ่มนีค้ ือ nif A และ nif L
อืนๆ
6. Gene ที่ยงั ไม่ ทรำบหน้ ำที่แน่ นอน gene ใน
้ อ nif U, nif X และ nif Y
กลุ่มนี คื
จำกกำรศึกษำใน K. pneumoniae พบว่ ำ
enzyme nitrogenase จะถูกสั งเครำะห์ ขนึ้ เมื่อ K.
pneumoniae เจริญในสภำพที่เป็ น anaerobic และมี
ไนโตรเจนจำกัด (nitrogen limiting)
แสดงว่ ำ nitrogenase จะ denature
เมื่ออยู่ในสภำพทีม่ ี O2 และ nitrogenase จะ
ไม่ ถูกสร้ ำงขึน้ เมื่อมีแหล่ งของ reduced
nitrogen ที่พืชสำมำรถนำไปใช้ ได้
Gene ทีค่ วบคุม nitrogen assimilation
gene ทีค่ วบคุมกระบวนกำร nitrogen
assimilation คือ gene กลุ่ม ntr
ntr system ประกอบด้ วย
1. Ntr A
2. Ntr B
3. Ntr C
Nodule แบ่ งเป็ น 2 gr. ใหญ่ โดยแบ่ งตำมรูปร่ ำง
(shape) meristematic activity และ product ที่ได้
จำกกำร fix N2
ซึ่งสำมำรถแบ่ ง nodute ได้ เป็ น
1. Nodule ที่มีลกั ษณะ elongali0cylindncal คือ
nodule ทีม่ ีรูปยำวเรียวเนื้อเยื่อเจริญบริเวณ
apical
ภำยใต้ สภำพ anaerobic (ไม่ มี O2) และสภำพที่
มี Nitrogen ในปริมำณจำกัด ntr A และ ntr C
gene product จะกระตุ้นกระบวนกำร
transcription ของ nif L A operon ซึ่ง nif A
และ ntr A gene products จะกระตุ้น
กระบวนกำรถอดรหัสของ nif operon อื่นๆ
Symbiolic N2 fixation
(Rhizobium-legume symbiosis)
นอกจำกกำรที่ Rhizobium สำมำรถตรึง N2 ได้
กับพวก legume แล้ วยังสำมำรถตรึง N2 ให้ กบั พืช
พวก non-legume เช่ นพืชใน family Eleagnaceae
ซึ่งอยู่ร่วมกับแบบ symbiosis กับพวก actinomycete
Frankia และระหว่ ำง water fern Azolla กับพวก
Cyanobacteria
กำรอยู่ร่วมกับระหว่ ำง Rhizobium-legume
symbiosis จะมีกำรสร้ ำงปมทีร่ ำกของพืชตระกูลถัว่
(root nodule)
root nodule เจริญมำจำก root cortical cell
และมีกำรเรียงตัวอย่ ำงเป็ นระเบียบ (highly
organized) (Vance et al, 1988)
(apical meristem) มีกำรเจริญและแบ่ งตัวไป
เรื่ อยๆ แบบไม่ หยุด (indeterminate) และมีกำร
ขนส่ ง N2 ในรูปของ amide eg. ของพืชพวกนีเ้ ช่ น
Alfalfa (Medicago sativa L.)
pea (Pisum sativum L. และ Clover
(Trifolium sp.)
2. Nodule ที่มีลกั ษณะกลม (spherical)
โดยที่เนื้อเยื่อเจริญมีกำรเจริญแบบ
determinate คือเจริญไปได้ ระยะหนึ่ง
และจะหยุดกำรเจริญ (determinate)
และมีกำรขนส่ ง N2 ในรูปของ ureides
ตัวอย่ ำงพืชในกลุ่มนี้ เช่ น soybean
(Glycine max L. Merr) และ commonbean
(Phaseolus vulgaris L.)
Rhizobium symbiotic gene
Nod genes
1. symbiotic gene ของ Rhizobia อำจแบ่ ง
ได้เป็ น gene ที่มีผลต่ อกระบวนกำร
สร้ ำง
ปม (nodulation) เรียกว่ ำ nod gene
2. Gene ทีค่ วบคุม enzyme nitrogenase
เรียก nif gene
3. Gene ที่มีผลต่ อกระบวนกำร symbiotic N2
fixation เรียก fix genes (Earl et al., 1987;
Johnston et al., 1987)
ในกำรที่พืชจะสำมำรถตรึง N2ได้ ต้องมี gene ที่
จำเป็ นสำหรับกำรสร้ ำงปมและมี gene
ที่ใช้ ในกำรตรึง N2 ได้ อย่ ำงมีประสิ ทธิภำพ ถ้ ำมีกำร
mutation ของ nod A, B, C gene จะมีกำร block
root hair curling, infeetion และ nodulation
กำรสร้ ำงปมโดย rhizobial specics จะ specific มำก
eg R. meliloti จะทำให้ เกิดปมใน alfalfa แต่ ไม่ ทำให้
เกิดปมใน clover และ soybean host. Specific
nodulation จะถูกควบคุมด้ วย gene nod E, F G และ
H gene ใน R. meliloti และโดย nod E และ nod F ใน
R. leguminosarum (Kondoros; 1986; Johnston
et al., 1987) nod D, A, B, C gens ถือว่ ำเป็ น
Common nod gene
nod gene product ได้ isolated และดูลกั ษณะ
(Kondorosi and Kondorosi, 1986; Johnston et
al., 1987) ส่ วนใหญ่ จะเป็ น membrane bound มี 1
ชนิดที่เป็ น transport protein ส่ วนที่เหลือเป็ น acyl
carricr protein activation ของ nod gene ถูก
control โดย secondary plant products ซึ่งพบใน
root exudates (peters et al., 1986; Kosslak et
al, 1987)
promotor regions ของ nod operons
ประกอบด้ วย 35-45 bp conserved sequence
ซึ่งเรำเรียกว่ ำ nod box สำรประกอบใน root
exudates ทีท่ ำหน้ ำทีก่ ระตุ้นกำร transcription ของ
nod gene คือสำรพวก flavones, flavanones และ
isoflavones.
สำรเหล่ ำนีม้ ำจำกกำรรวมตัวของ phenolic
cinnamic acid และ malonate.
สำรทีเ่ ป็ นตัวกระตุ้นจำก root cxudates
ของพืชพวก alfalfa, pea, clocer และ soybean
เป็ นพวก luteolin ซึ่งเป็ นพวกสำร flavone
hesperitin ซึ่งเป็ นสำรพวก flavanone
7, 4' -dihydroxyflavon และ
4' 7-dihydroeyisoflavone ซึ่งเป็ นพวก daidzein
(peter et al., 1986; Johmston et al, 1989;
Kosslak et al., 1987)
Nif and fix gene
นอกจำก nif gene แล้ วยังมี gene อีกกลุ่มหนึ่งที่
มีควำมสำคัญสำหรับ N2 fixation gene กลุ่มนีค้ ือ fix
gene ซึ่งแยกได้ จำก Rhizobium
Mutation ของ fix gene ทำให้ nodules ไม่
สำมำรถ fix N2 ได้ ทำให้ มี phenotype เป็ น Fix
phenotype มีกำร identify gene fix ใน R. meliloti
ซึ่งพบว่ ำมีอยู่ 4 genes คือ fix A, fix B fix C และ fix
X (Earl et-al., 1987)
ซึ่งพบว่ ำจะ link โดยใกล้ ชิดกับ nif cluster
Interaction between N assimilation and
Photosynthesisจำก ปฏิบัติกำรแสง
5H2O
(2e-)
2.5
O2 + 5(2H-) + 5
จำกปฏิบัติกำรแสงในกำรแตกตัวของน้ำ
5 โมเลกุล จะได้ O2 2.5 โมเลกุลให้ e- 5 คู่ 5 (2
e)
e- 1 คู่ (2 e-) นำมำ reduc
2 e-
NO3
NaR
NO2
NaR (nitrate reductase)
NO2- เป็ นพิษต้ องถูก reduces ให้ เป็ น NH4+ โดย NiR
(nitrite reductase)
2
e
NO2NH4+
NiR
ใช้ e- จำกปฏิกริ ิยาแสง 3 คู่
NH4+ ที่ได้ เป็ นพิษต้ องนำไปสร้ ำงสำรประกอบอินทรีย์
โดย enzyme GS (glutamine synthetase) และ
GOGAT ดังสมกำร
glutamate + NH4+ + ATP
glutamine + ADP+Pi
Glutamine + a ketoglutarate
GOGAT
+
+ 2NADH 2e- 2 glutamate + 2NAD
Interaction between N assimilation and
Respiration
ในพืช C3 Plants จะมีกระบวนกำร nitrogen
assimillation มำก เนื่องจำกมีกำรปลดปล่ อย NH4+
จำกกระบวนกำร photorespiration กำรสั งเครำะห์
amino acid นอกจำกต้ องกำร NH4+ แล้ วยังต้ องกำร C
ซึ่ง C-skeleton ต้ องอยู่ใน form ของ keto acid ซึ่ง
ได้ มำจำก respiratiory pathwary
ดังนั้น glycolysis และ TCA cycle ในกระบวนกำร
respiration เป็ นตัวให้ a - ketoglutarate สำหรับใช้
ในกำรสร้ ำง glutamate ซึ่งเป็ นสำรต้ นตอในกำร
สั งเครำะห์ amino acid ตัวอื่นๆ ด้ วย
ดังนั้นถ้ ำมี amino acid เพิม่ ขึน้ ควำมต้ องกำร
C-skeleton มำกขึน้ อัตรำกำรหำยใจก็จะมำกขึน้
ดังนั้น อำจกล่ ำวได้ ว่ำ TCA cycle มีควำมสำมำรถ
สร้ ำง C-skeleton สำหรับสั งเครำะห์ amino acid