Download PCR e tecnicas modernas para avaliacao da

Avaliação da diversidade
microbiana
Técnicas moleculares
(Independentes de cultivo)
Expressões da diversidade
Avaliação da diversidade microbiana
(métodos independentes de cultivo)
Riqueza
Equitabilidade
número de
grupos presentes
abundância relativa
de cada grupo
• Técnicas que envolvem ácidos nucléicos (RNA ou DNA).
• Essas técnicas permitem avaliar diversidade (quem está ali?)
• O potencial metabólico ou atividade quando genes metabólicos ou seus transcritos sejam
usados nas sondas (o que fazem?)
• Métodos mais diretos e analíticos (como FAME).
Dogma Central da Biologia Molecular
Sequências rRNA são extremamente importantes em estudos filogenéticos porque
são conservadas (evoluiram lentamente) participando na síntese da estrutura dos
ribossomos e de proteínas.
rDNA indica os genes que codificam para o RNA ribossômico.
A maioria dos genes metabólicos são regulados ao nível da transcrição e podem não
ser expressos - potencial metabólico.
Se o transcrito do gene é expresso então ele será expresso e seu produto será
sintetizado - atividade metabólica.
Características dos ácidos nucléicos
• Dois tipos de ácidos: RNA e DNA
• DNA é codificado por 4 blocos intercambiáveis
denominados bases: Adenina, Guanina, Citosina e Timina.
• RNA tem 5 bases diferentes: Adenina, Guanina, Citosina e
Uracila.
Ácido desoxiribonucleico
Deoxyribonucleic Acid
DNA
Pontes de hidrogênio e
interações hidrofóbicas
Porque os estudos de diversidade usam o rDNA?
Gene que codifica para rRNA 16S
Cerca de 1500 pb codificam para a subunidade 16S da molécula de
RNA.
Parte destas sequências são conservadas para a maioria dos seres
vivos: -contém o passado metabólico do último ancestral comum.
Regiões variáveis são usadas na taxonomia - filogenética
rDNA
Estrutura primária (sequência) e
secundária (laços e dobraduras)
ordenam a estrutura terciária
(3D) dos ribossomos.
Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano
Vermelho = genes altamente conservados
SSU (small subunit)
16S
Como se replica o DNA?

Abertura da dupla fita via reações químicas simples e reconstituição da
outra metade de cada fita por imersão em uma mistura composta pelas
quatro bases.

Cada base pode se combinar apenas com uma única base complementar.
Portanto, uma base na “fita antiga” (+) define qual base pode ocorrer na
“fita nova” (-)
(Complementaridade das bases)

Dessa forma, após cada abertura da fita, são coletadas do substrato
réplicas completas da fita original, exceto quando ocorrer uma mutação.
Replicação do DNA
O crescimento do DNA ocorre na direção
de 5' para 3'
Vídeo 1
Vídeo2
As duas fitas de DNA estão em direção opostas (anti-paralelas):
- uma das fitas tem a direção exata da sua síntese (5'---3')
- enquanto que a outra está invertida (3'---5').
Esta conformação em fitas anti-paralelas leva à necessidade de mecanismos especiais para a
replicação do DNA.
Reação de amplificação do DNA – PCR
(amplificação gênica)

O objetivo é fazer um número elevado de cópias de um gene ou sequência.
Células são separadas e lisadas
DNA dupla fita é separado em fita única.

Iniciadores (primers) são adicionados (pequenos fragmentos de DNA, 2-30 nucleotídios)
Primers são segmentos complementares aqueles que flanqueiam a sequência alvo
Apenas os segmentos DNA alvo entre os primers serão replicados

Cada ciclo térmico de PCR consiste de 3 etapas:
– Desnaturação do DNA alvo (separação das fitas): 94 °C
– Anelamento por abaixamento da temperatura: 55 °C
– Extensão quando primers iniciam a síntese de DNA com uma DNA polimerase: 72 °C

Cada ciclo resulta no dobro das sequências alvo (dura cerca de 60-90 seg). Geralmente
usam-se 30 ciclos.
Taq polimerase
É
uma enzima termoestável isolada da bactéria Thermus
aquaticus, que habita em regiões hidrotermais.
 "Taq
polimerase" é uma abreviatura de Thermus Aquaticus
Polimerase.
É
geralmente usada no PCR porque é razoavelmente barata e
pode suportar as condições da técnica (temperatura de
desnaturação).
PCR
PCR
O que fazer com PCR?
• Amplificar genes 16S rDNA diretamente de
amostras ambientais.
• Usar primers específicos de certos grupos:
detecção específica
• Detectar genes funcionais quando sua sequência é
conhecida.
Perspectivas - O futuro?
Técnicas independentes de cultivo são essenciais, mas são
lentas e trabalhosas.
Como torná-las mais rápidas para utilizar em análises de
comunidades microbianas?
Amostras
ambientais
Processador
automático
Diversidade microbiana,
atividade, potencial
metabólico,...
•Aumentar automação
•Uso da robótica
•Tecnologia de microarranjos de DNA
FIM