Download estudo da metilação em genes de reparo, mutação no - ICB

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ESTUDO DA METILAÇÃO EM GENES DE REPARO,
MUTAÇÃO NO GENE BRAF E INSTABILIDADE DE
MICROSSATÉLITES EM INDIVÍDUOS COM CÂNCER
COLORRETAL.
ORIENTADA: Carla Gomes Rasuck
ORIENTADORA: Karina Braga Gomes Borges
BELO HORIZONTE - MG
Abril - 2011
CARLA GOMES RASUCK
ESTUDO DA METILAÇÃO EM GENES DE REPARO, MUTAÇÃO NO
GENE BRAF E INSTABILIDADE DE MICROSSATÉLITES EM
INDIVÍDUOS COM CÂNCER COLORRETAL.
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Genética do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial para obtenção do grau de mestre
em Genética.
Orientadora: Profª. Drª. Karina Braga
Gomes Borges
Instituto de Ciências Biológicas
Belo Horizonte - MG
2011
2
Mestranda: Carla Gomes Rasuck
Orientadora: Profª Drª Karina Braga Gomes Borges
Colaboradores: Drª Sinara Mônica de Oliveira Leite
Dr. Alessandro Clayton de Souza Ferreira
Ms. Vanessa Cristina de Oliveira Almeida
Ms. Flávia Komatsuzaki
Linha de Pesquisa
Bases Moleculares de Patologias Humanas
Área de Conhecimento
Genética
Instituições participantes
Instituto de Ciências Biológicas - UFMG
Faculdade de Farmácia - UFMG
Hermes Pardini
Hospital Biocor
Santa Casa de Belo Horizonte
3
Dedico este trabalho a meus pais, Carlos e Tânia, a minha irmã Bruna, ao
Bastian e a minha família, que sempre me apoiaram em minhas decisões,
me incentivaram a alcançar meus objetivos, e sempre me deram força nos
momentos difíceis. Obrigada por tudo!
4
AGRADECIMENTOS
À professora Dra. Karina Braga Gomes Borges, por toda sua orientação e dedicação para a
realização deste trabalho. A sua confiança, apoio e ensinamentos.
À coloproctologista Dra Sinara Mônica de Oliveira Leite pela sua imensurável contribuição a
este trabalho.
Ao Dr. Alessandro Clayton Souza Ferreira, Dra. Fabíola Caxito e Dr. Victor Cavalcanti Pardini
pela confiança, apoio e oportunidade.
Aos funcionários do Hermes Pardini, pela colaboração, ensinamentos, alegrias e incentivos
propocionados ao longo desta caminhada.
À Vanessa Cristina Oliveira e Frederico Scott Malta pelos ensinamentos e grandes
colaborações durante o projeto.
Às colegas de trabalho Michele Gonçalves, Valda Ribeiro e Daniela Almeida Gomes pela
valiosa contribuição durante as extrações.
Ao Dai Edwardes-Evans pela revisão do artigo.
Aos professores Vasco Ariston de Carvalho Azevedo e Eduardo MartinTarazona Santos pela
disponibilidade constante durante a coordenação da Pós-Graduação em Genética.
À Mary e Nathália da Secretaria da Pós-Graduação em Genética pelo auxílio na resolução dos
problemas.
5
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS E TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO …………………………………………………………………………………
10
ABSTRACT ………………………………………………………………………………
11
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................
12
2. REFERENCIAL TEÓRICO ………………………………………………………....
15
2.1 O CÂNCER COLORRETAL …..........……………………………………………
16
2.2 CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS DO CÂNCER COLORRETAL ....……
17
2.3 GENÉTICA DO CÂNCER COLORRETAL ………...……………………………
18
2.3.1 Câncer Colorretal Esporádico ........................................................................
19
2.3.2 Síndrome da Polipose Adenomatose Familiar (FAP) ..................................
19
2.3.3 Síndrome de Lynch .....................................................................................
19
2.4 O GENE BRAF ...............................................................................................
21
2.5 METILAÇÃO EM GENES DE REPARO ........................................................
23
2.6 INSTABILIDADE DE MICROSSATÉLITES ...................................................
27
3. RELEVÂNCIA DO ESTUDO ...........................................................................
29
4. OBJETIVOS ....................................................................................................
31
4.1 Objetivo Geral ................................................................................................
32
4.2 Objetivos Específicos .....................................................................................
32
5. CAPÍTULO 1: ARTIGO: “título” ………………………………………………….
33
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................
53
7. CONCLUSÕES ...............................................................................................
64
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................
66
ANEXO 1: Figuras exemplificando as metodologias utilizadas
APÊNDICE 1: Dados Clínicos
APÊNDICE 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
PARECER ÉTICO
COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Via de transdução de sinal da família RAS/RAF/MAP/MEK/ERK.........
22
Figura 2: Anexo 1 A - Avaliação da instabildiade de microsatélites.....................
75
Figura 3: Anexo 1 B - Metodologia de MLPA.......................................................
76
Figura 4: Anexo 1 C - Detecção da mutação V600E no gene BRAF em PCR em
Tempo Real...........................................................................................................
77
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Critérios clínicos utilizados para o diagnóstico de HNPCC ...............
21
CAP.1 - Table 1: Clinical and molecular characteristics of CRC patients
studied ………………………………………………………………………………..
48
CAP.1 - Table 3: Two-step cluster analysis for clinical and molecular
variables in colorectal cancer patients ……………………………………………
51
CAP.1 - Online Resource 1: Individual associations of clinical and molecular
variables with age and gender …………………………………………………….
52
8
LISTA DE ABREVIATURAS
5-FU – Fluorouracila
AAS - Ácido Acetil Salicílico
APC - Adenomatous Polyposis Coli
CCR – Câncer Colorretal
CIMP - Fenótipo Metilador das Ilhotas CpG
CpG – Citosina-phosphate-Guanina
FAP - Síndrome Polipose Adenomatose Familiar
HNPCC - Câncer Colorretal Hereditário Não Polipose
ICG-HNPCC - International Collaborative Group on Hereditary Non-polyposis Colorectal
Cancer
INCA - Instituto Nacional do Câncer
MGMT - O6-methylguanine-DNA methyltransferase
MLH1 - mutL homolog 1
MLH3 - mutL homolog 3
MMR – Mismatch Repair
MSH2 - mutS homolog 2
MSH3 - mutS homolog 3
MSH6 - mutS homolog 6
MSI - Instabilidade de Microsatélites
MSI-H – Alta Instabilidade de Microssatélite
MSI-L – Baixa Instabilidade de Microssatélite
MSS – Ausência de Instabilidade de Microssatélite
NCI - National Cancer Institute
PMS2 - postmeiotic segregation increased 2
RER - Replication Error
TNM – Tumor / linfonodo / Metástase
TRH - Terapia de Reposição Hormonal
9
RESUMO
O Câncer Colorretal (CCR) corresponde ao terceiro tipo mais comum de câncer. Sua
origem pode ser esporádica e hereditária, sendo que a Síndrome de Lynch é considerada a
forma mais comum de CCR hereditário. A ativação do oncogene BRAF, inativação dos genes
de reparo através de metilação das ilhotas CpG’s em seus promotores e instabilidade de
microssatélites (MSI) têm sido relatado por estarem envolvidos no desenvolvimento do CCR. O
objetivo deste estudo foi caracterizar tumores CCR utilizando critérios clínicos e moleculares,
através da associação e análise de cluster. Critérios de Amsterdam II e Bethesda e variáveis
moleculares foram analisados em 77 pacientes da população brasileira. O status de erro de
replicação (RER) positivo, baseado na instabilidade de microssatélites, apresentou associação
com tumor metacrônico e metilação no gene MLH1, e associação inversa com tumor de cólon
esquerdo e tumor sincrônico. O gene PMS2 foi considerado o melhor preditor para diferenciar o
nível de metilação e os mononucleotídeos foram considerados os melhores marcadores para
avaliar o status RER. Os indivíduos agrupados no cluster 1 apresentaram idade acima de 60
anos, sexo feminino, tumor no cólon direito, tumor metacrônico ou sincrônico e alta
instabilidade de microssatélites. Os pacientes do cluster 2 tinham em sua maioria menos de 45
anos, sexo masculino, tumor localizado no colón esquerdo e reto e estabilidade de
microssatélites. Foi observado, embora não significativo, um maior número de indivíduos com
história familiar de câncer e tumores com ausência de metilação na região promotora dos
genes de reparo no cluster 2. A mutação V600E não apresentou associação com
características clínicas e moleculares. Avaliação de MSI e metilação dos genes MLH1 e PMS2
devem ser levados em consideração a fim de auxiliar no diagnóstico clínico.
Palavras-Chave: Câncer Colorectal, BRAF, Genes de reparo, Instabilidade de microssatélite.
10
ABSTRACT
Colorectal Cancer (CRC) corresponds to the third most prevalent type of cancer. Its
origins can either be sporadic or inherited, being Lynch Syndrome the most common form of
hereditary CRC. The activation of BRAF oncogene, inactivation of mismatch repair genes by
methylation of CpG islands, and microsatellite instability (MSI) have been reported to be
involved in CRC development. The goal of the study was to characterize CRC tumors using
clinical and molecular criteria through association and cluster analysis. Amsterdam II and
Bethesda guidelines and molecular variables were analyzed in 77 patients from Brazil. The
positive replication error (RER) status, based in microsatellite instability, showed association
with metachronous tumor, MLH1 gene methylation and inverse association with left sided and
synchronous tumors. The PMS2 gene was considered the best predictor for differentiating
levels of methylation and the mononucleotide were considered the best markers to evaluate
RER status. The cluster 1 was characterized of individuals over 60 years of age, female, rightsided tumor, high microsatellite instability, and metachronous or synchronous tumors. The
individuals in cluster 2 were younger than 45 years of age, male and showed left-sided or
rectum tumors, and microsatellite stability. Even though it was not observed a significant
association, a higher number of individuals with family history of cancer and tumors without
promoter methylation were found in cluster 2. The V600E mutation did not show association
with clinical or molecular characteristics. Evaluation of MSI and methylation of MLH1 and PMS2
genes should be considered in order to assist with clinical diagnosis.
Keywords: Colorectal cancer, BRAF, Mismatch Repair genes, Methylation, Microsatellite
instability.
11
1. INTRODUÇÃO
12
O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo mais comum de câncer, tanto em mulheres
quanto em homens, sendo o segundo maior em número de mortes. Estima-se que 5% da
população irá desenvolver CCR, tornando-se um problema de saúde pública. Sabe-se ainda
que países e regiões mais desenvolvidos possuem maior prevalência da doença. No Brasil, a
estimativa de novos casos para o ano de 2010 foi de 13.310 para homens e 14.800 para
mulheres.
O câncer é uma doença multifatorial, sendo as alterações genéticas determinantes no
desenvolvimento dos tumores. Dentre essas alterações, pode-se citar a ativação dos
oncogenes e a inativação de genes supressores de tumor. Além disso, alterações epigenéticas
começam a ganhar cada vez mais importância entre as neoplasias. Defeitos nos genes de
reparo, responsáveis pela estabilidade e fidelidade genômica durante a replicação do DNA,
também estão associados ao desenvolvimento do CCR.
O CCR pode ser dividido em esporádico ou hereditário. No esporádico, o paciente não
possui histórico familiar, as alterações na mucosa do cólon ocorrem por influência de fatores
ambientais, se desenvolve em idade avançada e corresponde à cerca de 80% dos casos de
CCR. Já o tipo hereditário consiste na Síndrome de Polipose Adenomatosa Familiar (FAP),
caracterizada pela presença de um alto número de pólipos na mucosa do cólon, o qual evolui
para uma neoplasia em quase 100% dos casos; e a Síndrome de Lynch (Câncer Colorretal
Hereditário Não Polipose – HNPCC), sendo a mais comum das síndromes de padrão
hereditário, caracterizada principalmente pela inativação dos genes de reparo e pelo
desenvolvimento de neoplasias antes dos 45 anos de idade.
No que se refere ao desenvolvimento da forma hereditária do CCR, é importante o
conhecimento de marcadores de predisposição a fim de identificar os indivíduos sob risco
aumentado de desenvolver a doença, uma vez que o diagnóstico precoce e efetivo constitui em
uma condição de melhor prognóstico para o paciente.
Como em todo tipo de câncer, a possibilidade de diagnosticar previamente a doença
relaciona-se também com uma porcentagem mais alta de sobrevivência. No caso do CCR, a
remoção de pólipos adenomatosos benignos impede que os mesmos se transformem em
adenocarcinomas. Assim, a necessidade de estudos para validar marcadores genéticos para
diagnóstico e prognóstico de CCR é de extrema importância. Além disso, estudos mostram que
13
a eficiência e a resposta positiva aos tratamentos estão relacionadas às características
moleculares dos tumores.
Os trabalhos visando à validação de novos marcadores genéticos para o câncer
colorretal ainda são escassos se comparados à alta incidência da doença no mundo. Além
disso, a busca por diminuição de custos dos exames genéticos poderá torná-los mais
acessíveis à população, uma vez que planos de saúde não cobrem esse tipo de procedimento.
A rapidez no diagnóstico também contribui para um tratamento mais específico e precoce,
aumentando a taxa de sobrevida do paciente. Assim, a padronização de testes moleculares,
bem como a caracterização fenotípica da doença, tornar-se-ão importantes ferramentas na
conduta clínica envolvendo o CCR.
14
2. REFERENCIAL TEÓRICO
15
2.1 O câncer colorretal
O câncer colorretal (CCR) corresponde ao terceiro tipo de câncer mais comumente
diagnosticado no mundo ocidental, sendo o segundo em número de mortes (IOANA et al.;
2010; THODI et al.; 2010). Em termos de incidência, o CCR configura-se como a terceira causa
mais comum de câncer no mundo em ambos os sexos, sendo a segunda causa em países
desenvolvidos. Cerca de 9,4% de todos os tipos de cânceres são de cólon e reto, equivalendo
a um milhão de casos novos por ano. Os padrões geográficos são bem similares entre homens
e mulheres; porém o câncer de reto é cerca de 20% a 50% maior em homens na maioria das
populações (INCA, 2010).
Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2010), a estimativa para Minas Gerais
em 2010 foi de 10,33 casos para cada 100.000 homens e 11,7 casos para cada 100.000
mulheres. A maior prevalência deste tipo de câncer se concentra nos países desenvolvidos
(MORÁN et al.; 2010) e isso se reflete na distribuição dentro do Brasil, com as regiões sul e
sudeste apresentando maior incidência da doença (OLIVEIRA et al.; 2004).
A história familiar de CCR e a predisposição genética ao desenvolvimento de doenças
crônicas do intestino (como as poliposes adenomatosas) configuram-se como o mais
importante fator de risco para o desenvolvimento desse tipo de neoplasia. Além disso, fatores
ambientais podem aumentar o risco de aparecimento do tumor. A exposição crônica a
solventes orgânicos, corantes ou abrasivos podem contribuir para o aumento do risco de CCR
(GORDON e NIVATVONGS, 1999). Uma dieta baseada em gorduras animais, baixa ingestão
de frutas, vegetais e cereais; assim como, consumo excessivo de álcool e tabagismo, são
fatores de risco para o aparecimento da doença. A idade também é considerada um fator de
risco, uma vez que tanto a incidência como a mortalidade elevam-se com o aumento da idade.
Já a prática de atividade física regular está associada a um baixo risco de desenvolvimento da
doença (INCA, 2010).
O uso de drogas anti-inflamatórias não esteroidais, como o AAS (ácido acetil salicílico),
e a TRH (terapia de reposição hormonal), tem mostrado ser um fator protetor contra o câncer
de cólon e reto. Entretanto, o uso da TRH já está claramente associado ao aumento de outras
doenças, como o câncer de mama e doenças coronarianas.
16
A sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for
diagnosticada em estágio inicial, sendo que a remoção de pólipos adenomatosos benignos
impede que os mesmos se transformem em adenocarcinomas. A sobrevida média global em
cinco anos se encontra em torno de 55% nos países desenvolvidos e 40% para países em
desenvolvimento (INCA, 2010). Esse bom prognóstico faz com que o CCR seja mais facilmente
diagnosticado, tornando-se então o segundo tipo de câncer mais prevalente em todo o mundo,
com aproximadamente 2,4 milhões de pessoas vivas diagnosticadas com essa neoplasia,
ficando atrás somente do câncer de mama em mulheres (INCA, 2010).
Assim, a validação de biomarcadores que permitam o diagnóstico precoce e
prognóstico de CCR são de extrema importância. No entanto, poucos trabalhos envolvendo o
CCR foram realizados no Brasil no sentido de conhecer suas características clínicas e
moleculares (CALVERT et al.; 2002; OLIVEIRA et al.; 2004; ANACLETO et al.; 2005;
DOMINGUEZ et al.; 2008; DA SILVA et al.; 2009; DA SILVA et al.; 2010; LEITE et al.; 2010; DA
SILVA et al.; 2011; KOEHLER et al.; 2011). As diferenças étnicas apresentadas no país, devido
à alta taxa de miscigenação e diferentes hábitos de vida causados pela grande desigualdade
social, não permitem simplesmente a transposição de dados internacionais para a nossa
realidade, o que corrobora com a necessidade de estudos na nossa população.
2.2 Características histológicas do câncer colorretal
Os adenocarcinomas podem ser classificados macroscopicamente em 4 diferentes
tipos: ulcerativo, polipóide, anular e infiltrativo. O tipo ulcerativo é o mais comum deles,
apresentando-se como uma massa aproximadamente circular com grande convergência de
pregas. O tipo polipóide possui aspecto de couve-flor que se projeta para o lúmen. Em
aproximadamente 10% dos casos, a superfície tem aparência gelatinosa devido à presença de
abundante secreção mucinosa. O carcinoma anular ocupa toda a circunferência da parede do
intestino. Já o tipo infiltrativo deixa a parede do intestino mais espessa, extensivamente
infiltrativo, porém preserva as camadas da parede gastrointestinal. A aparência histológica do
carcinoma pode variar consideravelmente, sendo de grande importância para o prognóstico. As
lesões podem ser bem (20%), moderadamente (60%) e pobremente (20%) diferenciadas
(GORDON e NIVATVONGS, 1999).
17
Lesões com produção de muco podem apresentar diferentes níveis de diferenciação e
são sinal de mau prognóstico. Carcinomas mucíparos são associados à alta incidência de
metástase e pólipos sincrônicos. Quando o muco empurra o núcleo da célula para as
extremidades, a célula adquire uma aparência característica conhecida como anel de sinete
(GORDON e NIVATVONGS, 1999).
O tipo de classificação mais utilizado para o estadiamento é o TNM (Tumor/ linfonodo/
Metástase), que é feita com base na capacidade de invasão do tumor, seu status linfonodal e
status de metástase em outros órgãos. Para esta análise, também são importantes outras
características histológicas, como: tipo de célula; margem de ressecção distal e resposta
inflamatória da região (GORDON e NIVATVONGS, 1999). A utilização de uma classificação de
estadiamento mundial proporcionou novos tipos de terapias, assim como base para
comparação e interpretação de diferentes tipos de tumores (GORDON e NIVATVONGS, 1999).
O poder e a extensão metastática do tumor são de grande importância na prática
clínica, a fim de definir melhor o prognóstico dos pacientes e a intensidade do tratamento.
Estudos recentes (SAMOWITZ et al.; 2005; OGINO et al.; 2009; TANAKA et al.; 2010)
relacionam o perfil molecular do tumor com o status linfonodal, na tentativa de fornecer uma
resposta mais precisa sobre o comprometimento metastático do tumor, podendo desta forma
adotar um tratamento mais específico.
2.3 Genética do câncer colorretal
O CCR se desenvolve através de alterações moleculares e cromossomais (MORÁN et
al.; 2010), podendo ser herdado de forma autossômica dominante, quando um oncogene
responsável por vias de transdução de sinais, que deveria ser expresso apenas na presença de
fatores de crescimento, passa a ser transcrito independentemente, resultando na proliferação
incontrolada (ganho de função). Já a forma recessiva ocorre quando um gene supressor de
tumor ou gene de reparo sofre perda da sua função (LYNCH et al.; 2003; ANACLETO et al.;
2005). Mudanças epigenéticas também podem afetar o nível de expressão gênica, alterando o
controle normal de divisão celular (EBERT et al.; 2006).
O CCR pode ser dividido em: esporádico, quando o paciente não possui histórico
familiar e corresponde à cerca de 80% das neoplasias coloretais (DE LA CHAPELLE, 2004;
MORÁN et al.; 2010); e o câncer hereditário, que corresponde de 10 a 20% do total de casos e
18
que pode ainda ser dividido em dois subtipos: Síndrome da Polipose Adenomatosa Familiar
(FAP) e Câncer Colorretal Hereditário Não Polipose (HNPCC), atualmente sendo adotada a
nomenclatura de Síndrome de Lynch (LYNCH et al.; 1995; LYNCH et al.; 1998).
2.3.1 CÂNCER COLORRETAL ESPORÁDICO
A tumorigênese colorretal esporádica, segundo JUBB et al (2001) caracteriza-se pelo
acúmulo linear de mutações gênicas e/ou anomalias cromossômicas. O CCR esporádico
ocorre principalmente devido à ativação de oncogenes como K-ras e BRAF, à inativação dos
genes supressores de tumor como p53 e APC (adenomatous polyposis coli) ou dos genes de
reparo, principalmente mutL homolog 1 (MLH1) e mutS homolog 2 (MSH2) (BENSON et al.;
2004; TANAKA et al.; 2006). Cerca de 75% dos tumores colorretais esporádicos apresentam
inativação do gene p53 (CALVERT et al.; 2002). Tumores colorretais esporádicos com alta
instabilidade de microssatélite estão frequentemente associados com mutação no gene BRAF
e perda de expressão do gene MLH1 devido à hipermetilação de seu promotor (VELHO et al.;
2008).
2.3.2 SÍNDROME DA POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR (FAP)
A FAP apresenta uma incidência de 1: 8.000-15.000 recém-nascidos e corresponde a
menos de 1% de CCR (Al-SUKHNI et al.; 2008). Essa síndrome é caracterizada pela presença
de mais de 100 pólipos colorretais que se desenvolvem durante a puberdade e possuem um
elevado risco de evoluirem para neoplasias (LYNCH et al.; 2003). É causada por mutações
germinativas ocorridas no gene APC no cromossoma 5q (AL-SUKHNI et al.; 2008). Mais de
95% dessas mutações levam a codificação de uma proteína truncada, normalmente inserções
ou deleções, causando alteração na fase de leitura (SVRCEK et al.; 2010).
2.3.3 SÍNDROME DE LYNCH
A Síndrome de Lynch, ou HNPCC, constitui a principal síndrome hereditária de
predisposição ao câncer colorretal, e se desenvolve em decorrência de mutações em genes de
reparo, em especial MLH1, MSH2, mutS homolog 6 (MSH6) e postmeiotic segregation
increased 2 (PMS2) (LI et al.; 2006). Para que ocorra a inativação dos genes de reparo
responsável pelo tumor, é necessário que ambos os alelos estejam mutados.
19
Na síndrome de Lynch, o alelo mutado é transmitido de forma hereditária, enquanto a
inativação somática do alelo selvagem pode ocorrer através de dois mecanismos: mutação ou
metilação nos promotores dos genes de reparo. Estas alterações em conjunto levam à perda
de heterozigosidade (IMAI et al.; 2008). O reconhecimento desta síndrome é de grande
importância na prática clínica, uma vez que a identificação de indivíduos em risco permite sua
inclusão em programas de prevenção secundária com redução da morbi-mortalidade imposta
pela síndrome. A identificação da Síndrome de Lynch pode definir a escolha de um
procedimento de retirada do carcinoma como colectomia subtotal em oposição a uma
ressecção mais limitada. No caso de uma mulher com família já formada, essa ressecção pode
se extender a uma histerectomia e salpingo-ooforectomia bilateral profiláticas devido ao risco
desses pacientes desenvolverem carcinoma de endométrio e ovário, incluídos na síndrome
(GORDON e NIVATVONGS, 1999). Além disso, o início precoce da doença e a possibilidade
(2% a 13%) de surgimento concomitantes de tumores extra-colônicos em órgãos como
estômago, intestino delgado, cérebro e trato urinário (THODI et al.; 2010) justificam o
investimento na busca por marcadores biológicos que facilitem o diagnóstico.
A suspeita de Síndrome de Lynch surge quando o CCR acomete indivíduos jovens, com
história familiar positiva ou na presença de múltiplos tumores. No entanto, nem sempre o
fenótipo de classificação em CCR esporádico ou familiar é claro. Desta forma, recomenda-se a
adoção dos critérios clínicos de Amsterdam II e Bethesda (Tabela 1) (CHUNG et al.; 2003;
UMAR et al.; 2004), que foram criados com o intuito de aumentar a sensibilidade do diagnóstico
de pacientes com Síndrome de Lynch, obtidos a partir da história familiar do indivíduo em
questão. Recomenda-se a avaliação de instabilidade de microssatélites para os pacientes que
preenchem os critérios de Bethesda, porém, nem todos realizam os testes, ou por questões de
custo ou de disponibilidade.
20
Tabela 1: Critérios clínicos utilizados para o diagnóstico de HNPCC.
Critérios de Amsterdam II

Critérios de Bethesda
No mínimo 3 parentes com CCR

Critérios de Amsterdam positivos;
histologicamente

Indivíduos
onde
pelo
comprovado,
menos
um
seja
parente de primeiro grau dos

Pelo
dois
tipos
de
câncer
relacionados à HNPCC;

outros dois;

com
Indivíduos com CCR e um parente de
primeiro grau com adenoma ou CCR ou
menos
duas
gerações
cancer extracolônico associado ao HNPCC.
afetadas;
Um dos tumores antes dos 45 e o adenoma
Pelo menos um caso de câncer
antes dos 40 anos de idade;
colorretal
diagnosticado
antes

dos 50 anos de idade.
Individuos
com
câncer
de
cólon
ou
endometrial antes dos 45 anos de idade;

Indivíduos com CCR no lado direito, com
padrão indiferenciado em teste histológico,
antes dos 45 anos de idade;

Indivíduos com CCR com presença de
células em anel de sinete antes dos 45 anos;

Indivíduos com adenoma colônico antes dos
40 anos.
2.4 O gene BRAF
O oncogene BRAF, localizado no locus 7p34, é um membro da família do gene RAF e
codifica uma quinase serina/treonina citoplasmática que participa do mecanismo de transdução
de sinais da família RAS/RAF/MAP/MEK/ERK (LOUGHREY et al.; 2007; PICHLER et al.; 2009)
(Figura 1) (IZQUIERDO, 2005). Essa via é responsável pela regulação de sinais para o
crescimento celular. Quando o receptor extracelular desta via recebe o respectivo ligante/fator
de estímulo, como por exemplo fatores de crescimento, ele ativa o seu domínio citoplasmático,
tornando-se fosforilado.
Essa fosforilação é então transmitida através de uma cascata
enzimática até promover a remoção de GDP de um membro da família RAS. Essa remoção
21
permite que RAS seja ativado através da ligação de GTP. Quando ativado, RAS ativa a
proteina quinase RAF, codificada pelo gene BRAF, que fosforila e ativa MEK que, por sua vez,
fosforila e ativa MAPK, transmitindo o sinal para o núcleo. Ao receber o sinal, os genes
relacionados ao crescimento celular são ativados, promovendo proliferação celular (NE
BIOLABS, 2010). Mutações com ganho de função nos genes responsáveis por essa via de
crescimento celular podem aumentar a expressão dos mesmos, resultando em um
descontrolado processo de divisão celular e tumorigênese (DAVIES et al.; 2002).
Figura 1: Via de transdução de sinal da família RAS/RAF/MAP/MEK/ERK (IZQUIERDO, 2005 modificada)
A alta frequência de mutações no gene BRAF em câncer humano sugere que este
possui um importante papel tanto na iniciação do tumor quanto na manutenção do seu
crescimento (PHILLIPS et al.; 2010). Dentre as mutações somáticas descritas no BRAF, cerca
de 80 a 90% corresponde a uma transversão simples T>A no exon 15, causando uma troca do
aminoácido glutamato por valina no resíduo 600 (V600E, SNP rs113488022). Essa transversão
resulta em um ganho de função da proteína levando a uma constante ativação do BRAF e,
22
consequentemente, da cascata de fosforilação da via RAF/MAP/MEK/ERK (JARRY et al.; 2004;
BENLLOCH et al.; 2006).
A mutação V600E do gene BRAF foi descrita em diferentes tipos de câncer,
principalmente melanoma, câncer de tireóide e CCR. Está presente em cerca de 20% do total
de CCR (FARINA-SARASQUETA et al.; 2010) e de 30 a 83% de CCR com instabilidade de
microsatélites (AL-SUKHNI et al.; 2008), induzindo a um fenótipo metastático do tumor e a
resistência à apoptose (DENG et al,; 2004; UEDA et al.; 2008).
Em pacientes com CCR esporádico, foi observada uma associação entre a mutação
V600E, a instabilidade de microssatélites e a metilação nas ilhotas CpG do promotor do gene
MLH1, sugerindo um algoritmo de classificação laboratorial deste tipo de tumor (SHENG et al.;
2009). A mutação V600E do BRAF não foi detectada simultaneamente às mutação nos genes
de reparo (MMR genes) em pacientes com Síndrome de Lynch (BENLLOCH et al.; 2006).
Estes achados indicam que o BRAF possa ser utilizado como marcador genético para critério
de inclusão de CCR esporádico e exclusão da Síndrome de Lynch, tornando-se um exame
molecular de grande importância clínica. Segundo FARINA-SARASQUETA et al (2010), os
portadores da mutação V600E no gene BRAF, independente de fatores como idade, sexo,
localização do tumor e status de instabilidade de microsatélites (MSI), apresentaram um risco
significativamente aumentado de morrer por causas relacionadas ao câncer. TOL et al (2009)
demonstraram uma relação positiva entre a mutação V600E BRAF e baixa sobrevida em um
grupo de pacientes com câncer colorretal metastático, independentemente do tratamento
utilizado.
2.5 Metilação em genes de reparo
Modificações epigenéticas ocorrem no genoma humano para regular a expressão
gênica sem alterar a sequência codificadora do DNA. A metilação é um exemplo desse
mecanismo. Regiões genômicas com alta frequência de citosina adjacente à guanina (ilhotas
CpG) são mais susceptíveis a essas alterações. A metilação é resultando da adição de um
grupo metil na citosina, tornando-a 5-metilcitosina (5-mC). Essa reação é catalizada pela
enzima DNA metiltransferase (JUBB et al.; 2001). A metilação presente no promotor do gene
está relacionada com a perda da sua expressão.
23
A metilação nas ilhotas CpG é essencial para o desenvolvimento embrionário normal,
imprinting genômico e inativação do cromossomo X, porém, quando essa metilação ocorre no
promotor dos genes supressores de tumor tornando-os inativados, pode levar ao câncer de
forma geral (LORENTE et al.; 2008).
Inativação transcripcional através da metilação das regiões CpG no promotor dos genes
supressores de tumor é um mecanismo importante na carcinogênesis humana. A metilação do
DNA tem sido usado como marcador para o câncer quanto ao diagnóstico, screening, pesquisa
de grupo de risco, monitoramento de reincidência da doença e optimização de opções
terapêuticas (OGINO et al.; 2008).
O silenciamento epigenético dos genes de reparo - MMR (Mismacht Repair),
principalmente MLH1 e MSH2, através da metilação, tem se mostrado um caminho comum
para a perda da função destes genes no CCR (DENG et al.; 1999). Acredita-se que, devido ao
poder da metilação de silenciar genes, ela pode causar instabilidade genética, resultando em
um rápido acúmulo de alterações com potencial de acelerar o processo tumoral, além de poder
explicar cerca de 75% dos casos de CCR esporádico com MSI (TOYOTA et al.; 1999). A
metilação nas ilhotas CpG do gene de reparo MLH1 corresponde a aproximadamente 15% dos
casos de CCR esporádico com alta instabilidade de microssatélites (FEARON e VOGELSTEIN,
1990). Os MMR têm como função principal a correção dos erros de inserção e deleção durante
a replicação do DNA. Além disso, eles estão relacionados à estabilidade genômica,
assegurando fidelidade durante mecanismo de recombinação genética ou participando no início
do mecanismo de resposta apoptótica às células contendo danos no DNA (DA SILVA et al.;
2009).
Estudos recentes mostram que as mutações nos genes supressores de tumor são os
primeiros eventos no CCR, seguido de metilação nas ilhotas CpG, levando à instabilidade de
microssatélites (MORÁN et al.; 2010; TANAKA et al.; 2010). O fenótipo metilador das ilhotas
CpG (CIMP) pode ser considerado baixo quando até 5 das 8 regiões promotoras em genes
supressores de tumor/reparo analisadas apresentam metilação (CIMP-low) ou alto, quando 6
ou mais desses genes apresentam metilação nos seus promotores (CIMP-high) (OGINO et al.;
2009). Segundo TANAKA et al (2010), CIMP-high é um fenótipo associado à alta instabilidade
de microssatélites e mutações no gene BRAF. Esse fenótipo é uma das principais causas para
MSI em CCR esporádico. Porém, resultados obtidos em estudos feitos por NOSHO et al (2008)
24
demonstram que idade avançada, localização proximal do tumor e mutação no gene BRAF
estão significativamente associadas a CIMP-high em tumores do tipo RER positivo ou negativo.
Já o fenótipo CIMP-low mostra-se associado à mutação no gene K-ras, embora esta relação
ainda seja controversa (NOSHO et al.; 2008).
O fenótipo CIMP-high, além de mostrar-se associado com idade avançada, sexo
feminino, localização proximal, células pouco diferenciadas, instabilidade de microssatélites e
mutação no gene BRAF (NOSHO et al.; 2008), também tem sido associado com baixa
mortalidade; porém a presença da mutação BRAF faz com que a mortalidade aumente de
forma significativa (OGINO et al.; 2009). Além disso, a mutação no gene BRAF também tem
sido associada à menor sobrevida em tumores com ausência de instabilidade de
microssatélites (MSS) (SAMOWITZ et al.; 2005; WARD et al.; 2003; VAN RIJNSOEVER et al.;
2003; OGINO et al.; 2007; SHEN et al.; 2007; LEE et al.; 2008). Em um estudo feito por
OGINO et al (2009), CIMP-high, independente do nível MSI, demonstrou uma redução
significante na mortalidade relacionada a CCR. Além disso, o estudo identificou que 70% de
tumores com a mutação V600E BRAF possuem CIMP-high e 70% de tumores CIMP-high
apresentavam alta instabilidade de microssatélite.
MLH1 e MSH2 são as principais proteínas envolvidas no processo de reparo do DNA
(AL-SUKHNI et al.; 2008). A MLH1 forma um complexo com a PMS2, sendo a mais ativa em
humanos e responsável pelo início do mecanismo de reparo. O complexo formado por MSH2 e
por mutS homolog 3 (MSH3) é responsável por reconhecer e re-alinhar as inserções e
deleções de dois a oito nucleotídeos. Acredita-se que a proteína MSH6 seja a subunidade
responsável por reconhecer os erros (DA SILVA et al.; 2009). A função específica do complexo
formado pelo mutL homolog 3 (MLH3) ainda permanece incerta (CHUN et al.; 2003).
Metilação do gene MLH1 tem sido detectada de 0 a 46% dos casos de síndrome de
Lynch (IMAI et al.; 2007). DENG et al (1999) demontrou que a metilação entre as regiões -248
e -178 do promotor do gene MLH1 estão relacionadas com a perda de expressão de MLH1. Em
um estudo feito por VAN ROON et al (2010), metilação do gene MLH1 foi detectada em 46
pacientes com câncer de cólon com alta instabilidade de microssatélites, ocasionando perda de
expressão tanto do gene MLH1 quando de seu heterodímero PMS2. Estudos (CHAN et al.;
2006; HITCHINS et al.; 2007) mostram que metilação nos genes MLH1 e MSH2 podem ser
transmitidos verticalmente e estarem relacionados à Síndrome de Lynch.
25
O
gene
MGMT
codifica
uma
enzima
de
reparo
-
O6-methylguanine-DNA
methyltransferase - responsável por proteger o genoma humano contra mutagenêses através
da remoção de adutos de metil de O6-guanina. Quando o grupo metil não é removido, O6methylguanina é reconhecido como adenina, não combinando com timina durante a replicação
do DNA, resultando em um polimorfismo de nucleotídeo simples do tipo transição (SVRCEK et
al.; 2010).
Mutações no gene MSH6 resultam em deficiência parcial do sistema de reparo, levando
a um fenótipo de baixa instabilidade de microssatélites um pouco diferenciado: inabilidade de
reparo de mutações de base única (CHUNG et al.; 2003). PMS2 corresponde a menos de 5%
de todos os casos de síndrome de Lynch (DA SILVA et al.; 2009).
Um estudo feito na população brasileira por ROSSI et al (2002) detectou uma maior
frequência de mutação no gene MLH1 (32%) do que em MSH2 (8%). Dentre os indivíduos que
apresentavam a metilação, somente 30% apresentavam critérios de Amsterdã positivos. Oito
mutações no gene MLH1 foram detectadas e quatro mutações no gene MSH2. LYNCH et al
(1999) identificaram mutações nos genes MLH1 e MSH2 em 32,1% das famílias estudadas
com suspeita de HNPCC. PENSOTTI et al (1997), em um estudo feito em famílias italianas
com diagnóstico clínico para síndrome de Lynch, identificou, em 50% das familias, mutações
em MLH1 e MSH2.
THODI et al (2010) identificou uma mutação no gene MSH6 em um indivíduo de 40
anos de idade diagnosticado com câncer colorretal. Mutações no gene PMS2 foram reportadas
em indivíduos com suspeita de CCR do tipo familiar (HAMILTON et al.; 1995; MIYAKI et al.;
1997; DE ROSA et al.; 2000)
Em um estudo feito por SVRCEK et al (2010), pacientes com CCR esporádico
apresentaram metilação no promotor do gene MGMT, resultando em perda de expressão em
ambas as células tumorais e células da mucosa aparentemente normais. Durante um processo
inflamatório, a produção de adutos de O6-metilguanina aumenta, levando a inativação do gene
MGMT. A deficiência de MGMT na mucosa adjacente a um tumor pode ser, ao contrário do que
se acreditava, a consequência de neoplasmas inflamatórios, favorecendo o aparecimento de
clones deficientes em genes de reparos e, portanto, um passo crucial para o desenvolvimento
de tumores com alta instabilidade de microssatélites. BOLAND et al (2009) descobriu um
26
aumento gradual da hipermetilação do gene MGMT na progressão do tecido normal-adenomacarcinoma.
2.6 Instabilidade de Microssatélites
Os microssatélites são sequências de nucleotídeos repetidas em tandem. Durante o
processo de replicação do DNA, a DNA Polimerase sofre um “escorregamento” na fita ao
replicar as regiões de microssatélites, gerando deleções ou inserções de repetições na nova
fita formada. Os genes de reparo, quando alterados, não conseguem consertar o erro,
causando instabilidade naquela região (FEARON e VOLGELSTEIN, 1990; JUBB et al.; 2001).
O risco de desenvolver CCR pode chegar a 85% em pessoas com mutação nos genes
de reparo (CALVERT et al.; 2002). Cerca de 80 a 90% dos casos de Síndrome de Lynch são
decorrentes de mutações nos genes de reparo MLH1 e MSH2, cuja consequência pode ser
detectada através da instabilidade gerada nos microssatélites (MSI) (IONOV et al.; 1993;
THIBODEAU et al.; 1993; PAPADOPOULOS et al.; 1994; WHEELER et al.; 2000; LORENTE et
al.; 2008). Mutações nos genes MSH3, PMS1, PMS2 e MSH6 resultam em um fenótipo menos
severo.
A instabilidade de microsatélites (MSI) pode ser analisada através da utilização de 5
marcadores,
conforme
preconizado
pelo
National
Cancer
Institute
(NCI):
dois
mononucleotídeos (BAT25 e BAT26) e três dinucleotídeos (D2S123, D5S346 e D17S250).
Segundo o International Collaborative Group on Hereditary Non-polyposis Colorectal Cancer
(ICG-HNPCC), a MSI pode ser classificada como alta (MSI-High) quando mais de 30% dos
marcadores, mononucleotídeos ou dinucleotídeos utilizados na detecção, são instáveis, ou
seja, o número de repetições do motivo difere entre o tecido turmoral e o não tumoral. Neste
caso, o marcador é considerado positivo para erro de replicação (RER = Replication Error).
Quando essa instabilidade aparece em menos de 30% dos marcadores analisados, a
instabilidade dos microssatélites é considerada baixa (MSI-Low) e o RER negativo. A ausência
de instabilidade em todos os marcadores (MSS) também é classificada como RER negativo
(AL-SUKHNI et al.; 2008; HUANG et al.; 2010).
27
A incidência de MSI-H em indivíduos com Síndrome de Lynch é de 83% (FEARON e
VOGELSTEIN, 1990) e de 15% a 20% no CCR esporádico (IMAI et al.; 2008). MSI-H tem sido
associada com melhor prognóstico e sobrevida e menor incidência de metástase linfática
(HUANG et al.; 2010). Dentre os tumores de CRC que apresentam MSI-H, 80% não possuem
envolvimento linfático (HUANG et al.; 2010). Tumores com CIM-H e ausência de instabilidade
de microssatélite estão associados com metástase linfonodal e a presença da mutação V600E
BRAF está associada com um pior desfecho clínico (LEE et al.; 2008; KIM et al.; 2009).
Além disso, sabe-se que a presença de instabilidade de microssatélite está relacionada
à resposta terapêutica. A quimioterapia adjuvante baseada no fármaco Fluorouracila (5-FU)
parece não favorecer pacientes com tumores MSI-High (BENATTI et al.; 2005; DOUILLARD et
al.; 2010; HUANG et al.; 2010). No entanto, a resposta de tumores MSI-L ainda permanece
incerta, uma vez que não foi observada diferença quando comparada à resposta terapêutica
apresentada pelos tumores do tipo MSS (IMAI et al.; 2008). Assim, apenas a análise isolada de
instabilidade de microssatélite ainda não é suficiente para guiar a conduta terapêutica (IMAI et
al.; 2008).
28
3. RELEVÂNCIA DO ESTUDO
29
Devido ao fato de que o câncer colorretal corresponde ao terceiro tipo de câncer mais
comumente diagnosticado, sendo o segundo em número de mortes, tornar-se mister
investimentos em estudos que permitam conhecer os mecanismos de desenvolvimento desta
doença.
Por ser o CCR multifatorial, onde fatores de risco ambientais e genéticos coparticipam
na gênese da doença, o conhecimento de marcadores moleculares, bem como o estudo da
frequência dos mesmos na população brasileira poderá contribuir para a caracterização da
doença em nosso meio, sendo que poucos trabalhos foram conduzidos até o momento com
esse fim.
Atualmente, apenas os critérios clínicos (Amsterdam II e Bethesda) e histopatológicos
são utilizados na rotina médica para classificar o tumor quanto à sua origem esporádica ou
hereditária. No entanto, estes critérios são falíveis, uma vez que dependem de informações
nem sempre fidedignas, como histórico familiar da doença. Sabe-se ainda que a identificação
de pacientes candidatos para CCR do tipo hereditário faz com que o acompanhamento e
prevenção para o indivíduo e seus familiares se iniciem precocemente, além de ser importante
o encaminhamento dos mesmos ao aconselhamento genético. Assim, a utilização de
marcadores genéticos que possibilitem esta distinção poderá preencher esta lacuna na rotina
clínica.
Alguns estudos também têm demonstrado que algumas alterações genéticas são
fatores prognósticos. O conhecimento das características moleculares do tumor pode auxiliar
no tratamento a ser utilizado, evitando-se assim o desgaste do paciente e despesas
desnecessárias. Além disso, o médico poderá prever a evolução clínica do paciente,
estabelecendo protocolos mais efetivos para seguimento dos mesmos.
Este trabalho teve como objetivo caracterizar um grupo de pacientes diagnosticados
com adenocarcinoma de cólon-reto, atendidos em dois centros de referência em saúde em
Belo Horizonte, com relação às características clínicas e moleculares. Acredita-se que estes
resultados poderão auxiliar no conhecimento da doença na nossa população, bem como
proporcionar a adoção de uma conduta médica individualizada, alcançando melhor qualidade
de vida para o paciente.
30
4. OBJETIVOS
31
4.1 Objetivo geral
Caracterizar pacientes com CCR esporádico e Síndrome de Lynch quanto aos critérios
clínicos, à presença do polimorfismo V600E no gene BRAF, à presença de instabilidade de
microsatélites e à metilação em regiões promotoras de genes de reparo, e agrupar os
pacientes segundo a associação destas características através da análise de cluster.
4.2 Objetivos específicos

Selecionar indivíduos com CCR e caracterizá-los quanto às variáveis clínicas: critérios
de Amsterdam II e Bethesda, idade, sexo, localização do tumor, presença de tumor
metacrônico/sincrônico e história familiar.

Determinar a frequência do polimorfismo V600E no gene BRAF.

Avaliar a presença da instabilidade de microssatélites e o nível de metilação na região
promotora dos genes de reparo MLH1, MSH2, MSH6, MGMT, PMS2, MLH3 e MSH3
nos mesmos pacientes.

Associar as variáveis moleculares (mutação V600E, instabilidade de microssatélites e
metilação em genes de reparo) às características clínicas dos pacientes.

Agrupar os indivíduos em cluster segundo a similaridade e associação destas
características.
32
5. CAPÍTULO 1
ARTIGO: “Association between methylation in mismatch
repair genes, V600E BRAF mutation and microsatellite
instability in colorectal cancer patients”
Artigo submetido ao periódico Molecular Biology Reports
33
ABSTRACT
Colorectal Cancer (CRC) corresponds to the third most prevalent type of cancer. Its
origins can either be sporadic or inherited, being Lynch Syndrome the most common form of
hereditary CRC. The activation of BRAF oncogene, inactivation of mismatch repair genes by
methylation of CpG islands, and microsatellite instability (MSI) have been reported to be
involved in CRC development. The goal of the study was to characterize CRC tumors using
clinical and molecular criteria through association and cluster analysis. Amsterdam II and
Bethesda guidelines and molecular variables were analyzed in 77 patients from Brazil. The
positive replication error (RER) status, based in microsatellite instability, showed association
with metachronous tumor, MLH1 gene methylation and inverse association with left sided and
synchronous tumors. The PMS2 gene was considered the best predictor for differentiating
levels of methylation and the mononucleotide were considered the best markers to evaluate
RER status. The cluster 1 was characterized of individuals over 60 years of age, female, rightsided tumor, high microsatellite instability, and metachronous or synchronous tumors. The
individuals in cluster 2 were younger than 45 years of age, male and showed left-sided or
rectum tumors, and microsatellite stability. Even though it was not observed a significant
association, a higher number of individuals with family history of cancer and tumors without
promoter methylation were found in cluster 2. The V600E mutation did not show association
with clinical or molecular characteristics. Evaluation of MSI and methylation of MLH1 and PMS2
genes should be considered in order to assist with clinical diagnosis.
Keywords: Colorectal cancer, BRAF, Mismatch Repair genes, Methylation, Microsatellite
instability.
34
INTRODUCTION
The Colorectal Cancer (CRC) corresponds to the third most common type of cancer also
being the second in cancer-related deaths [1,2]. It has a higher prevalence in developed
countries, which is represented in Brazil in the south and southeast regions. The CRC develops
by molecular and chromosomal alteration [3]. Epigenetic changes can also affect the level of
gene expression, changing the normal cellular division control [4].
CRC can be classified as sporadic and hereditary. Sporadic CRC (SCC) occurs when
the patient has no familial history and corresponds to about 80% of colorectal tumors [3,5]. It is
caused by the activation of oncogenes such as K-ras and BRAF and inactivation of tumor
suppressor genes like p53 and APC or Mismatch Repair (MMR) genes with the most common
ones being MLH1 and MSH2 [6,7].
The hereditary form corresponds to 10 to 20% of all CRC cases and can be divided into
two subtypes: Familial Adenomatous Polyposis (FAP) caused by somatic mutations on APC
gene, and Lynch Syndrome [8-10]. Lynch Syndrome is considered the most common hereditary
predisposition to CRC and is related to mutations in MMR genes. One mutated allele is inherited
and a second event (somatic mutation or methylation on MMR genes promoters) occurs on the
wild type allele during the life [11,12]. When both copies of MMR genes are mutated, the gene
becomes inactivated, leading to microsatellite instability (MSI) [11]. Clinical criteria such as
Amsterdam II and Bethesda guidelines are used to assist during diagnosis, but they are not
sensitive enough to discriminate the type of cancer.
The oncogene BRAF (7p34) is a member of RAF gene family and codes a cytoplasmic
kinase that participates on signal transduction pathway of RAS/RAF/MAP/MEK/ERK family,
responsible for regulating cellular proliferation [13,14]. Among the somatic mutations described
on BRAF, 80 to 90% correspondent to a transversion T>A in exon 15 that leads to amino acid
substitution (V600E). This mutation keeps the oncogene BRAF constantly activated, activating
the RAS/RAF/MAP/MEK/ERK phosphorylation pathway for cell growth [15, 16]. The V600E
BRAF mutation is present from 10 to 18% of all CRC cases and from 30 to 83% of CRC tumors
with MSI [10], being related to a more metastatic phenotype and higher apoptosis resistance
[17, 18]. Moreover, V600E mutation is associated with lack of response for anti-EGFR
monoclonal antibodies treatments [19].
35
Epigenetic silencing of MMR genes, specially MLH1 and MSH2, due to methylation in
the promoter region has been considered the most common cause of inactivation of those
genes in CRC [20]. The CpG island methylator phenotype (CIMP) can be considered low
whenever 5 out of 8 regions in the promoter region of different MMR genes analyzed shows
methylation (CIMP-low), or high whenever 6 or more of those regions shows methylated
promoters (CIMP-high) [21]. According to TANAKA et al [22], CIMP-high is considered one of
the main causes of MSI in sporadic CRC and is associated to V600E BRAF mutation [23].
About 80 to 90% of Lynch Syndrome cases are caused by mutations in MLH1 and
MSH2 genes, which can be detected through MSI [24-28]. The incidence of MSI-High in Lynch
Syndrome patients is 83% [29] and from 15 to 20 % in sporadic CRC [11]. MSI-High has been
associated with a better prognostic and survival, and lower incidence of lymphatic metastasis
[30].
The survival rate for CRC is considered high if the disease is diagnosed in early stages,
so it is important to identify the vulnerable population and characterize the variables involved in
CRC development. Since the prognostic is failed if made only by clinical criteria such as
Amsterdam II and Bethesda and histological features of the tumor, this study aimed to evaluate
the association between clinical and molecular characteristics in a CRC Brazilian individuals
group in order to assist in clinical management of these patients.
MATERIAL AND METHODS
Clinical Samples
This cross-sectional study was approved by Ethical Committee of Federal University of
Minas Gerais and Santa Casa. Appropriately written informed consent was obtained from all the
patients.
The samples consisted of normal and tumor samples, of which 33 were preserved in
paraffin and 44 in non-fixed material, stored at 4ºC. The samples were obtained from surgical
procedure and the patients did not go under cancer treatments prior to the surgery. The normal
tissue was selected by the surgeon, from a region visually not affected by the tumor. This study
36
included 77 individuals older than 18 years old, with clinical and laboratorial diagnosis of
colorectal adenocarcinoma. The participants were selected consecutively from the time they
were treated at the Santa Casa Hospital and Biocor Institute, Belo Horizonte, MG - Brazil during
the period 2000-2010. Individuals presenting inflammatory intestinal diseases and Familial
Adenomatous Polyposis (FAP) were excluded.
Cancer family history was collected from all the patients. However, histories of liver and
bone cancer were not considered, since these organs are frequently targets of metastasis. In
addition, uterine cancer history was not considered due to difficulty to classify in endometrial or
cervical, essential for correct Lynch Syndrome identification. The patients were further classified
according to Amsterdam II and Bethesda guidelines [31, 32].
V600E BRAF mutation analysis
Genomic DNA was extracted from paraffin-embedded and fresh tissues following
phenol-chloroform protocol. For V600E genotyping, we designed a set of primers-probes with
Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems, CA). We used the fluorophore FAM as a
reporter for Taqman® MGB probes (Applied Biosystems). The set of primers-probes was: 5´TCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGT-3´
(forward),
5´-ATCCAGACAACTGTTCA-
AACTGATG-3´ (reverse), 5´-FAM-TCTAGCTACAGTGAAAT-3´ (wild-type probe), and 5´-FAMTAGCTACAGAGAAATC-3´ (mutant probe).
Real time PCR was performed using a wild-type and a mutant mix with a final reaction
volume of 14.0 µL each containing 7.5 µL of 2X Taqman® Genotyping PCR MasterMix (Applied
Biosystems), 0.27 µL (900 nM) of each primer, 0.37 µL (10 µM) of probe to its respective mix,
3.59 µL of distilled water, and 2.0 µL of DNA. The PCR conditions were: first holding stage at
60ºC for 30 seconds, second holding stage at 95ºC for 10 minutes, 50 cycles of 95ºC for 15
seconds and 60ºC for 1 minute, and another holding stage at 60ºC for 30 seconds. Amplification
was performed on StepOne Plus Real Time PCR (Applied Biosystems).
MSI analysis
Six microsatellites recommended by the Cancer National Institute [33, 34] were used in
this study: three mononucleotides (BAT25, BAT26, and BAT40) and three dinucleotides
(D2S123, D5S346, and D17S250). The PCR products were detected by capillary
37
electrophoresis using MegaBace® 1000 (GE, Sweden). Microsatellite instability was observed
by comparing normal and tumor tissue. The tumor was classified according to International
Collaborative Group on Hereditary Non-polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC), being
Replication Error Negative (RER-) if no allele difference between normal and tumoral tissues
was observed (Microsatellite Stability – MSS) or if only one out of six markers showed allele
difference between both tissues (low instability MSI-L). The tumor was considered Replication
Error Positive (RER+) if two or more markers demonstrated instability (high instability MSI-H).
MMR Genes Methylation Analysis
The methylation status of CpG islands in the promoter of MMR genes were detected by
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), SALSA® MS-MLPA® kit ME011-A1
MMR (MRC-Holland, Netherlands). The amplification products were visualized at MegaBace®
1000 (GE, Sweden) and the final data was analyzed at Coffalyser MLPA Software. The
following genes were analyzed in this probemix: MLH1 (6 regions), MSH2 (4 regions), MSH6 (3
regions), MLH3 (2 regions), PMS2 (3 regions), MSH3 (3 regions), MGMT (3 regions), and 8
reference probes. If one or more regions of the gene were methylated, the gene was considered
positive for methylation. The methylation status was defined according to the gene number that
showed methylation: non-methylated - no gene with CpG island methylated (CIM -0); low level
of methylation - 1 to 4 methylated genes (CIM-L), and high level of methylation - 5 or more
methylated genes (CIM-H) [21].
Statistical Analysis
The analysis was performed in SPSS 13.0 software. Individual associations were made
between studied variables: microsatellites, RER status, Amsterdam II criteria, Bethesda criteria,
family history of cancer, BRAF V600E mutation, CpG island promoter methylation of MMR
genes, tumor localization, metachronous tumor, synchronous tumor, age and gender. Residue
calculations were made for variables which were considered statistically significant (p≤0.05).
Kappa coefficient was calculated to measure the agreement between RER status and each
microsatellite or methylation status and each gene. We considered a good concordance for
Kappa ranging from 0.60 to 0.79, reasonable for Kappa from 0.40 to 0.59 and poor concordance
for Kappa between 0.00 and 0.19. The comparison of each variable frequency was evaluated by
Pearson Chi-square Asymptotic or Pearson Chi-square Exact Test. The univariate analysis was
38
performed by Logistic regression or Poisson regression (variable with prevalence higher than
20%). The variables that showed a significance <0.2 were included in a multivariate logistic
regression model. The adequacy of the model was evaluated by Goodness-of-fit of deviance,
considering as model well adjusted p>0.05. Two-step cluster analysis was performed to
evaluate the clinical and molecular characteristics of the tumor that could differentiate them into
groups.
RESULTS
We characterized 77 patients according to their clinical and molecular characteristics. A
total of 59.7% were female. The mean age was 63 years, since 10.4% of the patients were <45
years old, 27.3% were 45 to 60 years and 62.3% were >60 years. It was observed 27 patients
with rectum tumor, 27 with a tumor in the right-side, 20 in left-side, 2 patients presented
metachronous tumor and 1 synchronous tumor. Seventeen (22.1%) patients followed the
Bethesda guidelines, but only ten (13%) presented familial history of CRC or tumor-related and
fulfilled the Amsterdam II criteria (Table 1).
The RER- status was observed in 45 (58.4%) and 16 (20.8%) patients classified as MSS
and MSI-L, respectively. Sixteen (20.8%) individuals showed RER+ status. Only five (6.5%)
patients were heterozygous for V600E mutation in BRAF gene and no homozygous patient was
observed. According to methylation status, 7.5% of the patients did not show CpG island genes
methylated; 73.6% showed low methylation level and 18.9% high methylation level (Table 1).
For methylation status, only 53 patients could be classified due to sample amplification
problems.
Microsatellite instability analysis showed 20 (26%) samples positive for BAT25
instability, 11 (14%) for BAT26, 16 (21%) for BAT40, 14 (18%) for D2S123, 12 (16%) for
D17S250, and 11 (14%) for D5S346. The methylation status of each sample was analyzed and
the contribution of each gene was: 3 (6%) for MSH2, 24 (45%) for MSH6, 27 (51%) for MLH1,
39 (74%) for MSH3, 12 (23%) for PMS2, and 43 (81%) for MGMT. No sample was positive for
MLH3 methylation.
Kappa concordance test was performed between RER status and the microsatellites and
Methylation status and the MMR genes. A good concordance was found between D2S123
(Kappa=0.75; p<0.0001), BAT25 (Kappa=0.71; p<0.0001), BAT26 (Kappa=0.78; p<0.0001) and
39
BAT40 (Kappa=0.76, p<0.0001) according to RER status. A good concordance was also
observed to PMS2 gene (Kappa=0.64; p<0.0001) and Methylation Status. A reasonable
concordance was found between D5S346 (Kappa=0.60; p<0.0001), D17S250 (Kappa=0.56;
p=0.0001) and RER status, as well as MSH2 (Kappa=0.41; p=0.005) and MSH6 (Kappa=0.44;
p<0.0001) and Methylation status. The other markers, MGMT, MLH1 and showed poor
concordance with methylation status.
Gender and age were associated individually to the clinical and molecular variables
(Online Resource 1). It was observed that a significant association only happened between age
x tumor localization (p=0.037 for right-sided and p=0.016 for left-sided tumor). A significance
residue value was performed for the statistically significant variables. The results demonstrated
that right-sided tumor is more frequent in patients older than 60 years of age (residue = 2.5,
considering significant residue value > 1.96 or < -1.96). Left-sided tumors are more frequent in
patients younger than 45 years of age (residue=2.5) and less frequent in patients older than 60
years of age (residue = -2.5).
Methylation status was transformed in a dichotomic variable, considering low level as
having 4 or less regions positive for methylation and high level, as having 5 or more regions.
This new variable was tested using Logistic Regression model for association with age, gender,
location of tumor (right and left side, rectum), MSI markers, RER status, Amsterdam II criteria,
Bethesda criteria and family history. No significant association was observed between
methylation status and the clinical and molecular characteristics (p>0.05). As demonstrated by
DENG et al [20], the -248 and -178 promoter regions are the main regions related to loss of
MLH1 expression. When those regions were methylated, 71.4% of the samples were RER+ and
85.7% did not fulfill any clinical criteria. With these results, these patients are the main
candidates for SCC.
By Poisson Regression, RER status was tested for association with age, gender,
location of tumor (right and left side, rectum), classification of tumor (synchronous,
metachronous and primary), Amsterdam II criteria, Bethesda criteria, family history, presence of
V600E BRAF mutation, methylation status, and MMR genes. Associations with p<0.2 were
selected for multivariate model and significant association was found for metachronous tumor
(p<0.0001; LR=0.54; CI=0.50-0.58) and inverse for left-sided tumor (p=0.05; LR=1.11; CI=1.001.24) and synchronous tumor (p<0.0001; LR=1.27; CI=1.12-1.44). The association with
40
methylation in MLH1 gene was also observed (p<0.0001; LR=1.18; CI=1.04-1.34). The model
was well adjusted to the data by the measurement of the Goodness-of-fit (p=0.09;
deviance=0.10). No significant association was observed between RER status and the other
clinical and molecular characteristics (p>0.05).
Finally, in an attempt to group the patients according to similar characteristics, a twostep cluster analysis was performed among age, gender, tumor localization, tumor classification,
RER status, methylation status, family history, and BRAF V600E mutation presence (Table 2).
The individuals grouped in the cluster 1 were, in the majority, >60 years of age, female, rightsided tumor, metachronous or synchronous tumor and MSI-H. Although the difference was not
significant, we observed a higher number of CIM-H with presence of BRAF mutation when
compared to the other cluster. The patients in cluster 2 had similar characteristics as <45 years
of age, male, tumor localized in the left side of rectum and MSS. It was observed, although not
significant, that there were a higher number of CIM-0 tumors in this group. The familial history
could not discriminate the clusters, maybe due to difficulty in obtaining accurate information
about it.
DISCUSSION
Recent studies have been made in order to increase the understanding about different
molecular characteristics of CRC tumors.
Clinical criteria were used to classify the CRC as hereditary based in familiar history of
cancer. Considering more patients fulfilled revised Bethesda criteria other than Amsterdam II
criteria, it is possible to infer that Amsterdam II criteria are more restrictive. Studies stated that
Bethesda guidelines, since includes MSI tests, should be more sensitive than Amsterdam II
criteria for diagnosing Lynch syndrome [11]. However, MSI analysis associated with clinical
guidelines demonstrated not to be enough to determine the origin of the tumor [12].
The results shown in this study corroborates with this information considering that only
30% of the patients identified as positive for clinical criteria (Amsterdam II and/or Besthesda
guidelines) were classified as RER+, while the expected percentage of MSI-H in hereditary
CRC ranged from 80 to 90% [24-28]. One of the explanations for this lower RER+ frequency in
patients that fulfill clinical criteria would be that some cases of Lynch syndrome would not be
associated with DNA mismatch repair system abnormalities [35].
41
RER status has a great importance in discriminating between SCC and hereditary CRC,
as well as predicting the patient’s prognosis and type of treatment. Studies revealed that RER+
tumors do not respond to Fluorouracil (5-FU-based adjuvant chemotherapy) as well as RER[30, 36, 37]. The frequency found for MSI-H in this study was 20.8%, being similar to the one
found by LEITE et al. [12] in the Brazilian population (22.7%) and about twice as much as the
frequency found in Chinese, Korean, and Australian CRC population (11.9%, 9.0%, and 11.0%,
respectively) [30].
The marker which presented the highest frequency of instability among the analyzed
microsatellites was BAT25 (26%) contrasting with D5S346 (14%) being the lowest one, being
similar to the results described by LEITE et al [12]. The Kappa concordance test demonstrated
that BAT25, BAT26, BAT40, and D2S123 are the best markers for the analysis and
classification of microsatellite instability. As described by previous studies [11, 12, 30],
mononucleotides are more specific and more sensitive than dinucleotides for defining MSI.
Although we did not observe association between gender and clinical or molecular
characteristics, a significant association was observed between the right-sided tumor and older
patients (> 60 years) and between left-sided tumors and younger patients (< 45 years). This
association between age and tumor location have been observed in previous works [21, 22, 38].
Among RER+ patients, 69.2% were classified as low methylation status. This could be
explained by the fact that the studied MMR genes were not the main cause of instability in the
microsatellite evaluated or because the microsatellite instability is being caused by mutations in
the coding sequence of the MMR genes, which is believed to be the main cause of Lynch
syndrome [39]. It is also worth mentioning that 85.7% of tumor that fulfilled the Amsterdam II
and Bestheda criteria were classified as presenting low level of methylation on MMR gene’s
promoter being consistent with the hypothesis that MSI in hereditary tumor is caused by
mutation in the coding sequence of the MMR genes.
RER+ status presented inverse significant association with the left-sided tumor and
synchronous tumor. RER+ tumors showed association with metachronous tumor. These
findings are important because they allow the predicting of the RER status based on tumor
characteristic and the application of the individual therapeutic protocol.
42
We also observed significant association between RER+ status and MLH1 methylation
gene. MLH1 can be considered the main gene responsible for MSI-H, as previously reported
[20, 40]. Among the samples methylated in -248 and -178 MLH1 promoter region, 71.4% were
RER+ and 85.7% did not meet Amsterdam II and Bethesda guidelines, being these patients the
main candidates for SCC. However, for being methylated in most of the tumors, MLH1 gene
alone cannot distinguish between low and high methylation level.
According to the results, the Kappa concordance test showed that PMS2 gene is the
best MMR gene to classify the tumor according to methylation status. The PMS2 protein forms
with MLH1 a mutL heterodimer that functions as a component of the human mismatch repair
complex [41, 42]. Then, it suggests that the PMS2 is one of the last genes to be methylated
during CRC development since that condition is predominantly observed in CIM-H.
The presence of V600E BRAF mutation (6.5%) was lower than expected, since FARINASARASQUETA et al [43] found 20% of all CRC cases are positives for this mutation. However,
a study performed in the Spanish population found that V600E mutation was present in 6.25%
of the patients that were wild type for K-RAS mutations [44]. Previous studies reported that
BRAF mutation was only found in patients who were not identified as having familial history for
CRC and absence of mutations in MMR genes thus becoming a useful tool to distinguish
between SCC and Lynch syndrome [21-23, 38, 43].
The V600E BRAF mutation was not independently associated with methylation status.
This could bring up the hypothesis that contradicts what has been proposed, which oncogene
mutations are the first events followed by CpG island methylation in MMR genes and MSI [3,
45]. The results suggest that BRAF mutation and lost of MMR genes expression by methylation
could be primary events of cancer development and occur independently from each other.
However, due to the low number of sample identified as heterozygous for V600E BRAF
mutation in this study, further studies are needed to confirm this hypothesis.
The separation of the total sample into two different clusters was an attempt to bring
together individuals with similar characteristics. This outcome is similar to one obtained in recent
studies [21, 22, 38], which MSI-H is associated with female gender, proximal tumor (right-sided),
high level of methylation and older age. This group is associated with a better prognosis;
however, the presence of V600E mutation (more frequent in this group) can abrogate this
43
characteristic giving a higher incidence of lymph node metastasis and worse survival [21, 30].
The absence of lymph node status information for all patients and the follow up with
chemotherapy did not allow associations to be made or compared in this current study.
The other cluster included younger patients (<45 years of age), male gender, tumor
localized in the left side of rectum, MSS and a tendency to higher number of CIM-0 tumors. This
data suggest that men with familiar history of CRC should start prevention earlier than women
and that the tumor in this group can be associated to a worse prognosis. These results can be
an important tool to diagnose the CRC and to adopt a better therapeutic approach, since the
molecular characteristics of the tumor are known.
In conclusion, further studies need to be made in order to validate V600E BRAF
mutation as an exclusion criterion for Lynch syndrome in the Brazilian population. MLH1 and
PMS2 genes should be taken into consideration to characterize the methylation status. MSI
analysis should be made by all CRC patients, once it is a critical characteristic of the tumor and
patients who are candidates for Lynch syndrome should consider genetic counseling.
ACKNOWLEDGMENTS
We acknowledge Frederico Scott Malta, Michele Gonçalves e Valda Ribeiro for technical
support.
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47
Table 1: Clinical and molecular characteristics of CRC patients studied.
Variable
n
Frequency
(%)
Age
<45 years
8
10.4
45 to 60 years
21
27.3
>60 years
48
62.3
Female
46
59.7
Male
31
40.3
Right-sided
27
36.5
Left-sided
20
27.0
Rectum
27
36.5
Primary
74
96.0
Synchronous
1
1.3
Metachronous
2
2.6
MSS
45
58.4
MSI-L
16
20.8
MSI-H
16
20.8
Positive
10
13.0
Negative
67
87.0
Gender
Tumor Location
Tumor Classification
RER status
Amsterdam II criteria
48
Bethesda criteria
Positive
17
22.1
Negative
60
77.9
Positive
10
13.0
Negative
67
87.0
Positive
5
6.5
Negative
62
80.5
CIM-0
4
7.5
CIM-L
39
73.6
CIM-H
10
18.9
Family history
BRAF V600E mutation
Methylation status
RER: Replication Error; MSS: microsatellite stability; MSI: microsatellite
instability; CIM: CpG island methylation; L: low; H: high.
49
Table 2: Two-step cluster analysis for clinical and molecular variables in colorectal cancer
patients.
Variable
pa
Cluster 1
Cluster 2
n (%)
n (%)
<45 years
0 (0.0)
8 (100.0)
_
45 to 60 years
8 (38.1)
13 (61.9)
0.44
>60 years
28 (58.3)
20 (41.7)
0.01*
Female
26 (56.5)
20 (43.5)
1
Male
10 (32.3)
21 (67.7)
0.04*
25 (92.6)
2 (7.4)
<0.001*
Left-sided
1 (5.0)
19 (95.0)
<0.001*
Rectum
7 (25.9)
20 (74.1)
0.01*
Metachronous
2 (100.0)
0 (0.0)
_
Synchronous
1 (100.0)
0 (0.0)
_
MSS
12 (26.7)
33 (73.3)
<0.001*
MSI-L
8 (50.0)
8 (50.0)
0.79
MSI-H
16 (100.0)
0 (0.0)
_
0 regions
1 (25.0)
3 (75.0)
0.33
from 1 to 4 regions
21 (53.8)
18 (46.2)
1
Age
Gender
Tumor location
Right-sided
Tumor classification
RER status
Methylation Status
50
≥5 regions
6 (60.0)
4 (40.0)
0.73
Positive
6 (60.0)
4 (40.0)
1
Negative
30 (44.8)
37 (55.2)
0.5
Positive
4 (80.0)
1 (20.0)
1
Negative
32 (44.4)
40 (55.6)
0.18
Family history
BRAF V600E mutation
a - 2 test, * Statiscally significant: p<0.05.
51
Online Resource 1: Individual associations of clinical and molecular variables with age and
gender.
Variable
Age
Gender
P Value
P Value
RER status
0.310b
0.800a
Amsterdam II criteria
0.628b
1.000b
Bethesda criteria
1.000b
0.636a
Family history
0.623b
1.000b
BRAF V600E mutation
0.462b
1.000b
Methylation status
0.684b
0.269b
Right-sided tumor
0.037a *
0.672a
Left-sided tumor
0.016a *
0.978a
Rectum tumor
0.613a
0.300a
Metachronous tumor
0.656b
0.513b
Synchronous tumor
0.377b
1.000b
a-Pearson Chi-square Asymptotic Test; b- Pearson Chi-square Exact Test;
* Statically significant: p<0.05.
52
6. DISCUSSÃO
53
O CCR configura-se como a terceira causa mais comum de câncer no mundo em ambos
os sexos, sendo a segunda causa em países desenvolvidos. No Brasil, observou-se, nos
últimos 20 anos, uma tendência ao aumento da mortalidade devido ao CCR, uma vez que
modificações no nosso hábito de vida, como dieta, e obesidade são fatores associados ao
desenvolvimento da doença (TORRES et al.; 2010).
No presente trabalho, foram caracterizados 77 pacientes atendidos pelo serviço de
coloproctologia da Santa Casa de Belo Horizonte e Hospital Biocor, através da análise de
fragmentos de tecido tumoral e tecido “normal”, sendo 31 amostras fixadas em parafina e 46
analisadas a fresco. A seleção dos pacientes foi realizada pelo médico de forma sequencial ao
procedimento cirúrgico de retirada do tumor, sendo excluídos os casos compatíveis com a
clínica de FAP.
Dentre os pacientes estudados, 46 (59,7%) eram do sexo feminino e 31 (40,3%) do
sexo masculino, numa razão de 1:0,67. A distribuição da doença de acordo com gênero,
observada no presente estudo, foi semelhante ao achado de OLIVEIRA et al (2004) onde foi
observada uma maior frequência entre mulheres (59,9%), quando comparado aos homens
(40,1%). KOEHLER-SANTOS et al (2011) também observaram 53,3% de pacientes do sexo
feminino dentre 212 indivíduos com adenocarcinoma de cólon e reto atendidos em um serviço
de saúde em Porto-Alegre - RS. TORRES et al (2010) encontraram uma flutuação do número
de casos de CCR de acordo com o gênero, em um levantamento realizado no Sistema Único
de Saúde (SUS), no período de 1996 a 2008. Segundo os autores, dos 297.108 casos de
hospitalização em função da doença, a razão homens/mulheres manteve-se estável de 19962001 com leve predominância do sexo feminino, sendo de 0,95:1,0. A partir de 2002 observouse uma leve prevalência de indivíduos do sexo masculino (1,06:1,0), sendo observada uma
reversão desta proporção a partir de 2008.
Embora nenhuma diferença significativa tenha sido observada entre os gêneros e a
prevalência do CCR, dados do INCA (INCA, 2010) têm demonstrado uma maior frequência de
indivíduos do sexo masculino apresentando o câncer de reto. No presente trabalho, esta
relação não foi confirmada, uma vez que dos 27 pacientes apresentando câncer retal, apenas
48,1% eram do sexo masculino. Esta discrepância pode ser conferida à diferença populacional,
uma vez que o INCA reúne levantamentos epidemiológicos de todo o país, enquanto o
presente estudo analisou indivíduos predominantemente naturais do estado de Minas Gerais.
54
Os pacientes apresentaram idade média de 63 anos, sendo 10,4% com menos de 45
anos, 27,3% entre 45 e 60 anos, e 62,3% com idade igual ou superior a 61 anos. Embora a
idade em alguns casos não seja a mesma do diagnóstico, há grande proximidade entre os dois
valores, uma vez que o procedimento cirúrgico deve ser realizado tão logo a doença seja
diagnosticada. Segundo KOEHLER-SANTOS et al (2011), a idade média para o aparecimento
do câncer colorretal é de cerca de 45 anos para os pacientes que apresentam a forma
hereditária da doença, sendo que em alguns casos da Síndrome de Lynch o diagnóstico pode
ser feito na segunda década de vida. Em contrapartida, o diagnóstico da forma esporádica da
doença é feito em torno dos 65 anos de idade.
Com base nestes dados, acredita-se que 8 pacientes participantes do presente estudo são
fortes candidatos a apresentarem a Síndrome de Lynch, uma vez que um dos critérios de
classificação da doença compreende o diagnóstico do câncer em idade precoce. Além disso,
dados da literatura revelam que cerca de 10% dos casos de CCR são do tipo Síndrome de
Lynch (WANG et al, 2006). De fato, foi observado que 10,4% dos pacientes tiveram o
diagnóstico antes de 45 anos, corroborando com a hipótese de apresentarem a forma
hereditária da doença.
Com relação aos tumores primários, foi observada uma frequência aproximada entre
aqueles localizados no cólon direito, esquerdo e reto, sendo 36,5; 27,0 e 36,5% a frequência de
cada um, respectivamente. Embora não seja observada diferença entre estes valores, é
interessante ressaltar que nos últimos 50 anos houve um deslocamento gradual em relação à
frequência da localização dos carcinomas, migrando do reto e cólon esquerdo para o cólon
direito. Sabe-se que os tumores no reto são mais facilmente diagnosticados pela própria
localização anatômica, no entanto, o encontro dos tumores no cólon direito tem sido facilitado
com a melhoria nos métodos de detecção (GORDON e NIVATVONGS, 1999).
Critérios clínicos foram usados para classificar o CCR como hereditário, com base no
histórico familiar de câncer. Dentre os pacientes estudados, cerca de 13% possuíam história
familiar para o CCR, sendo que 87% não apresentavam esta característica ou desconheciam a
causa de morte de seus familiares, estando esta frequência dentro do esperando, uma vez que
as neoplasias hereditárias correspondem a 10-20% do total dos casos de CCR [LYNCH et al.;
1995; LYNCH et al.; 1998; KOEHLER-SANTOS et al.; 2011].
55
Considerando que mais pacientes foram positivos para os critérios de Bethesda
revisado (17) do que os critérios de Amsterdam II (10), é possível inferir que os critérios de
Amsterdam II são mais restritivos. Algumas variáveis foram introduzidas nos critérios de
Bethesda que possibilitaram a inclusão de pacientes que haviam sido excluídos na
classificação de Amsterdam II, dentre elas, a inclusão de tumores sincrônicos e metacrônicos
como diagnóstico, adenomas que surgiram antes dos 40 anos e a necessidade de apenas dois
parentes de primeiro grau com CCR ou adenoma (LEITE, 2006).
Alguns trabalhos discutem que, pelo fato dos critérios de Bethesda incluírem o teste de
instabilidade de microssatélites (MSI) (Anexo 1 A), estes devem ser mais sensíveis do que os
critérios de Amsterdam II para o diagnóstico da Síndrome de Lynch (IMAI et al.; 2008).
Entretanto, mesmo com a inclusão do teste MSI associada às variáveis clínicas, os critérios de
Bethesda ainda não são suficientes para determinar a origem do tumor (LEITE et al.; 2010).
Os resultados apresentados por este estudo e por KOEHLER-SANTOS et al (2011),
realizado também na população brasileira, corroboram com essa informação considerando que
somente 30% dos pacientes identificados como positivos para os critérios clínicos (Amsterdam
II e/ou Bestheda) foram classificados como RER+, enquanto a percentagem esperada de MSIH in CCR hereditário varia de 80 a 90% (IONOV et al.; 1993; THIBODEAU et al.; 1993;
PAPADOPOULOS et al.; 1994; WHEELER et al.; 2000; LORENTE et al.; 2008). Uma das
possíveis explicações para esta menor frequência de RER+ em pacientes que seguem os
critérios clínicos seria que alguns casos de Síndrome de Lynch não estariam associados a
anormalidade no sistema de reparo de DNA. (KOEHLER-SANTOS et al., 2011)
O status RER tem grande importância em discriminar entre CCR esporádico e
hereditário, assim como predizer o prognóstico do paciente. Além disso, estudos revelaram que
tumores RER+ não respondem tão bem ao tratamento com quimioterapia adjuvante baseada
em Fluorouracila (5-FU) quando comparados aos tumores RER- (BENATTI et al.; 2005;
DOUILLARD et al.; 2010; HUANG et al.; 2010). A frequência encontrada neste estudo para
MSI-H foi de 20,8% do total de casos de CCR, sendo similar à frequência observada por LEITE
et al (2010) na população brasileira (22.7%) e cerca de duas vezes maior que a frequência
encontrada nas populações chinesa, koreana e australiana (11.9%, 9.0% e 11.0%,
respectivamente) (HUANG et al.; 2010).
56
O marcador que apresentou maior frequência de instabilidade entre os microssatélites
analisados foi BAT25 (26%), contrastando com o D5S346 (14%), que foi o de menor
frequência, estando de acordo com o que já foi previamente descrito por LEITE et al (2010). O
teste de concordância Kappa demonstrou que BAT25, BAT26, BAT40 e D2S123 são os
melhores marcadores para a análise e classificação de instabilidade de microssatélites, uma
vez que seus resultados apresentaram maior concordância com a classificação em RER+ ou
RER-. Como descrito em estudos anteriores (IMAI et al.; 2008; LEITE et al.; 2010; HUANG et
al.; 2010), mononucleotídeos (BAT25, BAT26, BAT40) são mais específicos e mais sensíveis
do que dinucleotídeos para análise de MSI.
A contribuição da metilação de cada gene de reparo na classificação final como CIM-H
ou CIM-L/CIM-0 foi avaliada separadamente (Anexo 1 B). Observou-se uma frequencia de 6%
para o gene MSH2, 23% para PMS2, 45% para MSH6, 51% para MLH1, 74% para MSH3 e
81% para MGMT. Nenhuma amostra apresentou metilação na região promotora do gene
MLH3. Segundo SJURSEN et al (2010) as frequências encontradas na população norueguesa
de genes metilados nos tumores de CCR são: MSH2 (45%), MSH6 (27%), MLH1 (22%) e
PMS2 (6%).
A metilação no gene MLH1 apresentou uma frequência de 74% dentre os tumores
analisados, resultado este semelhante ao descrito por CUNNINGHAM et al (2001), onde 88%
dos tumores demonstraram metilação no gene MLH1. Já TOYOTA et al (1999), sugerem que a
maioria dos tumores do tipo CIM-H são causados pela inativação da região promotora de
MLH1, o que poderia explicar 75% dos casos de CCR com RER+. De fato, como cerca de 80%
do total de CCR são do tipo esporádico (DE LA CHAPELLE, 2004; MORÁN et al.; 2010),
acredita-se que a alta frequência observada esteja associada aos tumores esporádicos
constituintes do nosso estudo.
O gene MSH2 também possui envolvimento com a gênese do CCR, sendo que na
população brasileira foi observada uma frequência de 8% deste gene mutado em pacientes
com suspeita de Síndrome de Lynch (ROSSI et al.; 2002). Outros trabalham relatam a
importância deste gene no desenvolvimento da forma esporádica da doença, seguindo a
metilação no gene MLH1. PARK et al (2010) observaram que 38,9% dos cânceres esporádicos
apresentavam alteração na expressão de MSH2, enquanto SLOMKA et al (2010) encontram
13,5% dos tumores com perda da expressão de MSH2. A frequência de metilação no nosso
57
estudo foi inferior ao relatado em outros estudos (6%), mas difere dos dados relatados
anteriormente por não terem sido excluídos pacientes com a possível forma hereditária da
doença.
WAHAB et al (2011) encontraram mais alto índice de metilação no gene MGMT em
pólipos adenomatosos de pacientes egípcios. Os autores discutem que a alta frequência de
padrões aberrantes de metilação no promotor deste gene está associada à sua função como
iniciador da doença, o que explicaria o fato de ter sido encontrada uma frequência de 81% de
metilação neste gene entre os tumores analisados naquele estudo. No entanto, BOLAND et al
(2009) discutem que a metilação no gene MGMT está envolvida em neoplasias mais
avançadas. Assim, mais estudos em diferentes populações deverão ser conduzidos a fim de
elucidar o papel da proteína MGMT no desenvolvimento do CCR.
Mutações nos genes MSH6, PMS2, MLH3 e MSH3 têm sido descritas em associação
com alguns casos de Síndrome de Lynch, geralmente presentes em pacientes com fenótipos
mais brandos da doença. Poucos trabalhos têm relatado a importância da metilação nestes
genes no desenvolvimento do CCR de forma geral. Segundo DURATURO et al (2010)
mutações isoladas no gene MSH3 não são suficientes para iniciar o processo de tumorigênese,
mas podem influenciar o surgimento de alterações em outros gene de reparo. No presente
estudo, foram observados 74% dos tumores com metilação na região promotora do gene
MSH3.
Mutações no gene MSH6 causam deficiência parcial no sistema de reparo, levando a
um fenótipo de baixa instabilidade de microssatélites (CHUNG et al.; 2003). Este fato pode ser
confirmado pelos resultados encontrados neste estudo, uma vez que, dentre os pacientes que
apresentaram metilação no gene MSH6, 70,8% foram classificados como RER-.
NIESSEN et al (2009) observaram que, dentre 97 pacientes com Síndrome de Lynch sem
mutações nos genes MLH1, MSH2, ou MSH6, quatro apresentaram mutações funcionais no
gene PMS2, sugerindo que este gene possui grande importância no desenvolvimento da forma
hereditária da doença. Segundo os resultados obtidos no presente estudo, 23% dos tumores
apresentaram metilação no gene PMS2. É interessante ressaltar que apenas 10% dos casos,
em que o histórico familiar de câncer foi relatado, apresentou metilação em PMS2, sugerindo,
ao contrário do estudo anteriormente citado, que a metilação neste gene está envolvida com a
58
forma esporádica da doença. Outro dado que vem corroborar com esta hipótese, está no fato
de que 90% dos casos de CIM-H apresentaram metilação em PMS2, sendo que esta condição
fenotípica está relacionada à forma esporádica da doença (JUBB et al.; 2001).
A proteína MLH3 interage com MLH1, onde exerce sua função de reparo do DNA.
Poucos trabalhos foram conduzidos até o momento relacionados a este gene, pelo fato de ter
sido descrito apenas em 2001 por LIPKIN et al. Neste estudo, nenhuma mutação germinativa
foi encontrada em pacientes com predisposição familiar ao câncer. No entanto, 25% de
tumores apresentaram mutações somáticas no gene MLH3, sugerindo uma associação com a
forma esporádica da doença. No presente estudo não foi observada metilação no gene MLH3
em nenhum dos tumores analisados, sugerindo que a metilação neste gene parece não ter
influência no desenvolvimento do CCR. O fato de LIPKIN et al (2001) ter avaliado a presença
de mutações, e não alterações epigenéticas, poderia explicar a discrepância observada entre
os dois resultados.
O teste de concordância Kappa mostrou que o gene MGMT não seria um bom
marcador para classificar tumores como tendo alto ou baixo nível de metilação. Entretanto, um
estudo feito por SVRCEK et al (2010), observou uma associação entre o gene MGMT e o
status RER: a perda de expressão deste gene foi mais frequente em tumores MSI do que
tumores MSS. Esta associação pode ser explicada pelo fato de que o gene MGMT sofre
aumento da metilação gradualmente durante a progressão do tumor (BOLAND et al.; 2009).
A proteína PMS2 forma um heterodímero com o gene MLH1 que funciona como
componente do complexo do sistema de reparo humano (DA SILVA et al.; 2009; VAN ROON et
al; 2010). Segundo a análise de concordância Kappa, a metilação neste gene pode ser
considerada o melhor marcador para classificar o tumor com relação ao nível de metilação. Isto
sugere, então, que o gene PMS2 é um dos últimos a serem metilados durante o
desenvolvimento do CCR, uma vez que esta condição é predominantemente encontrada em
CIM-H.
Pelo fato da metilação no promotor do gene MLH1 ocorrer em quase todos os tumores,
o mesmo não deverá ser utilizado como critério de classificação entre tumores CIM-H e CIML/CIM-0, dado este confirmado pela baixo nível de concordância apresentado pelo índice
Kappa (0,291; p=0,011).
59
No presente estudo não foi observada associação entre o gênero e as características
clínicas e moleculares. Conforme discutido anteriormente, não há associação entre o gênero e
a prevalência de CCR (KOEHLER-SANTOS et al.; 2011). Assim, a ausência de associação
entre estas variáveis já era esperada.
Uma associação significativa foi observada entre o tumor de cólon direito e pacientes
com idade avançada (>60 anos), e entre tumor de cólon esquerdo com pacientes mais jovens
(<45 anos). Essas mesmas associações entre idade e localização do tumor foram encontradas
em estudos anteriores (NOSHO et al.; 2008; OGINO et al.; 2009; TANAKA et al.; 2010).
Embora seja desconhecida a causa desta associação, este achado poderá orientar o clínico
durante o diagnóstico quanto à provável localização do tumor.
Entre os pacientes RER+, 69,2% foram classificados como baixo nível de metilação
(CIM-0 / CIM-L). Isto pode ser explicado pelo fato de que os gene de reparo estudados não são
os principais causadores da instabilidade nos microssatélites avaliados, ou porque a
instabilidade de microssatélite está sendo causada por mutações na sequência codificadora
dos genes de reparo, o que acredita-se ser a principal causa da Síndrome de Lynch (LI et al.;
2006). Embora a análise de regressão logística não tenha mostrado associação independente
com os critérios clínicos, é válido mencionar que 85,7% dos tumores que foram identificados
como positivos para os critérios de Amsterdam II e Bethesda apresentaram baixo nível de
metilação, sendo consistente com a hipótese de que tumores hereditários são causados por
mutação na região codificadora dos genes de reparo, e não metilação.
Os tumores RER+ apresentaram associação significativa com o tumor sincrônico e uma
associação inversa com tumor de cólon esquerdo. Já os tumores RER- apresentaram maior
associação com tumores metacrônicos. Estes achados são importantes porque permitem
predizer o status RER com base na característica do tumor, além de permitir a adoção de
esquemas terapêuticos específicos para cada paciente. Este dado é importante, uma vez que
desconhecemos trabalhos que relatem este tipo de associação. No entanto, devido ao pequeno
número de pacientes que apresentaram tumores metacrônicos e sincrônicos, outros estudos
devem ser conduzidos para avaliar a importância deste dado.
Foi ainda observada uma associação significativa entre o status RER+ e a metilação do
gene MLH1. Este gene tem sido considerado um dos responsáveis pela MSI-H, como descrito
60
anteriormente (ROSSI et al.; 2002). DENG et al (1999) discutem que a metilação nas regiões 248 e -178 do promotor do gene MLH1 é o principal mecanismo para determinar a perda da
expressão da proteína. Neste trabalho, 71,4% dos tumores com metilação nestas regiões
apresentaram RER+ e 85,7% não preencheram os critérios de Amsterdam II e Bethesda,
sendo considerados pacientes candidatos para CCR esporádico.
A frequência da mutação V600E no gene BRAF (6,5%) foi inferior ao observado entre
outras populações, considerando que JARRY et al (2004) encontrou uma frequência de 9,1%
desta mutação entre indivíduos com
CCR na população francesa. Estudos recentes
demonstraram que a mutação no gene BRAF foi encontrada somente em pacientes sem
história familiar de CCR e sem mutações nos genes de reparo, tornando-se uma importante
ferramenta na distinção entre CCR esporádico e Síndrome de Lynch (NOSHO et al.; 2008;
VELHO et al.; 2008; OGINO et al.; 2009; FARINA-SARASQUETA et al.; 2010.; TANAKA et al.;
2010). Além da possível utilização da mutação V600E como critério de exclusão para a
Síndrome de Lynch, estudos revelaram que esta alteração genética pode influenciar também
na resposta terapêutica do paciente. Segundo PHILLIPS et al (2010), paciente heterozigotos
para a mutação V600E não respondem positivamente ao tratamento com anticorpos
monoclonais anti-EGFR, porém, mais estudos com mais pacientes e a longo prazo precisam
ser feitos para que esta hipótese possa ser aceita.
Devido à baixa frequência da mutação V600E no gene BRAF no presente estudo, não
foi possível segregar os pacientes conforme o tipo da doença (CCR hereditário do esporádico).
Portanto, os resultados obtidos sugerem que a importância desta mutação no diagnóstico é
variada dependendo da população. Sendo assim, outros estudos precisam ser conduzidos no
Brasil a fim de validar o uso deste marcador como critério de distinção sobre a origem do
tumor.
A mutação V600E BRAF não pode ser associada independentemente com o nível de
metilação. Este resultado contradiz a hipótese de que mutações em oncogenes são os
primeiros eventos que ocorrem na carcinogênese, seguidos pela metilação das ilhotas CpG dos
genes de reparo, e posteriormente MSI (CALVERT et al.; 2002; MORÁN et al.; 2010). Os
resultados obtidos sugerem que a mutação no gene BRAF e a perda de expressão dos genes
de reparo através da metilação podem ser eventos primários no desenvolvimento do câncer e
ocorrer de maneira independente um do outro. Entretanto, devido ao baixo número de
61
amostras identificadas como heterozigotas para a mutação V600E, mais estudos serão
necessários para a confirmação de tal hipótese.
A separação das amostras em dois grupos diferentes (cluster) foi realizada na tentativa
de agrupar indivíduos com características clínicas e moleculares semelhantes. O resultado é
similar ao obtido em estudos recentes (NOSHO et al.; 2008; OGINO et al.; 2009; TANAKA et
al.; 2010), que associaram MSI-H com sexo feminino, tumor proximal (cólon direito), alto nível
de metilação e idade avançada. Esse grupo é associado a um melhor prognóstico, entretanto, a
presença da mutação V600E no gene BRAF (mais frequente neste grupo) pode contrapor este
benefício, levando a uma maior incidência de metástase linfonodal e pior sobrevida (OGINO et
al.; 2009; HUANG et al.; 2010). A ausência de informação do status linfonodal de todos os
pacientes e acompanhamento quimioterápico não permitiu que associações fossem feitas ou
comparadas neste estudo.
O outro grupo inclui pacientes jovens (< 45 anos de idade), sexo masculino, com
tumores de cólon esquerdo e de reto, MSS e tendência a um maior número de tumores CIM-0.
Este grupo obteve uma maior frequência de histórico familiar, embora não tenha sido
observada associação significativa. Estes achados corroboram com o fato de que a Síndrome
de Lynch ocorre principalmente em pacientes com idade inferior aos 45 anos de idade (CHUNG
et al.; 2003; UMAR et al.; 2004). Entretanto, a presença de tumores MSS contradiz o fato de
que 80 a 90% dos tumores da Síndrome de Lynch são MSI-H, segundo observado por outros
autores (IONOV et al.; 1993; THIBODEAU et al.; 1993; PAPADOPOULOS et al.; 1994;
WHEELER et al.; 2000; LORENTE et al.; 2008). No entanto, KOEHLER-SANTOS et al (2011),
afirmam que o CCR hereditário pode não estar associado a anormalidade no sistema de
reparo de DNA, o que justificaria os resultados obtidos.
Estes achados sugerem que homens com história familiar de CCR devem começar a
prevenção mais precocemente que mulheres e normalmente apresentam tumores associados a
um pior prognóstico. Estes resultados podem ser uma importante ferramenta para o diagnóstico
de CCR em estágios iniciais, momento em que normalmente o diagnóstico só é realizado na
presença de forte evidência clínica ou no emprego de testes de screening avançados.
62
Em conclusão, mais estudos precisam ser feitos a fim de validar a mutação V600E no
gene BRAF como critério de exclusão para a Síndrome de Lynch na população brasileira. Os
genes MLH1 e PMS2 devem ser levados em consideração para a caracterização do tipo de
tumor e do nível de metilação, respectivamente. Análise de MSI deve ser feita em todos os
pacientes com CCR, uma vez que esta característica do tumor é crítica e pacientes e familiares
candidatos para a Síndrome de Lynch devem considerar aconselhamento genético e
acompanhamento precoce. É de grande importância a classificação dos pacientes segundo os
clusters definidos nesse estudo, uma vez que estes podem prever o prognóstico e a evolução
da doença. A inclusão de características moleculares na conduta médica pode individualizar o
tratamento, proporcionando melhores resultados e aumentando a expectativa de vida do
paciente.
63
7. CONCLUSÕES
64

A mutação V600E no gene BRAF mostrou baixa frequência na população de indivíduos
com CCR, o que sugere que esta não pode ser considerada um bom marcador para
distinguir indivíduos com a forma esporádica e hereditária da doença.

Há associação entre o desenvolvimento do CCR após os 60 anos de idade, em
indivíduos do sexo feminino, presença do tumor no cólon direito, tumor metacrônico ou
sincrônico e alta instabilidade de microssatélites

Indivíduos que desenvolveram o CCR antes dos 45 anos são predominantemente do
sexo masculino, em sua maioria possuem o tumor localizado no colón esquerdo e/ou
reto e não apresentam instabilidade de microssatélites. Um maior número destes
pacientes apresenta baixo nível de metilação na região promotora dos genes de reparo.

Análise de instabilidade de microssatélites, bem como de metilação nos genes de
reparo PMS2 e MLH1 deve ser instituída na prática clínica como forma de auxílio
diagnóstico.
65
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
66
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74
Anexo 1 A: Avaliação de instabilidade de Microssatélite.
Figura ilustrativa: Células do tecido não tumoral se diferem das células do tecido
tumoral para o marcador BAT40, indicando presença de instabilidade (esquerda).
Similaridade entre as células dos tecidos tumoral e não tumoral indicam ausência de
instabilidade de microssatélite (direita).
75
Anexo 1 B: Metodologia MLPA.
Acima: Figura ilustrativa da técnica.
Abaixo: Eletroferograma de uma análise de MLPA para metilação da região promotora
dos genes de reparo.
76
Anexo 1 C: Detecção da mutação V600E do gene BRAF em PCR em Tempo Real.
77
APÊNDICE 1
PROJETO DE PESQUISA: AVALIAÇÃO MOLECULAR DO CANCER COLORRETAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS –
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Dados Clínicos
Dados Pessoais:
Nome:_______________________________________________________________________
Idade: _________________
Gênero: ( )Feminino
( )Masculino
História familiar de câncer:
Parentesco: ( )Mãe
( )Pai
( )Irmãos
( )Outros: ____________________________
Idade em que o câncer foi diagnosticado:_____________________
Tipo de câncer:_________________________________________________________________
Parentesco: ( )Mãe
( )Pai
( )Irmãos
( )Outros: ____________________________
Idade em que o câncer foi diagnosticado:_____________________
Tipo de câncer:_________________________________________________________________
Parentesco: ( )Mãe
( )Pai
( )Irmãos
( )Outros: ____________________________
Idade em que o câncer foi diagnosticado:_____________________
Tipo de câncer:_________________________________________________________________
Localização do Tumor:______________________________________________________
____________________________________________________________________________
Características Histológicas:_______________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
78
APÊNDICE 2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PROJETO DE PESQUISA: “Avaliação genética para diagnóstico do câncer colorretal.”
Prezado (a) Sr.(a),
Este projeto tem por objetivo estudar quais as mudanças nos genes estão relacionadas ao
câncer que se desenvolve no intestino. Para realizá-lo, utilizaremos uma parte do pedaço de intestino,
retirada pelo seu cirurgião, para a realização de outros exames por ele indicado. È importante que você
saiba que o tamanho do pedaço de intestino retirado, bem como a cirurgia realizada, não serão
alterados em função da nossa pesquisa. A parte que utilizaremos normalmente seria descartada após a
cirurgia. Desta forma, não provoca problemas ou interferências na sua saúde.
Gostaríamos de convidá-lo para participar desta pesquisa como voluntário (a), sem custo algum
pelos exames realizados. É possível que você não venha a se beneficiar diretamente dos resultados
deste estudo, mas certamente contribuirá para que novos pacientes venham futuramente se beneficiar.
Se você não quiser participar, não haverá qualquer problema no seu tratamento e assistência
recebida pelo seu médico. Se você quiser participar, deverá autorizar a utilização de parte do fragmento
de intestino que será coletado para a realização do exame solicitado pelo seu médico. As amostras
coletadas serão utilizadas para a obtenção do DNA e estudo dos genes.
Seu nome será mantido em segredo, não sendo divulgado em nenhuma hipótese.
Se você estiver de acordo, por favor, assine esta folha.
De acordo:________________________________
(Assinatura)
Nome:
Data:___/___/_____
Solicitamos também a autorização para o armazenamento de sua amostra para outros estudos
futuros que ajudarão a compreender porque se desenvolve o câncer de intestino em determinadas
pessoas. Este material ficará armazenado no Banco de Amostras da Faculdade de Farmácia da
79
Universidade Federal de Minas Gerais e será utilizado apenas com o objetivo de desenvolvimento de
projetos de pesquisa, quando será mantido sigilo sobre o fornecedor da amostra. Caso aceite que sua
amostra seja armazenada, favor assinar novamente abaixo. É importante que você saiba que se a
amostra estiver armazenada, poderemos utilizá-la em um estudo futuro sem a necessidade de pedir
sua autorização novamente. Caso não seja aceite o armazenamento da amostra, isto não impedirá que
a mesma seja utilizada para o projeto acima citado.
Autorizo o armazenamento da minha amostra no Banco de Amostras.
Ass:__________________________________________________
Qualquer dúvida sobre a sua participação neste estudo, por favor, entre em contato pelo telefone
3228-6517 com Carla Rasuck ou Profa. Karina Braga Gomes Borges no telefone 3409-6902 –
COLTEC/UFMG.
Desde já agradecemos sua valiosa participação.
Nome:___________________________
Assinatura:_________________
Pesquisador responsável
Data:
COEP - Comitê de Ética em Pesquisa - Av. Antônio Carlos, 6627, Unidade Administrativa II - 2º
andar - Sala 2005, Campus Pampulha, Belo Horizonte, MG – Brasil. telefax 31 3409-4592.
[email protected]
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