Download genoma - Biologia Molecular e Genética

GENOMA
Genomas procariótico e eucariótico
• Organização do DNA nos cromossomas
• Organização dos genes nos cromosssomas
• Estrutura dos genes
e ainda:
• DNA repetitivo
• (DNA extracromossómico)
Genomas
(generalidades)
Célula- compartimentos celulares delimitados por membranas
Eucariotas
Genoma- 2 ou mais moléculas de DNA lineares
- DNA mitocondrial e plastidial
. menores dimensões
. circular
- 1x102 Mb- 1x105 MB (o mais pequeno = 10 Mb)
Célula- não compartimentalização interna
Procariotas
Genoma- 1 molécula DNA circular
- haplóides
- 1- 10 Mb
- plasmídios (1 kb-250 kb), profagos e elementos móveis
- informação genética mais compacta
- grande diversidade de organização
Ex: Borrelia burgdorferi
cromossoma linear: 911 kb (835 genes)
17 ou 18 moléculas lineares e circulares: 533 kb (430 genes)
O que se considera “Genoma”?
Genoma = DNA cromossómico
Genoma = DNA cromossómico + DNA plasmídico
Vibrio cholerae: 2 moléculas de DNA circulares
- 2, 96 MB (3885 genes); 71% genoma
- 1,07 MB (caract. plasmídio)
Genoma = DNA cromossómico + DNA mitocondrial e/ou plastidial
Dimensões de Genomas
Relação complexidade dos organismos com dimensão
do genoma
1) Organismos mais complexos
Genoma de maiores dimensões
ex. Homo sapiens (3 Gb) vs Drosophila melanogaster (180 Mb)
2) Paradoxo C
Salamandra- > 90 Gb vs Homem- 3 Gb
Relação do número de genes com dimensão do
genoma
S. cerevisae - 12 Mb
0,004 do genoma humano (3 Gb)
Genoma humano – 35 000 genes x 0,004 = 140 genes para S. cerevisae
Genoma de levedura contém
aprox. 5 800 genes
ECONOMIA DE ESPAÇO NO GENOMA DOS ORGANISMOS MENOS COMPLEXOS
Relação de complexidade do organismo com o número de
genes e com dimensão do genoma
ARROZ
MILHO
Mesmo número
de genes
0,43 Gb
2,5 Gb
Organismos semelhantes diferem na dimensão do genoma,
mantendo o mesmo número de genes aproximadamente
DNA supercoiling
“sobrenrolamento” ou “subenrolamento”
DNA within the cells adopts several forms of ordered
tertiary structures begining with the formation of coiled
and supercoiled helical DNA under the control of enzymes
known as topoisomerases
A dupla hélice do DNA é uma hélice α
o que significa que tem enrolamento
right-handed, ie, no sentido dos ponteiros do relógio
O supercoliling é consequência de:
demasiadas rotações (“super-rotação”- overwound )
da hélice sob si própria (positive supercoiling),
ou perda de rotações (“sub-rotação”- underrotating)
sob si própria (negative supercoiling)
Neste caso a direcção do enrolamento é oposta à do right-handed da dupla hélice
O supercoling só ocorre quando as duas cadeias de DNA não conseguem rodar
livremente uma sobre a outra, ie,
quando as extremidades estão fixas e as
superrotações ou subrotações
não podem ser compensadas (como o que acontece no DNA circular)
Superhelical tension in DNA
causes
DNA supercoiling
The movement of the protein causes :
- a deficit of helical turns to arise
-an excess of helical turns
in the DNA behind the protein
to accumulate in the DNA helix
ahead of the protein
Positive and negative
supercoiling
Forma relaxada
- 10 pb/rotação na conformação B
Alteração da forma relaxada
- mais ou menos de 10 pb/rotação
na conformação B
+
-
Positive supercoil
Negative supercoil
Ocorre quando o DNA
está overrotated
Ocorre quando o DNA
está underrotated
Enrolamento no mesmo
sentido do enrolamento
da dupla hélice
Enrolamento no sentido
contrário do enrolamento
da dupla hélice
Topoisomerases
Enzimas que adicionam ou removem rotações da dupla hélice de DNA,
quebrando temporariamente a dupla hélice, permitindo a rotação de
uma cadeia em volta da outra, e depois ligando-a de novo.
Topoisomerase I
quebra de uma cadeia, e reduz o
supercoiling devido a
remoção de rotações
Topoisomerase II
quebra de ambas as cadeias,
adicionando ou removendo rotações
Organização do DNA cromossómico
em E. coli
Chromosome is condensed
in one part of the cell
Cromossoma de E.coli
- Molécula de DNA circular-fechada,
negativamente enrolada
- 4 600 kb
- 99-100% codificante
- aproxi. 4280 genes
Nick allows this loop
to become relaxed
-Nucleóide (estrutura condensada):
. 40-50 domínios independentes
ou “loops” de 10-100 kb
. Topoisomerases
. Proteínas de ligação ao DNA
- HU
- H-NS (H1)
- Fis
- IHF
-Divisão celular:
“attachment point”
(versão desactualizada)
Organização do DNA cromossómico
em eucariotas
Estrutura dos cromossomas eucarióticos
2
3
Nucleossoma- unidade elementar da cromatina
Structure of a nucleosome
H3 and H4 are among the most conserved proteins.
H2A and H2B an be recognized in all eukaryotes, but
show species-specific variation in sequence.
H1, closely related proteins that show appreciable
variation between tissues and species
(and are absent from yeast)
The nucleosome core particle consists of 146 bp of DNA wrapped 1.65 turns
around a histone octamer consisting of two molecules each of H2A, H2B, H3, and H4.
A nucleosome (chromatosome) contains two full turns of DNA locked in place by one molecule of H1.
Octâmero de histonas
Dímero: H2A
Tetrâmero: 2H3, 2H4
Dímero: H2B
Nuclease protection assays of chromatin
from human nuclei
Higher-level of packaging
Electron micrographs contrasting the
100 Å fiber with the 300 Å fiber (30 nm)
Diferentes níveis de organização das fibras de cromatina
Estados de condensação do DNA
Outras proteínas não-histonas presentes no
cromossoma
•
•
•
•
No cinetocóro
Nos telómeros
No scaffold
Proteína da maquinaria da replicação
– DNA polimerases
– Helicases
– Primases
• HMP (high-mobility-group proteins)
– RNA polimerases
– Acetilases
– Factores de transcrição
E ainda proteínas importantes na alteração do empacotamento e enrolamento
da cromatina durante a transcrição
Proteins scaffold
Papel importante na estrutura do cromossoma
MARs (matrix attachment regions) ou SARs (scaffold attachment regions)
Estruturas particulares dos
cromossomas lineares
Centrómeros
Telómeros
Principais estruturas do cromossoma
Classificação dos cromossomas em função da
localização do centrómero
Estrutura do centrómero de levedura
Point mutantions in the central CCG of
CDE3, completely inactivate the centromere
Mutations in CDE1 or CDE2 reduce
but do not inactivate centromere function
Proteins bind to yeast CDE elements
The centromere is identified by a
DNA sequence that binds specific proteins.
These proteins do not themselves bind to
microtubules but establish the site at which
the microtubule-binding proteins bind in turn.
Telomeres
Telomeres are required for the stability of the chromosome end
Telomeres are replicated by a special mechanism
Heterocromatina e eucromatina
Heterocromatina- geralmente mantém
estado de condensação durante o ciclo
celular. Heterocromatina facultativa vs constituitiva
Eucromatina- geralmente sofre
condensação e descondensação
durante o ciclo celular.
Position-effect variegation in Drosophila is a phenotypic effect
of facultative heterochromatin
A chromosomal rearrangement (inversion or translocation) silence w+ in some cells
and not others, produces a position-effect variegation
The heterochromatin can spread into de euchromatic regions, shutting off gene
expression of euchromatic genes localized in the vicinity of heterochromatin,
in those cells
Técnicas de coloração para produzir padrões de bandas
cromossómicos
Técnica
Padrão de bandas
G-banding
Bandas escuras são ricas em AT
Bandas claras em GC
Q-banding
Bandas escuras são ricas em GC
Bandas claras em AT
C-banding
Bandas escuras contêm
heterocromatina constituitiva
Padrões citogenéticos
Estrutura dos genes
e
Organização dos genes
Procariotas
Eucariotas
O que é um gene?
-Unidade de informação genética contida num segmento de DNA, logo é uma sequência de
nucleótidos. O produto final pode ser uma proteína ou um transcrito (ex. tRNA)
-Pode variar entre 75 pb e 2 300 000 pb
- A informação biológica está contida na sequência de nucleótidos e é
tornada disponível através da expressão genética, que é altamente REGULADA
Quaisquer 6 nts podem originar 4096 sequências diferentes (46)
Os genes estão organizados de diferentes modos
nos diferentes organismos
Operões: possível organização dos genes em
procariotas
• Alguns genes de procariotas estão organizados linearmente
sob o controlo da mesma região reguladora da transcrição
formando um OPERÃO
Regulação da expressão é coordenada
• Genes com funções relacionadas
• Ocorre em bactérias
DNA
Região
reguladora
lacZ
lacY
lacA
Estrutura de um gene eucariótico
Identificaram-se intrões nos genes de tRNAs e rRNAs de Archaea
Organização geral dos genes
Topografia dos genes em 4 organismos diferentes
13
11
8
3
Compactamento do genoma em organismos diferentes
Feature
Yeast
Fruit fly
Human
Gene density (average number per Mb)
479
76
11
Introns per gene (average)
0.04
3
9
Amount of the genome that is taken up
by genome-wide repeats
3.4%
12%
44%
Exemplos de organização, pouco usual, de genes
Genes que se sobrepõem
-Alguns vírus (ex, fago X174 de E. coli)
-Tradução dos mRNAs em diferentes grelhas
abertas de leitura
-Muito raro nos organismos superiores, mas
há exemplos nos genomas mitocondriais de
alguns animais e no Homem
Genes dentro de genes
- Frequente nos genomas nucleares
- Genes dentro de intrões de genes
Ex. no genoma humano o gene da
neurofibratose de tipo I, que contém três
pequenos genes (OGMP, EVI2B, EVI2A),
dentro do intrão 27
- Muitos snoRNAs são codificados por genes
dentro de intrões
DNA repetitivo
Equilibrium density gradient centrifugation of DNA
is also analytical useful , since the precise buoyant density
of the DNA (p) is a linear function of its G+C content
p= 1.66 + 0.098% (G+C)
DNA satélite no genoma humano
DNA fraccionado
em gradiente
de densidade
% G/C muito diferente nas bandas satélites, em relação à encontrada na banda principal
DNA repetitivo
Nota: existem outras sequências repetitivas para além das observadas no DNA satélite
Renaturação dos ácidos nucleicosnucleicos- Cot
Cot- Concentração em moles (Co) de nucleótidos, por litro, de determinada molécula de DNA,
e o tempo (t) de reacção.
O tempo de reassociação é proporcional à concentração
Set of Cot curves for various DNA samples
O componente que renatura
mais rapidamente no genoma
eucariótico é o
DNA altamente repetitivo
Influência do tipo de sequência de nucleótidos
nucleótidos,, no tempo de renaturação do DNA
A cinética de reassociação identifica dois tipos de sequências genómicas:
-DNA NÃO REPETITIVO (únicas) e DNA repetitivo (mais do que uma cópia), este subdividido em
MODERADAMENTE REPETITIVO e ALTAMENTE REPETITIVO
DNA repetitivo
(DNA altamente e moderadamente repetitivo)
vs
DNA cópia única
• DNA altamente repetitivo
– até 105 cópias/genoma
Ex. DNA satélite centromérico, SINEs, LINEs etc
• DNA moderadamente repetitivo
– 10 a 1000 cópias/genoma
Ex. famílias de genes relacionados (rRNAS, tRNAs, histonas, cinases
etc.),alguns transposões, mini e microsatélites etc.
Mini and microsatellites
• Minisatellites
usually few tens of nucleotides in length repeated in tandem
(repeating unit from 10 to 100 nts). Also called VNTR (variable
number of tandem repeats).
Ex. telomeric DNA
• Microsatellites
usually, di- tri- or tetranucleotides repeated 10-20 x in tandem
(repeating unit <10 pb).
Also called a simple tandem repeat (STR).
DNA repetitivo agrupado e disperso
Repetições agrupadas: micro- e minisatélites
Repetições dispersas: Lines, Sines, transposões e retrotransposões
Localização (mapeamento) de algumas sequências de DNA
(repetitivo agrupado) no cromossoma 1 humano
Estas sequências de DNA funcionam como marcadores genéticos
What is a genetic marker or DNA marker?
A distinctive feature of a genome map
ex.
- Any polymorphic mendelian character that can be used
to follow a chromosomal segment through a pedigree.
Genetic markers are usually DNA polymorphisms
- A gene carried by a cloning vector, that codes a distinctive protein and/or
phenotype and so can be used to determine if a cell contains a copy of the cloning
vector (we can follow plasmid transference)
DNA polymorphisms
• DNA polymorphisms are sequence variations at specific sites (loci), in noncoding regions of the genome. The precise sequence of DNA tends to
differ in unrelated individuals
• These polymorphisms when found in genes, accounting for the differences
in phenotype, are usually referred as mutations or variants
• DNA polymorphisms of a specific locus, as well as variants of a gene, are
alleles
VNTR detection by PCR
I
Ex: D1S80
VNTR detection by PCR
II
VNTR detection by PCR using multiple primers
Multiplex reaction
Composição dos ribossomas eucariótico e bacteriano
Gene families
Famílias Multigénicas Simples
ex. genes de rRNAs
Gene de rRNA 5S
1)
DNA intergénico
No Homem há 2000 cópias do gene que codifica rRNA 5S,em tandem no cromossoma 1
2) Gene de 45 S (28 S, 5.8 S, 18 S)
28 S 5.8 S 18 S
28 S 5.8 S 18 S
Cromossomas 13, 14, 15, 21, 22
28 S 5.8 S 18 S
X 50 – 70/
cromossoma
Gene families
Famílias Multigénicas Complexas
Agrupadas (clustered
(clustered or tandem
tandem))
Gene clusters de α- e β-globulina humana
Cromossoma 16
Cromossoma 11
Dispersas
Ex: genes da aldolase que se localizam nos cromossomas 2, 9, 10, 16, 17
Famílias Multigénicas
-
Simples e Agrupadas- várias cópias em tandem, de um mesmo gene, no mesmo cromossoma
(ex. rRNA 5S)
-
Simples e Dispersas- várias cópias de um mesmo gene em cromossomas diferentes (ex. gene
do RNA 45S (rRNA 15S, 23S, 5.8S))
-
Complexas e Agrupadas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função
semelhante,mas com algumas diferenças na sua sequência de aminoácidos, localizando-se
todos no memsmo cromossoma e com alguma proximidade (ex. α− e β−globulina)
-
Complexas e Dispersas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função
semelhante,mas com algumas diferenças na sua sequência de aminoácidos,, que se
encontram em cromossomas diferentes (ex. gene da aldolase)
Sequências de Inserção (IS) e transposões
Grande parte do DNA moderadamente repetitivo pertence a uma classe de elementos
ELEMENTOS MÓVEIS
São sequências de DNA móveis que se encontram no genoma de todos os organismos
Transpõem-se deixando cópias (daí o repetirem-se)
Podem já estar fixas ou ainda terem a capacidade de se transpôr
MECANISMO DE TRANSPOSIÇÃO
Não utiliza a maquinaria de recombinação homóloga da célula
e
Podem transpôr-se através de
intermediário deDNA (é o caso da maioria dos procariotas)
ou RNA (é o caso da maioria dos eucariotas)
inserindo-se em
sequências preferenciais ou sem sequência alvo
Será leccionado nas aulas de recombinação