Download Experiment - Data mining

PPMetabolomics
Ass. Student:
Team in alphabetical order
Mara Vallianou
Lena Fragner
Gert Bachmann
Wolfram Weckwerth
Stefanie Wienkoop
PP Leitung
Ass. Students: Florian Demel + Nastassja Holeschofsky
Practical Introduction:
Theoretical Introduction:
Lena
1x Experimental (Wienkoop)
Stefanie
2 x Analytics (Fragner/Wienkoop)
Florian
Nastassja
2 x Systems Biology (Weckwerth)
1 x Statistics (Bachmann)
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
Stefanie Wienkoop - PPMetabolomics
Schedule
Mo
Tu
We
Th
Fr
metabolite extraction, theory
derivatization, measurements, software
statistics, data analysis
data mining, theory
data mining, theory
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
Stefanie Wienkoop - PPMetabolomics
Material – Extraction – GC-MS:
3 groups á 4 persons
Experiment - Data mining:
4 Groups á 3 persons
Material – Extraction – GC-MS:
Group 1) Medicago truncatula: leaf cold stress/control
Group 2) Lepidium cartilagineum : leaf salt stress/control
Group 3) Arabidopsis thaliana: leaf cold stress/control
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
Stefanie Wienkoop - PPMetabolomics
Experiments - Data mining
Group 1) Medicago truncatula: leaf cold stress/control
Group 2) Lepidium cartilagineum : leaf salt stress/control
Group 3) Arabidopsis thaliana: leaf cold stress/control
Group 4) Leaves Ara/Medic/Lep
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
Stefanie Wienkoop - PPMetabolomics
What do we expect from you?
1) Excellent collaboration
2) Final presentation of your results in english:
a) Protocol (per group)
b) Oral presentation (per group)
(date according to prior agreement)
Stefanie Wienkoop – Plant Systems Interaction
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
Stefanie Wienkoop - PPMetabolomics
MS-Techniques
1) Metabolite Extraction
2) GC-Triple quadrupole MS
(Metabolite profiling and quantitative analysis)
3) Data Mining – Statistical Analyses Tools (Multivariate)
Stefanie Wienkoop – Plant Systems Interaction
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PPMetabolomics
ecology learning
Stefanie Wienkoop – Plant Systems Interaction
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PPMetabolomics
Login:
User:
pdfuser
Password: pdfpass
Stefanie Wienkoop – Plant Systems Interaction
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PP Metabolomics
Lab work
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PP Metabolomics – Lab Safety
Chemicals
Chloroform:
Dept. Molecular Systems Biology
http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/
University Vienna
PP Metabolomics – Lab Safety
Chemicals
Chloroform:
Wirkungscharakter:
Narkotisch, sensibilisierend für Katecholamine am Herzen! Lebertoxisch;
kardiotoxisch! Im Tierversuch karzinogen.
Chronisch hepatotoxisch; degenerative ZNS-Veränderungen bei chronischer
Zufuhr (BOMSKI et al., 1967).
Letaldosis: bei peroraler Zufuhr von 10 ml Chloroform tritt der Tod durch
Lähmung des ZNS ein; Atemdepression
(KAEMPE et al., 1980).
Dept. Molecular Systems Biology
http://toxcenter.org/stoff-infos/c/chloroform.pdf
University Vienna
PP Metabolomics – Lab Safety
Chemicals
Methanol:
Dept. Molecular Systems Biology
http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/
University Vienna
PP Metabolomics – Lab Safety
Chemicals
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PP Metabolomics – Lab Safety
Chemicals
Methanol:
Dept. Molecular Systems Biology
http://toxcenter.org/stoff-infos/c/chloroform.pdf
University Vienna
Personal Safety Equipment
Contact lenses
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PP Metabolomics – Lab work
Ernte
Lab Work
Homogenisieren
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PP Metabolomics – Lab work
Extraction
Unter Abzug arbeiten!! Auf Eis arbeiten.
 Zugabe von 1ml Extraktionsgemisch (MCW) inklusive Blank
 Extrakt ca. 10 sec. schütteln, 8 min. auf Eis inkubieren ab und zu schütteln
 Zentrifugieren: 4 min. bei 14000g (Zentrifuge vorkühlen!)
 Überstand vom Pellet trennen und in ein frisches Epi überführen
 Pellet enthält Zellreste, DNA und Proteine, Überstand enthält lösliche Metabolite
 Zugabe von 500 l Wasser (Milli Q):Trennung von polarer und lipophiler Phase
 Proben schütteln und bei 14.000g für 2 min. zentrifugieren.
 Obere polare Phase in frisches Epi überführen
 internen Standard zufügen: 13C-Sorbitol,
Endkonz. 10mg/l  10µl einer 0.1g/l Lösung
 in der Speed Vac etwa 2-3h einrotieren
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PP Metabolomics – Lab work
Derivatisierung
Methoximierung
 Methoximierungsgemisch:
40mg Methoxyaminhydrochlorid (CH3ONH2*HCL) in 1ml Pyridin lösen
kurz (ca. 30s) unter heißes Wasser halten (Waschbecken rechts neben Abzug)
WICHTIG: unter Abzug arbeiten
 Probe in 20µl Reagenz lösen
 90 min. bei 30°C in einem Thermoschüttler inkubieren.
Silylierung
 MSTFA mit Alkanstandards spiken (30µl Alkanmix + 1ml MSTFA)
 80µl Silylierungsgemisch zugeben
 mind. 30 min. bei 37°C in einem Thermoschüttler inkubieren
 Anschließend 2 min. bei 14000g zentrifugieren
 80 ml des Überstands in GC-Vials mit Microeinsätzen überführen
 Vials mit Crimp Caps fest verschließen (Deckel darf sich nicht mehr drehen lassen)
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna
PP Metabolomics – Lab work
Viel Spaß und
gutes
Gelingen!!!
Dept. Molecular Systems Biology
University Vienna