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Gentherapie und Genomics
Konteptvorlesung 17
Themenblock 7
Beda M. Stadler
Institut für Immunologie
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KV 8.18
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1
Inhalt / Lernziele
• Genomics
• Begriffe: Transcriptomics,
Proteomics, Structural Genomics,
Knockout / transgene Tiemodelle,
Comparative Genomics
• Krankheitsallele aufspüren
• Pharmacogenomics
• Gentherapie
• Keimbahn vs somatische
Gentherapie
• Vektoren der Gentherapie
• Gentherapie Strategien und
Beispiele
KV 8.18
2
Es werden immer weniger Gene...
organism
genes
base pairs
Plant
<50,000
<1011
Human
25,000
3×109
Fly
12,000
1.6×108
Honey bee
15,000
3×108
Worm
19,000
9.7×107
Fungus
6,000
1.3×107
Bacterium
500–6,000
5×105–107
Mycoplasma genitalium
500
580,000
DNA virus
10–900
5,000–800,000
RNA virus
1–25
1,000–23,000
Viroid
0–1
~500
KV 8.18
3
Viel Genome sind sequenziert
Superkindom
Kindom
How many
genomes
page
Last update
Archeabacteria
.
arch
16
jul-09-02
Bacteria
.
bac
89
jan-13-03
Eukaryote
Fungi
yeast
2
apr-14-02
Eukaryote
Protozoa
protozoan
1
jan-13-03
Eukaryote
Plant
plants
2
apr-15-02
Eukaryote
Animalia
worm
1
apr-14-02
Eukaryote
Animalia
insect
1
apr-14-02
Eukaryote
Animalia
Mouse
rat
2
jan-18-06
Eukaryote
Animalia
Domestic
animals
2
jan-19-06
Eukaryote
Animalia
Human
chimpanzee
2
jan-18-06
KV 8.18
4
GENOMICS
Sequenzierung
& Analyse
KV 8.18
5
Commonly Used DNA Markers
• RFLPs, or restriction fragment length polymorphisms, were among the first
developed DNA markers. RFLPs are defined by the presence or absence of a
specific site, called a restriction site, for a bacterial restriction enzyme. This
enzyme breaks apart strands of DNA wherever they contain a certain nucleotide
sequence.
• VNTRs, or variable number of tandem repeat polymorphisms, occur in noncoding regions of DNA. This type of marker is defined by the presence of a
nucleotide sequence that is repeated several times. In each case, the number of
times a sequence is repeated may vary.
• Microsatellite polymorphisms are defined by a variable number of
repetitions of a very small number of base pairs within a sequence. Oftentimes,
these repeats consist of the nucleotides, or bases, cytosine and adenosine. The
number of repeats for a given microsatellite may differ between individuals,
hence the term polymorphism--the existence of different forms within a
population.
• SNPs, or single nucleotide polymorphisms, are individual point mutations, or
substitutions of a single nucleotide, that do not change the overall length of the
DNA sequence in that region. SNPs occur throughout an individual's genome.
KV 8.18
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Single Nucleotide Polymorphism
(SNPs)
im menschlichen Genom > 2 Millionen SNPs
93% der Gene enthalten SNP(s)
98% der Gene nahe bei SNP
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SNP Fact Sheet
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Beispiele genetischer Krankheiten
• vererbt
• X-linked
• hemophilia A/B, Duchenne’s muscular dystrophy
• autosomal rezessiv
• Gaucher’s disease, cystic fibrosis
• kausal
• Huntington’s chorea, retinoblastoma
• polygenetisch
• diabetes mellitus, gout
• erworben
• Krebs
• p53 mutations, BRCA-1, other tumor oncogenes
• Atherosclerose
• FHC, plaque disruption
• Autoimmunerkrankungen
KV 8.18
8
Genomics: verwandte Gebiete
• Transcriptomics involves large-scale analysis of messenger
RNAs to follow when, where, and under what conditions genes are
expressed.
• Proteomics—the study of protein expression and function
• Structural genomics generate the 3-D structures of one or
more proteins from each protein family, thus offering clues to
function and biological targets for drug design.
• Knockout and transgenic studies are one experimental
method for understanding the function of DNA sequences and the
proteins they encode.
• Comparative genomics—analyzing DNA sequence patterns
of humans and well-studied model organisms side-by-side.
• Metabolomics - the analysis of small molecules, or
metabolites, in biological samples
KV 8.18
9
Human Genome Program, U.S. Department of Energy, Genomics and Its Impact on Medicine and Society: A 2001 Primer, 2001
Transcriptomics
mRNA Analyse (Genexpression) mit Methoden wie
Northern Blotting oder Microarrays (siehe KV 2)
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Proteomics
DNA
30'000 Gene
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RNA
Proteome
Proteins
> 500'000 Proteine
Modified
Proteins
Biological Function
Genome/Transcriptome
x 5 bis 50
funktionale
Beziehungen
pro Protein
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Structural Genomics
Antikörperbindungsstelle mit und ohne Antigen (Hapten)
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Knockout / transgene Tiemodelle
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Comparative Genomics
“Eisen results from Yeast”
A. Cholesterol biosynthesis
B. Cell cycle
C. Immediate-early response
D. Signalling and angiogenesis
E. Wound healing & tissue remodelling
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Metabolomics
KV 8.18
15
Krankheitsallele aufspüren
Amniozentese
Problem
•
•
KV 8.18
Sensitivität
Spezifität
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Krankheitsallele aufspüren
Southern blotting
bekannte
Punktmutation
Beispiel
Sichelzellanämie
drei
Schnittstellen
Restriktionsanalyse
Auftrennung
nach Grösse
Southern blot
(Hybridisierung
mit mark. Probe)
KV 8.18
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Krankheitsallele aufspüren
Gaucher Disease
Achondroplasia
Huntington's Disease
Juvenile Onset Diabetes
Hemochromatosis
Cystic Fibrosis
Friedreich's Ataxia
Best Disease
Sickle Cell Disease
Phenylketonuria
Marfan Syndrome
Tay-Sachs Disease
Breast Cancer
Myotonic Dystrophy
Familial Hypercholesterolemia
Severe Combined Immune Deficiency ("Bubble Boy" Disease)
Adrenoleukodystrophy
Duchenne Muscular Dystrophy
Hemophilia A
Rett Syndrome
Leber's Hereditary Optic Neuropathy
Chromosome Location and
Inheritance Pattern
1, recessive
4, dominant
4, dominant
6,11,7, others
6, recessive
7, recessive
9, recessive
11, dominant
11, recessive
12, recessive
15, dominant
15, recessive
17, 13
19, dominant
19, imcomplete dominance
20, recessive
X
X
X
X
mitochondria, maternal inheritance
Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis, and Stroke (MELAS)
mitochondria, maternal inheritance
Condition
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18
Pharmacogenomics
KV 8.18
19
Genomics und eine neue Medizin
Auf die Gendiagnostik folgt die Gentherapie
• bessere Diagnose
• frühere Entdeckung
genetischer
Prädispositionen
• rationales Drug Design
• Gentherapie und
Kontrollsysteme für
Medikamente
• personalisierte
Medikamente
KV 8.18
20
Human Genome Program, U.S. Department of Energy, Genomics and Its Impact on Medicine and Society: A 2001 Primer, 2001
Definition und Ziel der Gentherapie
Vektor
(Therapeutisches
Gen)
•
•
•
Expression eines neuen Gens in einer Körperzelle
damit die erworbenen Eigenschaften zu einen
therapeutischen Erfolg beim Patienten führen
Mit einer einzelnen Administration eine lebenslange
Rekonstitution des genetischen Defekts erreichen
Absolute Heilung
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Keimbahn vs somatische Gentherapie
Keimbahntherapie I
Keimbahntherapie II
Somatische Gentherapie
KV 8.18
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Gentherapie und Verfassung
• Keimbahntherapie
:
• Die DNA der Gameten
verändern
• alle Nachkommen erhalten
das veränderte Gen
• Somatische Gentherapie
• Nur die DNA von
somatischen Zellen wird
verändert
• Nicht vererbar
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Noch in den Kinderschuhen
KV 8.18
24
Ernüchterung?
KV 8.18
25
Krankheiten im Fokus der Gentherapie
KV 8.18
26
Arten der Gentherapie
DNA
Virus
Gen
KV 8.18
Zelle
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in vivo und ex vivo Gentherapie
in vivo
ex vivo
• ex vivo (ausserhalb des Körpers)
• transduzierte somatische or hämatopoietische Zellen
• in situ (lokalisiert)
• direkte Administration (z.B. In den Tumor, s/c Depot)
• in vivo (ganzer Körper)
• systemische Administration
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Vektoren
• Jeder Carrier, der die Aufnahme der verändeten
DNA oder ähnlicher Agentien in Zellen steigert
• Virale Vektoren
• Retroviren
• Adenoviren
• andere Viren
• Nicht-Virale Vektoren
• Liposomen
• Genkanone
• Injektion
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Anatomie eines Vektors
Beginn der
DNA Replikation
Promotor
induzierbare Elemente
selektierbare Marker
Affinitäts Reinigungs Tag
multiple Klonierungsstellen
Stabilisierungs und
optimisierungs Elemente
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Viraler Vektor
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31
Adenovirus Vektor
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32
Injektion von “nackter” DNA
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Nicht-Virale Vektoren: Liposomen
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34
Gen-Targetting muss gelöst werden
(Beipiele)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Krankheit
Zielzellen
Gen Defekt
Thallassemie
Haemophilie A
SCID
CGD
LAD
Gaucher's
Hunter’s
musculäre Dyst.
Zystische Fibros.
Erythrocyten
Hepatocyten
Lymphocyten
Mono/Neutro
Mono/Neutro
Makrophagen
Makrophagen
Muskelz.
Atemwegepithel
-Hämoglobin
Faktor VIII
ADA Defizienz
Cytochrome b,
CD18 -subunit
Glucocerebrocidase
Iduronate Desulfatase
Dystrophin
CFTR
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Retrovirale Vektoren
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36
Beispiel: SCID (ADA)
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37
To integrate or not to integrate?
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38
Andere Vektoren am Horizont
•
•
•
•
Adeno-assozierte Viren
Vaccinia / Geflügelpocken
Herpesvirus
Lentivirus (HIV-attenuiert)
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39
Vektoren: Zusammenfassung
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40
verwendete Vektoren
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41
Gentherapie Strategien
•
•
•
•
Ersatz Gentherapie
Knockout Gentherapie
Selbstmord Gentherapie
Immunomodulatorische
Gentherapie
• RNA Interferenz Therapie
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Ersatz Gentherapie
norm. Zelle: kein Effekt
Wachstumsstop
Tumorzelle
Tumorsuppressor
Gen (TSG)
Apoptose
Bystandereffekt
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Knockout (antisense) Gentherapie
KV 8.18
44
Selbstmord Gentherapie
KV 8.18
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Beispiel: Selbstmord Gentherapie
Thymidine kinase is introduced into tumor cells using a viral vector.
Treatment with ganciclovir kills the tumor cells expressing thymidine
kinase selectively.
KV 8.18
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Immunomodulatorische Gentherapie
1. Zytokine
• The basic idea of immunotherapy is to
• modify tumor cells outside the body with a
cytokine gene
• transplant the cytokine-gene modified cells
back into the patient (after the cells have been
irradiated to prevent further cell division)
• let the host's system create an antitumor
immune response
KV 8.18
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Immunomodulatorische Gentherapie
2. "altered self"
Injection of a cell surface protein attracts immune system’s
cytotoxic T cells to the site of a tumor.
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Immunutherapie mit nackter DNA
KV 8.18
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RNA Interferenz Therapie
Anti Virus
• Inhibition of HIV
infection
• Cessation or
lowering of antiviral
chemotherapy!
• Control of T-cell
reduction
• Restoration of T cell
immunity
• Clearance of HIV
infected cells
• Protection from OI
Anti Rezeptor
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Zusammenfassung: verwendete Gene
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51
Gentherapie Zusammenfassung
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