Download 39 Capitolo II Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti

Capitolo II
Caratterizzazione tecnologica dei ceppi di batteri lattici
isolati da impasti acidi per la produzione del Cornetto, un
pane trdizionale della Basilicata (Sud Italia)
Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione
del pane Cornetto di Matera, sono stati identificati mediante SDS-PAGE
delle proteine intracellulari totali e testati per la capacità acidificante,
attività antimicrobica e produzione di esopolisaccaridi (EPS). Il 55% degli
isolati apparteneva alla specie Lactobacillus plantarum, il 15% e il 13%
alle specie Leuconostoc mesenteroides e Lb. curvatus, rispettivamente.
Cinque ceppi di Lb. paraplantarum, due di Weissella cibaria e uno di Lb.
pentosus sono stati ugualmente isolati tra la microflora lattica. Diversi ceppi
di Lb. plantarum e Leuc. mesenteroides presentavano un’elevata capacità
acidificante. L’attività antimicrobica è stata testata nei confronti di cinque
ceppi indicatori. Le specie avevano diversi profili di inibizione e in alcuni
casi l’attività antimicrobica era ceppo-specifica. Lb. plantarum aveva il
più ampio spettro di inibizione, mentre gli isolati di W. cibaria e Leuc.
mesenteroides non mostravano alcuna attività antimicrobica. Nessun ceppo
aveva attività antimicrobica nei confronti di Bacillus cereus. L’attività
inibitoria di cinque ceppi era probabilmente dovuta alla produzione di
batteriocine. Gli isolati di Lb. curvatus non erano in grado di produrre EPS
in substrato solido, mentre tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides e W. cibaria
producevano destrano dal saccarosio. Alcuni ceppi di Lb. plantarum e Lb.
paraplantarum producevano EPS da diversi zuccheri in substrato solido.
La produzione in substrato liquido era differente a seconda della specie.
Diversi ceppi di Lb. plantarum hanno mostrato la più alta produzione di
EPS nei substrati contenenti glucosio e maltosio come fonte di carbonio,
altri avevano una buona produzione in tutti i terreni.
2.1. Introduzione
La fermentazione degli impasti acidi è importante nella produzione di
pane perché contribuisce al sapore e alla consistenza del prodotto finito.
Gli impasti acidi sono una miscela di farina di frumento o segale e acqua,
fermentato da un’associazione di batteri lattici e lieviti, la cui composizione
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dipende dalla tecnologia applicata per la sua produzione (e Gänzle Vogel
2002; Vogel et al., 1999). Le differenze nella farina, negli ingredienti e nella
tecnologia possono influenzare la composizione microbica dell’impasto
e le caratteristiche dei prodotti da forno (Corsetti et al., 2001). I batteri
lattici svolgono un ruolo importante nella fermentazione acida (Foschino
et al. 1999; Gobbetti, 1998). Le specie omofermentanti sono importanti
per la produzione di pane con mollica porosa e contribuiscono alla qualità
sensoriale, mentre quelle eterofermentanti, con i loro prodotti metabolici,
influenzano il sapore e promuovono la lievitazione del impasto (Rocha
e Malcata 1999). In Italia più di 200 tipi di pani tradizionali sono stati
recentemente classificati dall’Istituto Nazionale di Sociologia Rurale
(Insor, 2000). Gli impasti acidi sono utilizzati in oltre il 30% dei prodotti
da forno, alcuni dei quali provengono da una tradizione molto antica e
si differenziano per il tipo di farina, ingredienti, tecnologia e shelf-life
(De Vuyst e Neysens, 2005). Il Cornetto è pane un tradizionale, prodotto
nelle piccole panetterie di Matera (Basilicata, Italia meridionale), che
recentemente ha ottenuto la denominazione IGP da parte della Comunità
Europea (decreto 9/6/2007, Gazzetta Ufficiale dell’Unione Europea n. 239,
11/10/2004). Secondo lo standard IGP, questo pane è prodotto utilizzando
farina di grano duro, NaCl (2% w/w), acqua e madre acida come agente
lievitante. Se necessario, del lievito compresso (max 1% w/w) può essere
aggiunto per rinforzare il processo di lievitazione. Gli impasti acidi utilizzati
per la produzione del Cornetto sono quelli di tipo Ib (De Vuyst e Neysens,
2005): la fermentazione è effettuata a temperatura ambiente (20-30°C), con
un pH finale pari 4, ed è caratterizzata da continui rinfreschi giornalieri per
mantenere la microflora in uno stato attivo.
L’obiettivo di questo studio è stato l’identificazione e la caratterizzazione
tecnologica dei batteri lattici isolati da impasti acidi per la produzione del
Cornetto, al fine di selezionare ceppi con proprietà tecnologiche interessanti
e rilevanti per la produzione di pane.
2.2. Materiali e metodi
2.2.1. Ceppi e condizioni di coltura
Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione
del Cornetto di Matera e identificati precedentemente con test fenotipici
(Ricciardi et al., 2002), sono stati utilizzati in questo studio. I ceppi sono stati
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mantenuti come colture liofilizzate in latte (11% w/v) contenente lattosio
(40 g/L) e acido ascorbico (20 g/L) nella collezione dei microrganismi
del Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali,
Università della Basilicata (Potenza, Italia) e propagate in MRS liquido
a 30°C. Lactobacillus paracasei DSM4905, Lb. plantarum DSM20174,
Micrococcus flavus DSM1790 (ottenuti da Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen e Zellkülturen, Braunschweig, Germania), Listeria
innocua BL86/26 (ottenuto dalla Collezione National Dairy Products
Research Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irlanda) e Bacillus cereus
ATCC9139 (ottenuto da American Type Culture Collection, Manassas,
Virginia, Stati Uniti d’America) sono stati utilizzati come indicatori per
testare l’attività antimicrobica (vedi sotto). Lb. paracasei DSM4905
e Lb. plantarum DSM20174 sono stati coltivati in MRS liquido a 30°C
per 16 ore, mentre M. flavus DSM1790, L. innocua BL86/26 e B. cereus
ATCC9139 sono stati coltivati in Tryptone Soy Broth (Oxoid) con 0,6%
(w/v ) di estratto di lievito (Oxoid) (TSBYE) a 30°C per 16 ore.
2.2.2. Identificazione mediante SDS-PAGE delle proteine cellulari totali
I ceppi di batteri lattici sono stati identificati mediante SDS-PAGE delle
proteine cellulari totali, come descritto da Ricciardi et al. (2005). I ceppi
isolati dagli impasti e i ceppi di riferimento sono statai coltivati in APT
liquido. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione (12000 xg,
5 min), lavate due volte in tampone Tris/HCl 50 mmol/L, pH 8, e risospese
in 150 μL dello stesso tampone contenente 2 mg di lisozima/ml (Sigma).
Delle biglie di vetro (0,15 a 0,212 mm di diametro, Sigma) sono state
aggiunte e la sospensione cellulare è stata agitata su vortex ad alta velocità
per 3 min. Le sospensioni cellulari sono state incubate a 37°C per 1 ora e
sottoposte a tre cicli di sonicazione (10 min per ogni trattamento, potenza
10%; Sonorex Super 10P, Bandelin, Berlino). Dopo l’incubazione, le biglie
di vetro e i frammenti di cellule sono stati rimossi mediante centrifugazione
(12000 xg, 5 min) e i surnatanti sono stati utilizzati per l’SDS-PAGE.
La concentrazione delle proteine nei lisati cellulari è stata determinata
utilizzando il metodo Bradford (Bradford, 1976). Le corse elettroforetiche
sono state realizzate utilizzando un apparato MiniProtean III (Bio-Rad
Laboratories) e dei gel contenenti una concentrazione di acrilamide/bis al
10% w/v (Piraino et al., 2002). Undici campioni (contenenti da 5-10 μg di
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proteine) e due standard molecolari (Sigma) sono stati applicati a ciascuna
gel. I gel sono stati corsi con un’intensità di 20 mA per 3 ore utilizzando
un’unità Power Pack 3000 (Bio-Rad). Le immagini dei gel sono state
acquisite mediante scanner, salvate nel software Diversity DatabaseTM
(Bio-Rad Laboratories Ltd, Watford, Herts, Regno Unito) ed elaborate
per l’identificazione delle bande. I dati ottenuti dal software Diversity
DatabaseTM sono stati importati nel software Microsoft ExcelTM (Microsoft
Corporation, 2003) per un’ulteriore elaborazione.
2.2.3. Caratterizzazione tecnologica degli isolati
2.2.3.1. Capacità acidificante
Le culture cellulari in SDB modificato (Kline e Sugihara, 1971) sono state
ottenute inoculando (1% v/v) e incubando per 16 ore a 30°C il substrato
SDB con le colture congelate. Dopo l’incubazione, le culture cellulari sono
state standardizzate ad una densità ottica a 650 nm (DO650) pari a 1 ed
utilizzate per inoculare (5% v/v) tubi sterili contenenti SDB liquido. Il pH è
stato misurato dopo 6 e 24 ore e la sua diminuzione (∆pH) è stata calcolata,
per ogni tempo di incubazione, come la differenza tra i valori al tempo t=0
ore ed i valori ai tempi successivi.
2.2.3.2. Attività antimicrobica
La capacità inibitoria contro Lb. paracasei DSM4905, Lb. plantarum
DSM20174, M. flavus DSM1790, L. innocua BL86/26 e B. cereus ATCC9139
è stata testata utilizzando il metodo descritto da Parente et al. (2001). Lb.
paracasei DSM4905 e Lb. plantarum DSM20174 sono stati propagati su
MRS agar modificato (MRS liquido tamponato a pH 6,5 contenente acido
morfolin propanosulfonico 0,1 mol/L, Sigma, e Agar 0,6% w/v, Oxoid),
mentre L. innocua BL86/26, M. flavus DSM1790 e B. cereus ATCC9139
su TSBYE con 0,6% w/v di agar. Il diametro delle zone di inibizione è
stato misurato utilizzando un calibro. I ceppi con una zona di inibizione con
diametro > 10 mm avevano attività antimicrobica. Per valutare se l’inibizione
era dovuta alla presenza di batteriocine, il test è stato ripetuto in presenza
di 5 μL di tripsina (Sigma), chimotripsina (Sigma) o pronase (Boehringer).
Le soluzioni sono state preparate sciogliendo 0,2% (w/v) di enzima in una
soluzione di tampone Tris 50 mmol/L (pH 7,5) contenente CaCl2 5 mmol/L,
filtrata con un filtro Millex-GV (Millipore spa, Milano, Italia). Sulle piastre è
stato inserito un controllo negativo costituito da tampone sterile senza enzimi
e l’assenza della zona di inibizione enzimatica era la prova della presenza
delle batteriocine.
2.2.3.3. Produzione di EPS
I ceppi di batteri lattici sono stati testati per la produzione di esopolisaccaridi
(EPS) su piastre di MRS agar contenenti il 2% (w/v) di glucosio (MRS)
o di maltosio (mMRS) o il 5% (w/v) di saccarosio (sMRS) come fonti di
carbonio. Le piastre sono state incubate a 30°C per 48 ore e i ceppi che
producevano colonie viscose erano produttori di EPS. I ceppi produttori
di EPS in substrato solido sono stati selezionati per la produzione di EPS
in substrato liquido, testata utilizzando il metodo capillari dei capillari da
ematocrito come descritto da Ricciardi et al. (1997). La concentrazione di
EPS in substrato liquido (MRS, mMRS, sMRS) è stata misurata utilizzando
il metodo Dubois, dopo la rimozione dei carboidrati semplici attraverso
cromatografia liquida ad esclusione molecolare (Ricciardi et al., 1998). Otto
ceppi di Lb. plantarum e/o Lb. paraplantarum, con una concentrazione di
EPS > 50 mg/L, sono stati utilizzati per un ulteriore esperimento di mMRS
liquido in cui è stata misurata la concentrazione di EPS (metodo Dubois)
e la viscosità del substrato con un viscosimetro digitale (Brookfield DV-I
+; Brookfield Ingegneria Laboratories, Stoughton, MA, USA) dotato di una
girante S21C ad una velocità di 100 giri/min a 10°C.
2.2.4. Analisi statistica
L’analisi statistica delle proteine identificate mediante SDS-PAGE è stata
effettuata utilizzando una trasformazione logaritmica del peso molecolare (log
kDa), come descritto da Piraino et al. (2002). Le analisi sono state effettuate
nel range tra 10 kDa e 126 kDa, individuando 23 classi di proteine. La cluster
analysis gerarchica (UPGMA) è stata effettuata utilizzando una distanza
Gamma. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software
Systat 10 per Windows (SPSS, Chicago, IL, Stati Uniti d’America).
2.2.5. Reagenti e substrati
Dove non specificato tutti i reagenti sono stati ottenuti dalla Sigma-Aldrich
(Milan, Italy), mentre i terreni di crescita e gli ingredienti sono stati ottenuti
dalla Oxoid (Basingstoke, Hampshire,UK).
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3. Risultati e discussione
Identificazione dei batteri lattici isolati da impasti acidi
Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione
del Cornetto di Matera, identificati precedentemente con test fenotipici
(Ricciardi et al., 2002), sono stati scelti a caso tra 407 isolati e la loro
identificazione è stata confermata attraverso SDS-PAGE delle proteine
cellulari totali. La correlazione tra i ceppi di riferimento e i ceppi isolati
dagli impasti è mostrata in Figura 1.
Figura 1. Dendrogramma della distanza (gamma) tra i ceppi di batteri lattici isolati dal
Cornetto di Matera.
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La classificazione ha generato otto gruppi ad una distanza arbitraria di
0,24. La maggior parte dei ceppi identificati appartenevano alle specie
eterofermentanti facoltative Lactobacillus paraplantarum (gruppo 2), Lb.
plantarum (gruppo 3), Lb. pentosus (gruppo 4) e Lb. curvatus (gruppo 6).
Ceppi appartenenti alle specie eterofermentanti obbligate Leuconostoc
mesenteroides e Weissella cibaria sono stati ugualmente identificati (gruppi
1 e 5, rispettivamente). I ceppi della specie Leuc. mesenteroides non sono
stati identificati a livello di sottospecie, poichè i pattern SDS-PAGE delle
sottospecie Leuc. mesenteroides spp. mesenteroides e Leuc. mesenteroides
spp. cremoris erano molto simili tra di loro.
La percentuale di ceppi eterofermentanti obbligati e facoltativi è risultata
inferiore a quella riscontrata in altri impasti acidi italiani (Corsetti et al.,
2001; Gobbetti et al., 1994) in cui Lb. sanfranciscensis, in associazione
con Lb. plantarum o con Lb. alimentarius, era la specie dominante. Una
simile composizione, sia in termini di percentuale di ceppi eterofermentanti
obbligati e facoltativi che di specie associate, è stata trovata negli impasti
acidi utilizzati per la produzione del pane di Altamura, in cui l’88% degli
isolati appartenevano alle specie Lb. plantarum, Lb. casei e Lb. paracasei
e il 12% a Lb. brevis e Leuc. mesenteroides (Ricciardi et al., 2005). Uno
studio sulla popolazione microbica di impasti acidi tradizionali siciliani ha
recentemente confermato che i ceppi di Lb. plantarum hanno una grande
rilevanza: tra il 45 isolati di batteri lattici, 17 sono stati identificati come
Lb. sanfranciscensis, 14 come Lb. plantarum, 4 come Lb. kimchii/Lb.
alimentarius e 3 come Lb. casei (Randazzo et al., 2005).
Alte percentuali di specie omofermentanti (Lb. plantarum e Lb. pentosus;
dal 68% nel pane Carasau al 98% nel pane Moddizzosu) sono state trovate
negli impasti acidi utilizzati per la produzione di alcuni pani tipici della
Sardegna (Catzeddu et al ., 2005). In questo studio sulla diversità delle
comunità di batteri lattici è stato dimostrato che le specie eterofermentanti
non dominano la microflora degli impasti tradizionali sardi, ad eccezione
di alcuni campioni derivanti da impasti per la produzione del pane Zichi.
L’identificazione dei ceppi di W. cibaria, ottenuta in questo studio, ha
confermato i risultati ottenuti da De Vuyst et al. (2002). W. cibaria, una
specie geneticamente affine a W. confusa (Bjorkroth et al., 2002), è stata
isolata per la prima volta da impasti acidi greci preparati senza l’aggiunta
di lievito. Questa specie eterofermentante obbligata è stata, speso, trovata
45
in associazione con ceppi appartenenti a Lb. sanfranciscensis, Lb. brevis e
Lb. paralimentarius. Ceppi di W. confusa, invece, sono stati recentemente
isolati da farine biologiche e impasti acidi per la produzione di pani del
Centro e Sud Italia, insieme a ceppi di Lb. sanfranciscensis, Lb. brevis,
Lb. alimentarius, Lb. plantarum, Lb. farciminis e Lb. fructivorans (Corsetti
et al., 2003). Anche se in percentuali e in associazioni diverse, le specie
identificate in questo studio sono state isolate in impasti prodotti in altri
paesi europei. Le associazione tra Lb. plantarum, Lb. brevis e Lb. fermentum,
e tra Lb. acidophilus e Lb. plantarum dominano gli impasti di segale In
Russia e in Finlandia, rispettivamente (De Vuyst e Neysens, 2005). Batteri
lattici appartenenti alle spceie Lb. brevis e Lb. curvatus sono le specie più
frequentemente isolati in impasti acidi portoghesi preparati con farina di
mais (Rocha e Malcata, 1999).
Caratterizzazione tecnologica dei batteri lattici
Per selezionare ceppi da utilizzare come colture starter nella produzione
del Cornetto di Matera, è stata effettuata una caratterizzazione tecnologica
preliminare dei 41 isolati di batteri lattici. I ceppi sono stati caratterizzati
sulla base della capacità acidificante, dell’attività antimicrobica e della
produzione di esopolisaccaridi (EPS).
La Figura 2 mostra la distribuzione della capacità acidificante dei ceppi
dopo 6 e 24 ore di incubazione a 30°C in substrato sintetico (box a e b,
rispettivamente). La diminuzione del pH (ΔpH) variava da 0,1 a 1,1 unità
dopo 6 ore e da 0,7 e 2,8 unità dopo 24 ore. Una elevata variabilità tra i ceppi
delle specie Lb. curvatus e Leuc. mesenteroides è stata osservata dopo 6 e 24
ore. Al contrario, gli isolati appartenenti alla specie W. cibaria e al gruppo
Lb. plantarum (che comprende le specie Lb. plantarum, Lb. paraplantarum
e Lb. pentosus) hanno mostrato una simile diminuzione di pH. I ceppi di W.
cibaria e alcuni di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum avevano la più alta
capacità acidificante dopo 6 ore di incubazione, mentre i ceppi della specie
Lb. curvatus presentavano i più bassi valori della diminuzione di pH. Al
termine dell’incubazione, la maggior parte dei ceppi appartenenti al gruppo
Lb. plantarum e alcuni ceppi della specie Leuc. mesenteroides avevano i
più alti livelli di capacità acidificante.
L’acidificazione dell’impasto, a causa della produzione di acido lattico da
ceppi omofermentanti e di acido lattico e acetico da ceppi eterofermentanti,
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è un importante attività metabolica nella produzione di pane. La produzione
di acidi organici durante la fermentazione consente di raggiungere un pH
inferiore a 5, efficace nel prevenire il deterioramento noto come “pane
filante” causata da ceppi di Bacillus spp., in particolare di Bacillus subtilis
e Bacillus licheniformis (Pepe et al., 2003). L’acido lattico e acetico
prodotti durante la fermentazione hanno un piccolo effetto sul sapore del
pane. Tuttavia, se combinati con l’etanolo e altri prodotti di fermentazione,
rafforzano la percezione dell’aroma (Rock, 1996). In realtà, quando il
rapporto tra lattato/acetato (quoziente di fermentazione, FQ) è nel range tra
2,0 e 2,7 viene percepito un piacevole odore del pane. La diminuzione del
pH è importante anche per ottenere corrette proprietà reologiche e sensoriali
nel pane (Rock, 1996).
Figura 2. Grafici della distribuzione del decremento di pH dopo 6 ore (a) e 24 ore (b) tra
i ceppi di batteri lattici isolati da impasti acidi utilizzati per la produzione del Cornetto di
Matera. Lb. curvatus (Lbcu); Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. plantarum (Lbplgroup);
Leuc. mesenteroides (Leme); W. cibaria (Wecb).
(a)
(b)
L’attività antimicrobica dei batteri lattici è stata testata contro ceppi che sono
starter o contaminanti dei prodotti da forno. Nessuno ceppo di W. cibaria
e Leuc. mesenteroides ha mostrato attività antimicrobica nei confronti dei
ceppi indicatori. Gli isolati di Lb. curvatus non erano in grado di inibire
M. flavus DSM1790, mentre è stata trovata attività antilisteriale tra i ceppi
appartenenti alle specie Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Lb. pentosus
(dati non mostrati). La specie Lb. plantarum aveva il più ampio spettro
di inibizione; alcuni ceppi, infatti, mostravano zone di inibizione contro
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L. innocua e Lb. plantarum, altri contro M. flavus e Lb. paracasei. Tutti
i ceppi avevano una bassa attività antagonista nei confronti di B. cereus.
Per alcuni ceppi è stata trovata un’attività inibitoria di natura proteica. La
Tabella 1 mostra i risultati dei sei ceppi di batteri lattici con attività inibitoria
di natura proteica (possibile produzione di batteriocine). La resistenza agli
enzimi proteolitici è stata testata sui ceppi che hanno mostrato il più ampio
spettro di inibizione. Ad eccezione di Lb. plantarum DBPZ1019, tutti i
ceppi erano sensibili all’azione dei tre enzimi proteolitici ed erano inibitori
contro Lb. plantarum, mentre solo due ceppi (Lb. curvatus DBPZ1024
e Lb. plantarum DBPZ1019) hanno mostrato inibizione nei confronti di
Bacillus cereus.
Tabella 1. Attività antimicrobica dei batteri lattici isolati da impasti acidi utilizzati per la
produzione del Cornetto di Matera
Ceppi
Indicatori a
Enzimi b
BC
LI
LBP
LBPL
MF
Lb. curvatus DBPZ1024
-
++
++
+++
-
T, C, P
Lb. pentosus DBPZ0984
+
++
++
+++
+
T, C, P
Lb. plantarum DBPZ1003
-
+
-
++
-
T, C, P
Lb. plantarum DBPZ1012
-
-
++
++
-
T, C, P
Lb. plantarum DBPZ1021
++
+
-
++
++
T, C, P
Lb. plantarum DBPZ1019
-
++
+
+++
++
C
-, nessuna zona di inibizione; +, diametro della zona di inibizione < 5 mm; + +, diametro della zona di
inibizione tra 5 and 10 mm; + + +, diametro della zona di inibizione ≥ 10 mm.
a
BC, B. cereus ATCC9139; LI, L. innocua BL86/26; LBP, Lb. paracasei DSM4905; LBPL, Lb. plantarum
DSM20174; MF, M. flavus DSM1790
b
T, tripsina; C, chimotripsina; P, pronase
Gli studi sulla produzione dei composti antimicrobici prodotti dai batteri lattici
degli impasti acidi sono impartanti per ridurre la contaminazione microbica
durante la fermentazione (Pepe et al., 2003; Corsetti et al., 1996) e per spiegare
la competizione tra microflora lattica, al fine di selezionare ceppi competitivi
(Torodov et al., 1999). Questo studio, in accordo con Corsetti et al. (1996),
ha dimostrato che gli isolati erano in grado di inibire altri ceppi appartenenti
al genere Lactobacillus, anche se i profili di inibizione erano ceppo-specifici
Corsetti et al. (1996) hanno dimostrato la produzione di batteriocine da Lb.
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sanfranciscensis C57. In un secondo lavoro, Corsetti et al. (2004) hanno
confermato la presenza di batteriocine in due ceppi di Lb. plantarum e Lb.
pentosus isolati da impasti acidi. Queste batteriocine erano caratterizzate da un
limitato spettro di inibizione e non avevano efficacia nei confronti di Bacillus
spp., Listeria innocua e lieviti. Settanni et al. (2005) hanno dimostrato la
presenza di attività inibitoria nel ceppo Lc. lactis ssp. lactis M30 durante la
fermentazione degli impasti acidi. La produzione di batteriocine nella specie
Lb. plantarum è stata dimostrata da Todorov et al. (1999), che hanno isolato
e ha caratterizzato la batteriocina plantaricina ST341 da Lb. plantarum ST31.
Lb. amylovorus DCE 471, un ceppo importante negli impasti di segale di
tipo II per la sua elevata e rapida capacità acidificante, è un produttore di
batteriocine (amylovorina) durante la fermentazione (Messens et al., 2002).
La Tabella 2 mostra i risultati dello screening dei ceppi per la produzione di
EPS in substrato solido e liquido. I ceppi di Lb. curvatus non erano in grado di
produrre EPS in substrato solido, mentre tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides e
W. cibaria producevano destrano da saccarosio. Alcuni ceppi di Lb. plantarum,
Lb. paraplantarum e Lb. pentosus erano in grado di produrre EPS dai diversi
zuccheri in substrato solido. Gli isolati di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum
hanno mostrato la più alta produzione di EPS in substrato liquido contenente il
maltosio come fonte di carbonio. Tuttavia, dei flussi relativamente elevati sono
stati osservati nei ceppi di Lb. plantarum e in due ceppi di Lb. paraplantarum
quando erano coltivati in MRS contenenti glucosio o di saccarosio. Al contrario,
tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides e W. cibaria avevano la più alta produzione
di EPS in MRS liquido contenente saccarosio come fonte di carbonio.
I risultati della produzione di EPS in substrato liquido (MRS contenente
maltosio) sugli otto ceppi selezionati di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum
sono riportati nella Tabella 3. La quantità di EPS prodotti da Lb. plantarum e
Lb. paraplantarum variava da 140 a 297 mg/L. Il più alto valore di viscosità
è stato osservato per il ceppo Lb. plantarum DBPZ1014. Tuttavia, la viscosità
del substrato e la concentrazione di EPS non sono correlati. Infatti, quando Lb.
plantarum DBPZ0998 o Lb. plantarum DBPZ1015 erano coltivati in mMRS
liquido i valori di viscosità erano alti ma la produzione di EPS era molto bassa,
al contrario, il substrato fermentato con Lb. paraplantarum DBPZ0997 aveva
il più basso valore di viscosità ma la più alta concentrazione EPS.
Gli EPS sintetizzati dai batteri lattici svolgono un ruolo importante nella
produzione dei prodotti lattiero-caseari. Gli EPS possono, infatti, sostituire
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Tabella 2. Screening per la produzione di for EPS in substrato liquido e solido
Substratia
Ceppi
Pick test
MRS
Pick test
mMRS
Pick test
sMRS
Flussob
MRS
Flussob
mMRS
Flussob
sMRS
Lb.paraplantarum DBPZ1027
+
+
+
3
3
3
Lb. paraplantarum DBPZ1013
+
+
+
3
12
12
Lb. paraplantarum DBPZ0997
+
+
+
8
12
12
Lb. plantarum DBPZ0990
+
+
+
3
12
8
Lb. plantarum DBPZ0987
+
+
+
7
12
8
Lb. plantarum DBPZ0988
+
+
+
6
12
12
Lb. plantarum DBPZ0993
+
-
-
4
1
1
Lb. plantarum DBPZ0989
+
+
-
1
1
1
Lb. plantarum DBPZ0991
-
+
-
1
2
1
Lb. plantarum DBPZ0992
+
+
-
7
12
1
Lb. plantarum DBPZ0998
+
+
+
7
12
5
Lb. plantarum DBPZ1003
+
+
+
3
12
6
Lb. plantarum DBPZ1011
+
+
+
11
12
4
Lb. plantarum DBPZ1015
+
+
+
8
12
12
Lb. plantarum DBPZ1014
+
+
+
11
12
6
Lb. plantarum DBPZ1012
+
+
-
2
1
1
Leuc. mesenteroides DBPZ1028
-
-
d
1
1
12
Leuc. mesenteroides DBPZ0995
-
-
d
1
1
9
Leuc. mesenteroides DBPZ1005
-
-
d
1
1
12
Leuc. mesenteroides DBPZ0985
-
-
d
1
1
6
Leuc. mesenteroides DBPZ0986
-
-
d
1
1
12
Leuc. mesenteroides DBPZ1016
-
-
d
1
1
12
Leuc. mesenteroides DBPZ1026
-
-
d
1
1
12
W. cibaria DBPZ1017
-
-
d
1
1
2
W. cibaria DBPZ1016
-
-
d
1
1
3
+, colonie viscose; d, colonie di destrano; -, nessuna colonia viscosa o di destrano
a
MRS, substrato con glucosio; mMRS, substrato con maltosio; sMRS, substrato con saccarosio
b
rapporto tra il flusso del substrato fermentato e il flusso di controllo (massimo rapporto del flusso = 12)
50
Tabella 3. Produzione di EPS e viscosità nel substrato liquido
Ceppi
Lb. paraplantarum DBPZ1013
Lb. paraplantarum DBPZ0997
Lb. plantarum DBPZ0987
Lb. plantarum DBPZ0988
Lb. plantarum DBPZ0992
Lb. plantarum DBPZ0998
Lb. plantarum DBPZ1015
Lb. plantarum DBPZ1014
Substrato
Viscosità a 100
rpm (cP)
EPS (mg/L)
mMRS
mMRS
mMRS
mMRS
mMRS
mMRS
mMRS
mMRS
8
6
9
7
7
7
8
10
251
244
273
297
228
140
141
242
gli idrocolloidi utilizzati per migliorare la tessitura, la viscosità, la struttura
delle micelle di caseina, la sineresi e la stabilità dei formaggi (Duboc e
Mollet 2001). Tuttavia, l’importanza degli EPS nella produzione di pane
non è stata ancora interamente descritta. Gli EPS prodotti durante la
fermentazione sono potenzialmente in grado di influenzare le proprietà
reologiche dell’impasto e di conseguenza il volume, la tessitura e la
conservazione del pane (Korakli et al., 2001). Recentemente, Korakli et al.
(2003) hanno dimostrato che Lb. sanfranciscensis LTH2590 è in grado di
produrre da saccarosio un tipo di levan-fruttano che influenza positivamente
l’impasto e la tessitura del pane, mentre Lb. reuteri LB121 produce glucano
e levano dalla stessa fonte di zucchero (van Geel-Schutten et al., 1998). Gli
EPS, inoltre, possono influenzare la flora intestinale, poichè i fruttani e i
levani stimolano la crescita dei bifidobacteria (Thieking et al., 2003).
Il presente studio ha dimostrato che alcuni ceppi di batteri lattici possono
essere utilizzati come coltura starter per la produzione di pane, grazie
alla loro capacità acidificante, attività antimicrobica e produzione di
EPS. Tuttavia, queste proprietà tecnologiche, insieme ad altre attività del
metabolismo microbico come la proteolisi, dovrebbe essere studiate in
dettaglio per comprendere maggiormente il ruolo dei batteri lattici durante
la fermentazione degli impasti acidi.
51
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