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Review n. 1 – Italus Hortus 14 (1), 2007: 50 - 59
I “geni della fioritura” e le loro implicazioni nella ricerca applicata alle
specie ornamentali
Annalisa Giovannini*
CRA Istituto Sperimentale per la Floricoltura, corso Inglesi 508, 18038 Sanremo (IM)
Ricevuto: 31 gennaio 2007; accettato: 8 marzo 2007
The “genes for flowering” and their
involvement in ornamental applied
research
Abstract. Classical breeding together with the most
advanced techniques in molecular biology have been
applying to a wide variety of species, contributing to
the elucidation of molecular mechanisms in plant
development. The recent discoveries of the mechanisms of flowering in the model plants Antirrhinum
majus, Arabidopsis thaliana and Petunia hybrida
allowed new sets of genes to be available. These
include genes which affect flowering time and flower
architecture, commonly named: flowering-time genes,
meristem-identity genes and organ-identity genes.
Studies in Arabidopsis have led to the identification of
components within individual signaling pathways that
affect flowering and to their positioning within molecular hierarchies. Currently four genetic pathways have
been identified: the light-dependent, the autonomous,
the vernalization and the gibberellin pathway, all integrated by the function of regulatory genes at the integration pathway. Furthermore, distinct signaling pathways are known to converge on the activation of the
same integrator genes. This convergence of pathways on a common set of genes may enable the integration of different responses, so that the plant can
produce a coordinated flowering response under conditions in which multiple environmental and endogenous parameters are changing simultaneously. The
possibility of using molecular techniques to transfer
genes in major ornamentals has greatly increased the
resources available to plant breeders. Flower induction genes could affect flowering in species unrelated
to the plant from which they were isolated. Moreover,
native genes can be overexpressed or suppressed. In
the near future plant biotechnologists and plant breeders will continue to work alongside to improve floricultural plants.
Key words: Arabidopsis thaliana, agricultural
biotechnology, flowering-time genes, meristem-identity genes, organ-identity genes.
* [email protected]
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Introduzione
La capacità di manipolare la crescita e lo sviluppo
delle colture è da sempre stata una prerogativa essenziale per l’industria delle piante ornamentali. La
domanda di alcuni prodotti aumenta esponenzialmente in funzione di particolari ricorrenze (ad esempio la
Poinsettia a Natale). La possibilità di poter regolare il
tempo di fioritura di alcune produzioni senza costi
aggiuntivi potrebbe migliorare la programmazione o
estendere la stagione di fioritura dove le condizioni
ambientali non lo consentono. La ricerca della bellezza e della novità spinge la creatività degli ibridatori
verso architetture fiorali sempre più spettacolari.
La transizione dalla fase di crescita vegetativa a
quella riproduttiva nelle piante superiori è regolata da
fattori endogeni ed ambientali (Araki, 2001). Negli
ultimi anni la conoscenza sui meccanismi genetici e
molecolari che sono alla base dell’induzione della fioritura, della determinazione dei meristemi fiorali e
dello sviluppo degli organi del fiore, ha fatto passi da
gigante, anche grazie agli studi approfonditi sulle tre
specie modello: Antirrhinum majus, Petunia hybrida
e Arabidopsis thaliana. E’ proprio sulla piccola piantina appartenente alla famiglia delle Brassicacee che
si sono concentrati gli sforzi di numerosi gruppi di
ricerca al fine di identificare i geni coinvolti nella fioritura. L’Arabidopsis è di piccole dimensioni, quindi
facilmente manipolabile, ha un ciclo vitale molto
breve (8-16 settimane), produce fino a diecimila semi
per pianta che germinano in due-tre giorni, è una
pianta autogama ed il suo piccolo genoma di circa
ventiseimila geni è stato sequenziato. Si presta alla
trasformazione mediante Agrobacterium tumefaciens
e sono disponibili svariate collezioni di mutanti. I
meccanismi che intervengono nella definizione dello
schema di sviluppo del fiore di Arabidopsis hanno
cominciato ad essere parzialmente compresi.
Nel meristema fiorale, tramite l’azione combinata
di divisione, differenziamento e allungamento delle
cellule, si sviluppano gli organi che costituiscono i
fiori. E’ risultato chiaro che la posizione relativa di
una cellula all’interno di un organismo è ciò che
Geni della fioritura
istruisce quella cellula sul tipo di strutture che essa e
la sua discendenza dovranno formare. Questa informazione riguardo alla posizione è trasmessa attraverso combinazioni o gradienti di proteine regolatrici
(fattori trascrizionali), che sono presenti in regioni
specifiche dell’organismo. Sono stati identificati più
di 80 geni coinvolti nell’induzione della fioritura e si
è capito che la fioritura in questa specie è regolata da
due vie di trasmissione del segnale che rispondono
all’ambiente (fotoperiodo/giorno lungo e temperatura/vernalizzazione) e da due vie che funzionano indipendentemente dai fattori ambientali: il percorso autonomo e quello legato alle gibberelline (Giovannini,
2006). Queste vie metaboliche sono costituite in
modo semplificato da diverse componenti (il segnale,
il recettore, il trasduttore, il fattore di trascrizione e da
uno o più geni bersaglio) obbligatoriamente collegate
durante la trasmissione dell’informazione e sono, a
loro volta, regolate da proteine regolatrici potenzialmente diverse. Anche i geni bersaglio che esse controllano sono diversi e specifici nel contesto in cui si
trovano (Carroll et al., 2004). Le quattro vie di trasmissione del segnale in Arabidopsis convergono
verso una via integrativa, che porta all’induzione dei
geni per l’identità del meristema fiorale ed allo sviluppo degli organi del fiore. Partirò proprio dalla formazione degli organi, per poi tornare temporalmente
indietro, verso la determinazione dei meristemi fiorali, e ancora più indietro fino all’induzione della fioritura, per illustrare le funzioni dei principali geni coinvolti in questo affascinante schema di sviluppo e valutare le loro applicazioni nel campo della ricerca sulle
specie ornamentali.
La morfologia del fiore è specificata dai geni per
l’identità degli organi fiorali: “floral organ identity
genes”
La bellezza dei fiori è imputabile all’assortimento
Fig. 1 - Il fiore della specie ornamentale Passiflora serratifolia L.
che mostra brillantemente la posizione dei quattro verticilli
concentrici dove si sviluppano gli organi del fiore: dall’esterno
all’interno i sepali, i petali sfrangiati, gli stami ed i carpelli.
Fig. 1 - The flower of the ornamental species Passiflora
serratifolia L. smartly showing, from outer to inner, the four
concentric whorls of organs: sepals, petals, stamens and carpels.
dei quattro tipi di organi situati rispettivamente in
quattro verticilli concentrici: i sepali nel primo, i petali nel secondo, gli stami nel terzo ed i carpelli (che
contengono gli ovuli) nel quarto (fig. 1). Lo sviluppo
organogenetico è sotto il controllo genetico e, grazie
all’isolamento di piante che hanno organi giusti in
una posizione scorretta (mutanti omeotici), è stato
possibile definire i geni (tab.1) responsabili dell’identità degli organi fiorali (Meyerowitz et al., 1989). Il
primo gene omeotico ad essere clonato è stato DEFICIENS di Anthirrinum (Sommer et al., 1990), seguito
da AGAMOUS di Arabidopsis (Yanofsky et al.,
1990). I geni codificavano fattori di trascrizione con
una somiglianza con la struttura del gene SRF presente nell’uomo e nel lievito. Ciascuno di questi geni
contiene una sequenza di 56 amminoacidi che è
necessaria alla proteina per legarsi al DNA; con la
prima lettera dei geni MCM1, AGAMOUS, DEFI-
Tab. 1 - Principali geni che determinano l’identità degli organi fiorali in Arabidopsis thaliana.
Tab. 1 - Representative floral organ-identity genes in Arabidopsis thaliana.
Nome del gene
Abbreviazione
Famiglia genica
APETALA 1
AP1
MADS box
APETALA2
AP2
Fattore di trascrizione a dominio AP2
APETALA3
AP3
MADS box
Bowman et al., 1993
PISTILLATA
PI
MADS box
Bowman et al., 1993
AGAMOUS
AG
MADS box
Yanofsky et al., 1990
SUPERMAN
SUP
MADS box
Bowman et al., 1993
SEPALLATA
SEP
MADS box
Pelaz et al., 2000
Bibliografia
Bowman et al., 1993
Chen, 2004
51
Giovannini
CIENS e SRF è stato coniato il termine MADS per
descrivere la classe di questi fattori di trascrizione. Le
proteine MADS-box nelle piante funzionano insieme,
in complessi detti a quartetto, per regolare una serie di
geni subordinati e specificare così l’identità degli
organi fiorali (Theissen, 2001).
Il modello di sviluppo postulato nel 1991 da Coen
e Meyerowitz in Arabidopsis sembra essere molto
conservato: i geni di classe A APETALA (AP1 and
AP2) specificano l’identità dei sepali e dei petali che
si sviluppano nei verticilli 1 e 2; inoltre reprimono
l’attività dei geni di classe C nei verticilli 1 e 2. I geni
di classe B APETALA3 (AP3) e PISTILLATA (PI)
sono necessari per specificare l’identità dei petali nel
secondo verticillo (A+B petali) e degli stami nel verticillo 3. Il gene della classe C AGAMOUS (AG) è
necessario per specificare l’identità del terzo verticillo
(B+C stami) e del 4 (carpelli). La seconda funzione
dei geni di classe C è quello di reprimere l’attività
della classe A nelle spirali 3 e 4. Geni ortologhi ai
geni ABC sono stati isolati in Antirrhinum (Ma e
dePamphilis, 2000), petunia (Van der Krol e Chua,
1993) e gerbera (Yu et al., 1999). La scoperta di un
altro gruppo di geni MADS-box chiamati SEPALLATA1, 2 and 3 (Pelaz et al., 2000) e coinvolti in modo
ridondante nel definire i petali, gli stami e i carpelli ha
portato ad una revisione del modello ABC. I geni SEP
sono stati definiti di classe E. Il modello “ABCE”
(Jack, 2004) postula che i sepali sono specificati solamente dall’attività dei geni di classe A (tetramero di
proteine AP1), i petali da A+B+E (tetrametro di proteine AP1-SEP-AP3-PI), gli stami da B+C+E (tetrametro di proteine AP3-PI-AG-SEP) ed i carpelli da
C+E (tetrametro di proteine AG-AG-SEP-SEP).
Esiste un altro gruppo di geni, identificato inizialmente in petunia, che era stato chiamato di classe D
(Colombo et al., 1995). I due geni FBP7 e FBP11
specificano l’identità della placenta e dell’ovulo in
petunia; gli ortologhi in Arabidopsis STK, SHP1 and
SHP2 (Pinyopich et al., 2003) sono necessari per il
corretto sviluppo degli ovuli. Il modello di sviluppo
organogenetico del fiore delle Angiosperme è quindi
stato chiamato ABCDE.
Studi recenti hanno dimostrato che l’espressione
del gene AP2 è inibita a livello post-trascrizionale dal
microRNA miR172 (Aukerman e Sakai, 2003). I
microRNA sono RNA di 20 nucleotidi non codificanti
che regolano l’espressione degli mRNA codificanti
proteine, attraverso meccanismi di degradazione dei
trascritti o di inibizione della traduzione (Hutvagner e
Zamore, 2002). Piante di Arabidopsis transgeniche
con elevati livelli della proteina AP2 hanno manifestato un meristema fiorale indeterminato, che produceva numerosi stami o petali, mentre una sovraespressione di miR172 ha portato ad una riduzione
della proteina AP2 ed un fenotipo a fioritura precoce
e difetti nell’identità degli organi fiorali (Aukerman e
Sakai, 2003; Chen, 2004). I siti di riconoscimento di
miR172 sui geni apetala-simili sono molto conservati
nelle angiosperme ed è stato quindi dimostrato che
l’espressione transgenica di miR172 di Arabidopsis in
specie eterologhe (Nicotiana benthamiana) può provocare alterazioni nel normale sviluppo del fiore
(Mlotshwa et al., 2006).
I geni che specificano l’identità dei meristemi fiorali: “flower meristem identity genes”
Gli organi del fiore si sviluppano sulle infiorescenze dal meristema fiorale. La transizione da meristema
dell’infiorescenza a meristema fiorale coinvolge cambiamenti nell’identità, nella fillotassi e nella determinazione del meristema. In seguito all’induzione della
fioritura i meristemi dell’apice vegetativo acquisisco-
Tab. 2 - Alcuni geni che partecipano alla determinazione dell’identità dei meristemi fiorali in Arabidopsis thaliana.
Tab. 2 - Representative flower meristem-identity genes in Arabidopsis thaliana.
Nome del gene
Abbreviazione
Famiglia genica
TERMINAL FLOWER1
TFL1
PEBP, simile a inibitori della Raf1 kinase animale
Bradley et al., 1996
LEAFY
LFY
Fattore trascrizionale MYB
Weigel et al., 1992
EMBRYONIC FLOWER2
EMF2
PcG (Polycomb Group)
CAULIFLOWER
CAL
MADS box
Bowman et al., 1993
FRUITFULL
FUL
MADS box
Gu et al., 1998
APETALA 1
AP1
MADS box
Bowman et al., 1993
UNUSUALFLORALORGANS
UFO
F-box
Simon et al., 1996
WUSCHEL
WUS
Omeobox
Mayer et al., 1998
52
Bibliografia
Sung et al., 2003
Geni della fioritura
no la competenza a diventare meristemi dell’infiorescenza e generano infiorescenze laterali o meristemi
fiorali, in una fillotassi spiralata. I geni coinvolti nella
determinazione dei meristemi fiorali (tab. 2) sono stati
identificati per la prima volta in mutanti in cui i fiori
erano sostituiti da germogli con caratteristiche di
infiorescenze. Il gene FLORICAULA di Anthirrhinum
(Coen et al., 1990) ed il suo ortologo LEAFY di
Arabidopsis (Weigel et al., 1992), codificano fattori
di trascrizione che impongono l’identità fiorale ai primordi che si sviluppano lateralmente al meristema
apicale, dopo l’induzione della fioritura. Le interazioni fra LFY e tre geni MADS-box, AP1, CAL e FUL
reprimono TERMINAL FLOWER 1 (TFL1), che mantiene il meristema apicale dell’infiorescenza in uno
stato indeterminato a crescita illimitata (Boss et al.,
2004). L’espressione costitutiva di LFY in
Arabidopsis accelera il tempo di fioritura: le piante
convertono precocemente le foglie ed i germogli
ascellari in fiori (Weigel e Nilsson, 1995). In queste
piante transgeniche l’espressione di AP1 era aumentata nel primordio fiorale e si ritrovava anche nelle
foglie (Liljegren et al., 1999). Quindi LFY induce l’espressione di AP1 (Wagner et al., 1999). Geni ortologhi ai geni che specificano l’identità del meristema
fiorale (LFY, AP1 e TLF1) sono stati isolati nella
bocca di leone (FLO, SQUA and CEN), così come i
loro geni co-regolatori UNUSUAL FLORAL ORGANS
(UFO). Durante i primi stadi di sviluppo del fiore sia
LFY che AP1 sono espressi in tutto il meristema fiora-
le (Gustafson-Brown et al., 1994). LFY stimola i geni
che determinano l’identità degli organi fiorali funzionando insieme al gene co-attivatore WUSHEL (WUS)
per attivare il geni di classe C class gene AG ed insieme ad UFO per attivare il gene di classe B AP3. AP1
insieme ad UFO hanno un effetto di regolazione positiva sul gene di classe B AP3 (Jack, 2004). LFY è
positivamente regolato dei geni della via metabolica
delle gibberelline (GAs), dal gene CONSTANS e dai
geni della via integrata FT e SOC1 (Blazquez et al.,
2006), descritti nel prossimo paragrafo.
I geni delle vie metaboliche che controllano il
tempo della fioritura: “flowering time genes”
In Arabidopsis sono state identificate quattro vie
metaboliche (del fotoperiodo, della vernalizzazione,
quella autonoma e quella delle gibberelline) che regolano l’induzione della fioritura e sono integrate fra
loro da una quinta via metabolica, definita integrativa
(tab. 3). Il gene FLOWERING LOCUS C (FLC) codifica un fattore di trascrizione MADS box, che è principalmente espresso negli apici vegetativo e radicale,
e agisce come repressore della fioritura, regolando
negativamente i geni della via metabolica integrata
FLOWERING TIME (FT), LFY e SUPPRESSOR OF
OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1). Una
volta espressi i geni FT, LFY e SOC1a loro volta attivano i geni dell’identità dei meristemi fiorali, dando
inizio al processo di fioritura. Diverse vie metaboli-
Tab. 3 - Alcuni geni rappresentativi delle vie metaboliche che in Arabidopsis portano all’induzione della fioritura.
Tab 3 - Representative genes of the different genetic pathways that participate to flower induction in Arabidopsis thaliana.
Via metabolica
Abbreviazione
Fotoperiodo
(luce dipendente)
CO
PHY
CRY
FRI
VIP
VNR2
Vernalizzazione
Autonoma
Gibberelline
Integrativa
FCA
LD
FPA
FLD
GA
FLC
SOC1
FT
Nome del gene
Famiglia genica
Fattore di trascrizione a dita di zinco
CONSTANS
Fitocromo
PHYTOCHROME
Criptocromo
CRYPTOCHROME
Genebank accession AF228499
FRIGIDA
PcG (Polycomb Group)
VERNALIZATION INDEPENDENCE
PcG (Polycomb Group)
VERNALIZATION2
Dominio che si lega all’RNA
Omeodominio
FLOWERING CA
Dominio che si lega all’RNA
LUMINIDEPENDENS
Istone deacetilasi
FLOWERING PA
Ormone vegetale
FLOWERING LOCUS D
MADS box
GIBBERELLIN
MADS box
FLOWERING LOCUS C
SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION
PEBP simile a inibitori della
OF CONSTANS
Raf1 kinase
FLOWERING LOCUS T
Bibliografia
Putteril et al., 1995
Mathews e Sharrock, 1997
Levy e Dean, 1998
Johanson et al., 2000
Zhang e van Nocker, 2002
Gendall et al., 2001
Macknight et al., 1997
Lee et al., 1994
Schomburg et al., 2001
He et al., 2003
Wilson et al., 1992
Michaels e Amasino, 1999
Samach et al., 2000
Kardailsky et al., 1999
53
Giovannini
che convergono per regolare i livelli di espressione di
FLC. Esso inoltre gioca un ruolo centrale nella risposta alla vernalizzazione ed è negativamente regolato
dalla via autonoma. E’ stato proposto (Sung et al.,
2003) che i geni EMBRIONIC FLOWER (EMF) possano funzionare indipendentemente da una via metabolica e che siano dei repressori dello sviluppo che
permettono alla pianta di mantenere uno stato vegetativo. Un nuovo meccanismo di regolazione, basato
sulla struttura della cromatina, è stato ipotizzato come
spiegazione dell’azione repressiva dei geni EMFs
(Moon et al., 2003). Il gene EARLY BOLTING IN
SHORT DAYS (EBS) fa parte di un complesso repressore trascrizionale che modula la struttura della cromatina ed è necessario per reprimere l’espressione di
FT e bloccare la fioritura nei giorni corti (Piñeiro et
al., 2003).
Fotoperiodo
Uno dei fattori esterni che maggiormente influenzano la fioritura è la qualità e la durata dello stimolo
luminoso. Lo sviluppo riproduttivo avviene quando i
giorni sono sufficientemente corti (piante brevidiurne)
o sufficientemente lunghi (piante longidiurne). In
Arabidopsis thaliana, che fiorisce in condizioni di
giorno lungo in primavera, la percezione della lunghezza del giorno nelle foglie avviene per opera di
geni che agiscono a cascata nella traduzione del
segnale. La luce rossa è accettata da proteine del citocromo codificate dai geni PHYTOCHROME (PHYAPHYE). I recettori per la luce blu denominati criptocromi sono proteine codificate dai geni CRYPTOCHROME CRY1 e CRY2 (Levy e Dean, 1998). In presenza di luce rossa PHYB reprime la funzione di CONSTANS (Putteril et al., 1995). Il gene CONSTANS è un
fattore trascrizionale che contiene il dominio denominato dita di zinco e stimola la fioritura attivando l’espressione dei geni FT, LFY e SOC1 (Samach et al.,
2000). L’espressione di CO oscilla in modo circadiano con un picco di mRNA intorno al crepuscolo nei
giorni lunghi e durante la notte in giorni corti
(Valverde et al., 2004). La proteina CO è molto labile
al buio, viene degradata dal proteasoma e si accumula
solo nei giorni lunghi inducendo la trascrizione del
gene FT nella foglia. Il trascritto del gene FT si
muove dalla foglia all’apice vegetativo, dove la proteina tradotta induce la formazione dei meristemi fiorali (Huang et al., 2005). Sotto la luce blu CRY2 inibisce PHYB e induce la fioritura (Lin, 2002). CRY1 coopera con CRY2 per reprimere la funzione dei geni
CONSTANS (CO) e GIGANTEA (GI). Una mutazione
puntiforme nel gene CRY2 conferisce un fenotipo a
fioritura precoce in condizioni di giorno corto in una
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accessione tropicale di Arabidopsis (El-Din El-Assal,
2001). La proteina GI è espressa con un ritmo circadiano.
Vernalizzazione
Il controllo genetico del fenomeno della vernalizzazione è stato scoperto grazie agli incroci effettuati
fra ecotipi annuali, che per fiorire richiedono un
periodo di freddo ed ecotipi estivi, che non lo necessitano (Michaels e Amasino, 2000). Diversi geni sono
stati isolati fra i quali FRIGIDA (FRI), un regolatore
positivo di FLC. L’ecotipo di Arabidopsis a fioritura
precoce ‘Columbia’ presenta delle mutazioni nel gene
FRI (Johanson et al., 2000). L’analisi molecolare dei
geni suggerisce che la vernalizzazione agisce riducendo l’espressione del repressore della fioritura (FLC)
in risposta ad un’estesa esposizione al freddo. Il gene
VERNALIZATION INSENSITIVE3 (VIN3) codifica
per una proteina che contiene un dominio PHD ed è
tradotto solo dopo un prolungato periodo di freddo
(Sung e Amasino, 2004). Altri due geni VERNALIZATION (VRN) 1 e VRN2 (Gendall et al., 2001) hanno
un’azione repressiva su FLC, mantenendo la cromatina in uno stato non codificante. I geni VERNALIZATION INDEPENDENCE (VIP1-VIP7) codificano
anch’essi per proteine regolatrici della struttura della
cromatina (Zhang e van Nocker, 2002).
Autonoma
La via metabolica autonoma è stata identificata
studiando piante mutanti che fioriscono tardi in qualsiasi condizione di fotoperiodo e sono molto sensibili
alla vernalizzazione (Koornneef et al., 1991). Dal
momento che tutti i mutanti contengono alti livelli di
mRNA del repressore FLC è ipotizzabile che nelle
piante normali i geni della via autonoma regolano
negativamente l’espressione di FLC. Alcuni geni
della via metabolica sono stati clonati fra i quali
LUMINIDEPENDENS (LD), FCA e FPA, che sono
maggiormente espressi nell’apice e nelle infiorescenze e poco espressi nelle foglie mature e nelle radici
(Simpson et al., 2004). Il gene FLOWERING LOCUS
D (FLD) codifica per una proteina, omologa ad un
membro del complesso dell’istone deacetilasi umana
che, deacetilando la cromatina di FLC, ne previene la
trascrizione (He et al., 2003).
Gibberelline
Le gibberelline (GAs) sono ormoni vegetali coinvolti in molti aspetti della crescita delle piante ed in
Arabidopsis promuovono la fioritura (Wilson et al.,
1992). Alcuni geni coinvolti nella biosintesi delle gibberelline sono stati isolati e clonati, e sembra agiscano
Geni della fioritura
aumentando l’attività trascrizionale del gene LEAFY
(Blázquez et al., 1998). In Lolium temulentum (King
ed Evans, 2003), l’aumento di GA nella foglia ed il
trasporto verso l’apice in giornate lunghe è uno dei
fattori che stimola la fioritura. Nella cultivar di uva
champagne Pinot Meunier invece le gibberelline inibiscono la fioritura (Boss e Thomas, 2002).
Applicazioni in alcune specie di interesse commerciale
Le tecniche di colture in vitro, rigenerazione e trasformazione genetica applicate alle piante ornamentali
hanno permesso di ottenere piante transgeniche in più
di 40 specie (Brand, 2006), comprese le specie commercialmente più importanti (rosa, crisantemo, garofano, petunia, orchidea, ciclamino, geranio, ecc.). Il
miglioratore genetico molecolare è sempre a caccia di
nuovi geni che possano modificare il colore e la struttura del fiore, l’architettura e l’altezza delle pianta,
l’aroma, la durata del fiore o del vaso fiorito, la resistenza ad insetti o malattie, una volta trasferiti ed
espressi nella specie di interesse (Yalcin-Mendi et al.,
2006). I recenti sviluppi delle conoscenze scientifiche
sulle vie metaboliche di trasmissione del segnale, che
inducono la fioritura in Arabidopsis, hanno portato
all’identificazione di nuove classi di geni utilizzabili
per ottenere precocità di fioritura (Roux et al., 2006).
In alcuni casi questi geni hanno modificato il tempo
della fioritura in specie evolutivamente lontane da
quelle in cui sono stati isolati.
L’espressione del gene PHYB1 di tabacco in crisantemo ha prodotto piante di statura ridotta, ma con
pochi effetti sulla formazione e lo sviluppo del fiore
(Zheng et al., 2001). La sovraespressione del gene
PHYA di avena nella cultivar di Aster ‘Sun Karlo’ ha
ridotto la durata della lunghezza critica del giorno
richiesta per l’induzione della fioritura. La sovraespressione dei geni PHYA e PHYB (di Arabidopsis) ha
inoltre aumentato il numero di rami fioriti prodotti per
pianta, migliorando la resa produttiva delle colture
transgeniche di Aster (Wallerstein et al., 2002). In
altre specie (Populus) l’espressione costitutiva dei
fitocromi ha prodotto alterazioni morfologiche e fisiologiche commercialmente inutilizzabili (Olsen et al.,
1997). L’uso di promotori inducibili e tessuto specifici, che permettano un’espressione temporale e spaziale mirata è auspicabile per poter ottenere dei vantaggi
produttivi nel settore delle piante ornamentali
(Franklin e Whitelam, 2006).
Il gene CONSTANS (CO) di A. thaliana Landsberg
erecta (Putteril et al., 1995) è stato trasferito nel genoma della pianta ornamentale Osteospermum ecklonis
(Asteraceae) con lo scopo di alterare l’induzione della
fioritura. Il cDNA di CO è stato clonato nel vettore di
espressione pGREEN, sotto il controllo del promotore
costitutivo 35S. La trasformazione genetica del tessuto fogliare di piante di Osteospermum micropropagate
è stata effettuata utilizzando il vettore Agrobacterium
tumefaciens, ceppo AGL1. L’espressione del gene
esogeno CO è stata riscontrata nelle foglie di piante
transgeniche (Giovannini et al., 2002), ma non si è
ottenuto il fenotipo a fioritura precoce, osservato in
piante di Arabidopsis che sovraesprimevano il gene
(Putterill et al., 1995). L’espressione costitutiva del
gene LFY ha indotto la fioritura nel pioppo ibrido
(Coupland, 1995) e nel limone (Peña et al., 2001),
riducendo la fase giovanile. Il gene AP1 è stato efficiente come LFY nell’indurre la fioritura in limone
senza produrre anomalie nello sviluppo, mentre non
sembra aver avuto effetto nel pioppo (Weigel e
Nilsson, 1995) e in O. ecklonis (Giovannini, com.
pers.).
L’espressione di geni eterologhi non è sempre prevedibile e richiede un elevato numero di tentativi per
arrivare ad un risultato efficace. La conservazione
della sequenza dei geni regolatori fra specie e generi
diversi ha permesso di identificare famiglie geniche
basandosi sulla somiglianza del DNA. Le tecniche di
biologia molecolare come la reazione a catena della
polimerasi (PCR) con primer oligonucleotidici degenerati (miscela di corti oligonucleotidi che si appaiono con tutte le possibili combinazioni di codoni) e lo
screening di genoteche (insieme di frammenti di
DNA o cDNA isolati casualmente) hanno facilitato
l’isolamento di geni omologhi da organismi modello.
Entrambe le tecniche si fondano sulla capacità di individuare la somiglianza di sequenze attraverso l’ibridazione di acidi nucleici.
L’avvento dei progetti di sequenziamento dei
genomi ha messo a disposizione una grande quantità
di dati computerizzati da utilizzare per il confronto di
sequenze. La facilità di studiare sequenze di DNA
differenzialmente espresse (microarray, Expressed
Sequence Tag data base) ed il confronto immediato
in banche dati, accessibili a tutti (GenBank, EMBLNucleotide Datatbase, ecc.), hanno fatto aumentare il
numero di geni depositati ogni anno in modo esponenziale. Più di 100 specie vegetali sono ormai rappresentate in banche dati di geni espressi (EST data
con
più
di
5.000.000
entrate
base)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.htm), incluse le specie ornamentali Antirrhinum
majus, Zinnia elegans, Petunia, Rosa e Alstroemeria
peruviana. Geni omologhi ai principali fattori di trascrizione coinvolti nella fioritura, sono stati identifi55
cati nelle specie ornamentali Lilium longiflorum
Thunb. (Benedito et al., 2004), Phalaenopsis (Chen et
al., 2005), Gerbera hybrida (Laitinen et al., 2005) e
Passiflora spp. (Dornelas et al., 2006), aprendo nuove
prospettive al miglioramento genetico molecolare.
Il gene omologo al gene induttore della fioritura
FT di Arabidopsis è stato isolato nella specie forestale
Populus trichocarpa (PtFT1) ed espresso in modo
costitutivo nella specie Populus tremula x
tremuloides. I tessuti trasformati hanno sviluppato
strutture fiorali direttamente dagli steli co-coltivati in
quattro settimane, rispetto al tempo normale di fioritura del pioppo, che varia da otto a venti anni. Gli autori
hanno anche rigenerato una linea transgenica di una
pianta femminile di Populus tremula a fioritura precoce con fiori normali (Böhlenius et al., 2006).
La strategia del silenziamento genico è stata applicata con successo da Fang et al. (2006), che hanno
ottenuto un fenotipo di Thellungiella halophila (crescione) a fioritura precoce, eliminando la necessità del
trattamento al freddo. Inizialmente hanno isolato il
gene omologo al gene repressore della fioritura FLC
di Arabidopsis, utilizzando primers costruiti sulle
parti conservate del gene. In un secondo tempo hanno
costruito un RNAi (RNA interference) per silenziare il
gene FLC di Thellungiella (ThFLC) a livello post-trascrizionale. Le piante transgeniche contenenti il
costrutto ThFLC RNAi non esprimevano la proteina
codificata da ThFCL: il ciclo vitale della pianta è
risultato ridotto da venti a quindici settimane, la fioritura è avvenuta dopo otto settimane, rispetto alle quarantacinque necessarie ai controlli per fiorire in assenza di vernalizzazione.
Prospettive future
Un giorno, quando il diagramma fiorale sarà definitivamente compreso e saranno stati isolati i corrispettivi geni nelle specie ornamentali, si riuscirà a
programmare a tavolino l’aspetto dei nuovi fiori del
futuro, manipolando i geni coinvolti nella determinazione degli organi. L’Università della California ha
già attuato dei programmi di ricerca al fine di produrre fiori transgenici, con strutture uniche ed esotiche,
in cui tutti e quattro gli organi sono sepali (attraverso
la soppressione dell’azione dei geni SEPALLATA), o
fiori in cui si ha una trasformazione dei sepali in petali (over espressione selettiva dei geni SEPALLATA).
L’ottenimento di fiori con un elevato numero di petali
è da sempre stata una prerogativa del miglioratore
genetico, che ha selezionato mutazioni genetiche
spontanee o indotte, al fine di ottenere, ad esempio,
rose con 40 petali, partendo dai 5 presenti nelle rose
56
selvatiche. Le tecnologie di espressione selettiva e di
silenziamento genico potranno essere applicate con
successo anche nelle specie ornamentali, per le quali
saranno stati identificati i geni che inducono (FT
omologhi) o che reprimono (FLC omologhi) la fioritura, al fine di dissociare la produttività delle colture
dai fenomeni ambientali esterni, come ad esempio
dalla vernalizzazione.
La storia delle scoperte dei geni che controllano
l’induzione e lo sviluppo del fiore fornisce un’importante conferma della capacità di interazione fra la
genetica classica e la genetica molecolare. Lo studio
attento dei mutanti a livello fenotipico ha portato a
fare delle previsioni riguardo all’espressione molecolare dei geni, successivamente confermate da esperimenti di over espressione o soppressione della funzione genica nella pianta. Nel prossimo futuro, come
auspicato da Morandini e Salamini (2003), genetisti e
biologi molecolari lavoreranno fianco a fianco, sfruttando la disponibilità di geni per la regolazione molecolare della fioritura e dell’architettura del fiore, al
fine di migliorare la qualità, la bellezza e la produttività delle colture ornamentali. Concludo con il pensiero del grande genetista Elliot Meyerowitz: “la capacità di trasformare i fiori secondo i nostri desideri non
può essere considerata irrilevante, in un mondo, in cui
la maggior parte del cibo per l’umanità consiste in
componenti dei fiori, o in loro prodotti, come semi e
frutti”.
Ringraziamenti
Un sentito ringraziamento al Dott. Enrico Farina
per il gradito incoraggiamento ed i suoi preziosi consigli nella lettura critica del manoscritto.
Riassunto
Negli ultimi anni le tecniche di miglioramento
genetico classico e quelle più avanzate di biologia
molecolare sono state utilizzate insieme, contribuendo
a fare luce sui meccanismi di crescita e differenziamento delle piante. La possibilità di ottenere specie
ornamentali transgeniche ha aumentato le risorse
disponibili per il miglioramento delle produzioni floricole. Le conoscenze sui meccanismi molecolari che
sono alla base dell’induzione fiorale, della determinazione dei meristemi fiorali e dello sviluppo degli
organi del fiore, acquisite nelle specie modello
Antirrhinum majus, Arabidopsis thaliana e Petunia
hybrida, hanno portato all’identificazione di numerose classi di geni, potenzialmente utili al miglioratore
genetico molecolare.
Giovannini
Parole chiave: Arabidopsis thaliana, agricoltura
molecolare, meristema fiorale, sviluppo organogenetico, tempo della fioritura
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