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Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição de tipo II Descoberta Sistemas de modificação restrição Como actuam Aplicações Lise de bactérias após infecção fágica Sistemas de Restrição-Modificação X X X X Y Y X X Y Y Y Modificação e restrição de um vírus, controlado pelo hospedeiro Modificação do DNA METILAÇÃO 1) Modificação do DNA- METILAÇÃO 2) Principal dador dos grupos metilo: SAM (S-adenosil metionina) SAM ATP CH3 activo S-adenosil-homocisteína Metionina CH3 Homocisteína H2O Exemplo de metilação Metilações mais frequentes • • • • m6A- N6-metiladenina m5C- C5-metilcitosina m4C- N4-metilcitosina hm5C- C5-hidroximetilcitosina Sistemas de Restrição-Modificação Tipo I- ex sistema EcoKI, que só clivam DNA NÃO METILADO Tipo II- consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NÃO METILADO Tipo III Sistemas de Restrição (endonucleases) McrA- C*CGG McrB- G*C Mrr- C*AC e C*AG Só clivam sequências METILADAS Sistemas de Modificação (metilases sítio-específicas) Dam Dcm (N6) (C5) Só METILAM G*ATC C*CAGG e C*CTGG Características das enzimas dos Sistemas de Modificação-Restrição de tipo I, II e III Sequências de reconhecimento das enzimas de restrição Tipo I EcoAI EcoKI StySPI GAGNNNNNNNGTCA AACNNNNNNGTGC AACNNNNNNGTRC Corte na mais de 1000 pb da sequência de reconhecimento que é bipartida e assimétrica G/AATTC TGG/CCA CTGCA/G Corte na, ou muito próximo da sequência de reconhecimento que é PALINDRÓMICA e de 4 a 8 pb CAGCAG AGACC CGAAT Corte a 24-26 pb a jusante da sequência de reconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb Tipo II EcoRI BalI PstI Tipo III EcoP151 EcoPI HinfIII Locais de corte, se^quências de reconhecimento, locais de restrição N- A, C, G ou T; R- G ou A Palíndromos RADAR MADAM IN EDEN I’AM ADAM ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Endonucleases de tipo II • • • • • • AccI AluI BamHI EcoRI HaeIII Sau3AI Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter luteus Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A Type II restriction enzymes Natureza das extremidades geradas após corte com as enzimas de restrição, é determinada pelo lado da ligação fosfodiéster onde ocorre o corte 3’-OH 5’-P Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restrição Extremidades cegas e coesivas (ou salientes) Extremidades 5’ e 3’ projectadas a 5’ do eixo de simetria a 3’ do eixo de simetria As mesmas extremidades coesivas, produzidas por diferentes enzimas de restrição Sistema de modificação-restrição das enzimas de tipo II (Exemplo) A enzima de restrição cliva na sequência de reconhecimento: …aactGAATTCtcgac… …ttgaCTTAAGagctg… …aactG …ttgaCTTAA AATTCtcgac… Gagctg… A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferência de grupos metilo de SAM para as adeninas marcadas com * na sequência de reconhecimento …aact G A *A T T C tcgac… …ttga C T T *A A G agctg… A modificação da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da clivagem pela EcoRI Sistema de Modificação-Restrição Tipo I- sistema EcoK HsdS Determinante da especificidade de HsdM e HsdR A mutação HsdS elimina a actividade de HsdM e HsdR HsdM DNA metilase Metila na sequência AN6ACNNNNNNGTGC ou GCN6ANNNNNNGTT O DNA isolado numa estirpe hsdM- é clivado num hospedeiro HsdR HsdR Enzima de restrição A ausência desta actividade permite a entrada de DNA propagado em estirpes ou fontes que não E. coli Enzimas de Tipo I ligam-se à sequência alvo, metilando-a, ou clivando o DNA, consoante o estado de metilação deste Cliva DNA não metilado Genótipos e fenótipos de mutantes hsd no sistema EcoK GENÓTIPO FENÓTIPO hsdS hsdR + + + + + + hsdM + + + - r+ m + r- mr- m+ r- m- A subunidade HsdM é indispensável à função de restrição por HsdR Sistema de Modificação Metilação Dam Metilação Dam: Gm6ATC (grupo metilo na posição N6 da adenina: N6-metiladenina ) 1- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), bloqueadas por metilação Dam ClaI G*ATCGAT XbaI TCTAG*ATC MboI G*ATC 2- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), não bloqueadas por metilação Dam BamHI GG*ATCC PvuI CG*ATCG Sau3AI G*ATC A negrito- a sequência de reconhecimento da enzima de restrição de tipo II Diferentes padrões de metilação vs diferentes sensibilidades de clivagem Uma sequência de DNA pode sofrer diferentes metilações, adquirindo diferentes padrões de metilação, consoante a especificidade das metilases da célula Ex. Gm6ATC (Dam) GATm5C GATm4C GAThm5C As enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidades aos diversos padrões de metilação Ex: Sau3A1 CLIVA Gm6ATC NÃO CLIVA GATm5C GATm4C GAThm5C Enzimas de restrição tipo II, com diferente sensibilidade à metilação DpnII não CLIVA Gm6ATC CTm6AG GATC CTAG Sau3AI GATC CTAG CLIVA DpnI GATC CTAG CLIVA Gm6ATC CTm6AG DpnI só corta sequência de reconhecimento quando metilada DpnII “ “ “ “ “ “ não metilada Sau3AI “ “ “ “ “ metilada e não metilada CLIVA DpnI NÃO CLIVA GATC DpnII SÓ CLIVA GATC NÃO CLIVA G*ATC Metilase GAT C Protecção da Restrição As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII terão que possuir padrões de metilação adequados à protecção da restrição por cada uma destas enzimas G*AT C Aplicação das enzimas de restrição de tipo II DNA cloning DNA cloning... • One of the most important goals of recombinant DNA technology is to clone a particular gene of interest or other DNA fragment of interest • The approach used to clone a specific gene, depends to a large degree on: – the gene – what is known about it – objective • Among the several tools needed for cloning, lets consider: – – – – restriction enzymes vector DNA DNA ligase host cell Isolating and cloning a DNA fragment Construction of a recombinant DNA molecule Reacção de ligação entre duas moléculas de DNA VECTORS • Central component of gene cloning experiments • Two types of naturally ocurring DNA molecules: – Plamids – Bacteriophages • Properties – Self-replicating – Unique restriction enzymes cleavage sites – Selectable marker – Easy to recover Marcas importantes de um plasmídio Marca de resistência a um antibiótico para o qual a estirpe hospedeiro é sensível Clones de um plamídio recombinante Bacteria cell transformation • Introduction of recombinant DNA molecules into a host (ex. E. coli) • Different procedures: – inducing competence (CaCl2, MgCl2, Licl) – electroporation Transformed cells are isolated in SELECTION MEDIA (a) Introduction of free DNA into bacterial cells (TRANSFORMATION) Competent bacterial cells + Recombinant DNA plasmid SELECTION MEDIA Recombinant DNA clones Non-recombinant DNA plasmid. Bacteria cells harbouring this plasmid will grow, but won’t be recombinant clones Ex. ANTIBIOTIC selection of plasmid DNA (recombinant and non-recombinant) Each colony, a large number of cells, results from one initial single cell Cell divides and vectors are passed to progeny Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules Within the host, vector directs the copy number of recombinant DNA molecules. Características dos hospedeiros vs metilação Ex. DNA recombinante amplificado numa estirpe Dam TC G*A G A CT* MboI G*ATC G*AT C CT*A G GATC CTAG não cliva sequências metiladas G*ATC CT*AG Sau3AI GATC CTAG cliva sequências metiladas G*ATC CT*AG Características dos hospedeiros vs metilação Ex. DNA humano *CpG Clonagem em estirpes (mutantes em Sistemas de Restrição) mcrA- McrA- Cm5CGG mcrBC- McrBC- Gm5C Gh5C GN4C Isoesquizómeros 1- Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais AccIII BspEI TCCGGA AGGCCT TCCGGA AGGCCT Extremidades compatíveis com XmaI CCCGGG GGGCCC 2- Reconhecem a mesma sequência mas clivam em locais diferentes Acc65I GGTACC CCATGG XmaI CCCGGG GGGCCC KpnI GGTACC CCATGG SmaI CCCGGG GGGCCC 3- Reconhecem a mesma sequência mas apresentam diferente sensibilidade à metilação DpnII e MboI não clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI não cliva G*ATC não metilado e ainda clivam em locais diferentes Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. coli mcrA- e mcrBCe posteriormente clivá-lo com MspI? E com HpaII? Porquê? MspI e HpaII são isoesquizómeros, mas HpaII é bloqueada pela metilação em CG, realizada nos mamíferos e pelas enzimas de modificação Dcm. MspI- não é sensível à metilação, Dcm ou metilação CpG dos mamíferos, ie, Cm5CGG. No entanto não cliva em m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG HpaII- não cliva em Cm5CGG, m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG Metilação em organismos eucariotas- um outro significado biológico • Mto variável consoante o organismo em causa. Ex. Drosophila- DNA não metilado • Geralmente a metilação está associada a mecanismos de silenciamento génico REGULAÇÃO EPIGÉNICA Alteração da expressão génica que não se deve a alterações na sequência de DNA, mas a algo que “a somar à sequência de DNA”, influi a expressão génica, como seja: - modificação de bases - factores proteicos que se ligam ao DNA
