Download Ames test

UJI MUTAGEN
(AMES TEST)
Marlia Singgih Wibowo
School of Pharmacy ITB
Pendahuluan
 Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawa
karsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV,
polutan industri, pestisida, food additives dan produk
tobacco
 Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin
hari semakin banyak digunakan, menjadi perhatian
utama peneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadap
kemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkan
oleh senyawa tersebut.
 Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker
karena mereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan
mutasi, yang dapat mengubah susunan DNA
MUTAGEN
 Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat
meningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi
(perubahan) dapat mempengaruhi reproduksi sel,
bahkan kadangkala menyebabkan kerusakan sel atau
pertumbuhan sel yang tidak terkendali
 Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawa kimia
mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll.
 Mutagenesis adalah proses pembentukan mutasi
Beda MUTAGEN dan KARSINOGEN
Karsinogen
menyebabkan KANKER
Mutagen menyebabkan MUTASI,
tidak selalu menyebabkan
KANKER
Uji senyawa karsinogen



Uji jangka pendek (short-term test) : dikembangkan
untuk mengidentifikasi senyawa karsinogenik yang
berpotensi atas dasar kapasitasnya untuk menginduksi
mutasi pada DNA di dalam sel secara in-vitro atau invivo. Contoh test : Ames test. Pada Ames test,
digunakan mikroba Salmonella typhimurium. Selain uji
mutasi bakteri, ada pula uji mutasi sel mamalia secara
in-vitro, uji mutasi gen secara in-vivo menggunakan
mencit, uji kerusakan DNA secara in-vitro.
Uji jangka menengah : uji kronis 1 tahun : Uji
menggunakan 50 ekor tikus
Uji jangka panjang : uji kronis 2 tahun : Multi stage
models pada perkembangan neoplasti
AMES Test
• Ames test adalah uji untuk menentukan apakah suatu
senyawa adalah mutagen. Nama test ini diambil dari
nama penemunya yaitu Bruce Ames. Bruce Ames dkk
pada tahun 1970an menemukan suatu metode uji
dengan menggunakan bakteri khusus yang sangat
sensitif terhadap senyawa2 mutagen
• Penggunaan Ames test adalah berdasarkan asumsi
bahwa setiap senyawa yang bersifat mutagenik terhadap
bakteri yang digunakan, dapat berubah menjadi
karsinogen yang dapat menyebabkan kanker
• The Food and Drug Administration (FDA) USA saat ini
menggunakan metode yg dikembangkan Ames untuk
menapis senyawa2 kimia secara cepat dan murah
• Walaupun demikian, pada kenyataannya, beberapa
senyawa yang menyebabkan kanker pada hewan
percobaan (misalnya dioksin) tidak menunjukkan positif
pada Ames test (atau kebalikannya)
Mikroba uji yang digunakan dalam Ames test adalah
Salmonella typhimurium galur MUTANT
Mengapa menggunakan galur mutan?
 Biakan induk (Wild-type) dari Salmonella typhimurium
dapat tumbuh dalam media tanpa penambahan asam
amino. Hal ini dimungkinkan karena mereka membuat
asam amino mereka sendiri dengan jalur biosintesis
yang berbeda2
 Pada mutan Salmonella typhimurium , tidak dapat
tumbuh tanpa asam amino histidin karena mutasi
ditujukan pada gen yang mengkode salah satu dari 9
enzim yang digunakan pada jalur biosintesis histidin
.
Oleh karena itu, mutan Ames hanya akan
tumbuh bila ada histidin di dalam medium
pertumbuhan karena mutan tersebut tidak
dapat mensintesis sendiri histidin tersebut.
Mutan ini adalah mutan auxotroph yang
disebut mutan histidine-dependent or his (baca : hiss-minus)
Mutan auxotroph
 Mutan auxotroph adalah mutan yang tidak dapat
mensintesis salah satu molekul organik yang diperlukan
untuk pertumbuhannya.
 Dalam uji ames, bila mutan auxotroph ini berinteraksi
dengan senyawa sample , lalu berubah menjadi
prototroph
 Mutan prototroph kembali memiliki kemampuan
mensintesis histidin, sehingga dapat tumbuh baik dalam
media tanpa histidin
Contoh Ames test untuk uji kualitatif
 Suatu suspensi biakan Salmonella
typhimurium galur histidinerequiring (his−) ditumbuhkan
dalam pelat agar yang
mengandung campuran rat liver
enzymes yang tidak mengandung
histidin
 Sebuah filter paper di impregnasi
dengan 10µg 2-aminofluorene,
suatu karsinogen. Efek mutagenik
senyawa ini dapat menyebabkan
bakteri tersebut memperoleh
kembali kemampuannya untuk
tumbuh walaupun di dalam media
tidak ada histidinnya. Hal ini
menyebabkan tumbuhnya koloni
bakteri disekitar disk filter paper.
Mengapa medium untuk Ames test
ditambahkan ekstrak hati (liver extract = S9)?
 Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen atau
karsinogen, tetapi dapat berubah menjadi mutagen atau
karsinogen setelah dimetabolisme di dalam tubuh (hati)
 Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, sedangkan
manusia adalah eukaryot, oleh karena itu perlu
ditambahkan campuran enzim2 hati organisme eukaryot
(dalam hal ini hati tikus)
Bagaimana menghitung hasil
Ames test ?
 Jumlah koloni bakteri yang tumbuh merupakan ukuran
aktivitas mutagenik (potensi) dari senyawa yang
digunakan
 Angka ini biasanya merepresentasikan jumlah revertants
(bakteri yang termutasi) per mikrogram of mutagen atau
per gram sampel yang mengandung mutagen
Koreksi terhadap hasil Ames test
 Pada umumnya mutasi spontan terjadi pada awal
pembiakan bakteri dalam medium yang tidak
mengandung histidin
 Hal ini perlu diperhitungkan sebelum menguji senyawa
kimia yang dianalisis.
 Pada awal pengujian ditumbuhkan 108 sel bakteri, maka
setelah beberapa waktu dihitung jumlah bakteri yang
tumbuh, dan angka ini digunakan untuk pengurangan
jumlah bakteri yang memang termutasi oleh senyawa
kimia.
 Dengan cawan petri terpisah, baru dilakukan uji mutagen
dengan menggunakan senyawa kimia yang diuji di
dalam media yang ditambahkan campuran enzim hati
tikus
 Biakan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama
48 jam di tempat gelap
 Jumlah koloni yang terbentuk menunjukkan revertans
yang terbentuk yang sebanding dengan potensi
senyawa mutagen
Galur mutan Salmonella typhimurium
 Galur mutan dari Salmonella typhimurium yang
digunakan dalam Ames test memiliki sensitivitas yang
berbeda-beda
 Galur TA 1535 memiliki satu substitusi basa yang
menyebabkan missense mutation di dalam gen yang
mengkode enzim pertama dalam sintesis histidin. Enzim
yang dimiliki mutan mengandung proline sementara
biakan induk mengandung leucine
 Galur TA 100 mirip dengan 1535, tetapi dapat
mendeteksi jenis-jenis mutagen yang berbeda
 Galur lain yang digunakan misalnya galur yang
mengalami mutasi yang berbeda-beda ( bisa frameshift,
missense atau nonsense), pada operon histidin
 Beberapa galur yang digunakan juga termutasi pada
uvrB, rfa , yang berakibat meningkatkan permeabilitas
sel terhadap senyawa kimia tertentu
PROSEDUR
Ekstrak homogenate rat liver (S9) dicampur dengan strain
dari bakteri his-. Dengan tidak adanya histidin, bakteri
tidak dapat tumbuh di dalam medium minimum (control).
Pada saat bakteri dicampur dengan bahan yang diduga
mutagen (X), terbentuknya revertant colonies
menunjukkan bahwa beberapa his- bacteria telah
termutasi (reverted) menjadi his+ dan dapat disimpulkan
bahwa senyawa X adalah suatu mutagen.
Gambar uji mutagen
 Jumlah koloni yang dihasilkan
setara dengan besarnya
efisiensi mutagen
mengembalikan sifat mutan ke
asalnya
 Suatu mutagen A menghasilkan
jumlah revertans yang lebih
tinggi dari kontrol, berarti
mutagen A adalah betul-betul
mutagen dan mungkin suatu
karsinogen.
 Suatu mutagen B tidak
menghasilkan jumlah revetans
lebih banyak dari kontrol, maka
dapat dikatakan bahwa
senyawa B bukanlah suatu
mutagen.
Interpretasi hasil
 A mutagenic potential of a test item is assumed if the
mutant frequency is 2.0 or higher. A dose effect
relationship could underline this conclusion.
 A possible mutagenic potential is assumed if the
quotient ranges between 1.7 to 1.9 in combination with
a dose effect relationship.
 No mutagenic potential is assumed if all quotients range
between 1.0 (or lower) to 1.6.
 A nonexistent dose effect relationship could underline
this conclusion
Mutagenicity Test
based on National Toxicology
Program - USA
Marlia Singgih Wibowo
School of Pharmacy ITB
Salmonella or E.coli test
 Menguji chemicals akan kemampuan mutagenicity pada
Salmonella typhimurium atau Escherichia coli dilakukan
berdasarkan anggapan bahwa senyawa yang bersifat
mutagenic pada bacteri tersebut, berpeluang menjadi
carcinogen pada hewan, dan selanjutnya kemungkinan
berpotensi pula menjadi penyebab kanker pada manusia
 Walaupun kira-kira ¾ senyawa kimia yang beredar saat
ini di dunia, menunjukkan reaksi positive pada Ames test
dan merupakan rodent carcinogens, namun tidak
semuanya menyebabkan kanker pada manusia
 Namun metode Ames test penting dilakukan untuk
skrining awal senyawa-senyawa yang akan digunakan
dalam pengobatan manusia.
Galur mikroba yang digunakan
 Beberapa strain S. typhimurium dapat
digunakan antara lain : TA97, TA98, TA100,
TA102, TA104, TA1535, TA1537, and TA1538.
 Escherichia coli strain WP2 uvrA pKM101 . This
E. coli strain is similar in mutagen detection to S.
typhimurium strain TA102
Mikroba uji (Prof.Lynn Ferguson, Univ.Auckland)
 This test can capture frame-shift mutagens
(through S. typhimurium strain TA98 and TA1537),
base-pair-substitution mutagens (through strain S.
typhimurium TA100) or mutagens which act
through the production of oxygen radicals (through
strain S. typhimurium TA102). We maintain
different strains of Salmonella typhimurium for this
assay and the test is carried out according to the
OECD guidelines for Testing of Chemicals No.471
(adopted since 21st July 1997).
 Seluruh bakteri yang digunakan dalam Ames
test membawa defective (mutant) gene yang
membuat nya tidak mampu mensintesis
essential amino acid histidine jadi mereka hanya
survive dan tumbuh pada medium yang
mengandung excess histidine.
 Dengan adanya mutagenic chemical, defective
histidine gene mampu termutasi balik sehingga
mampu mensintesis histidinnya kembali
 Efek ini, yang memperoleh kemampuannya
kembali (regaining of normal activity or function),
disebut "reverse" mutations dan process nya
disebut "reversion."
 Mutant colonies nya,disebut "revertants."
 Ada mutagenicity assay lain yang menggunakan
sel type yang lain yang mengukur "forward"
mutations, yaitu mutation yang memperbaiki
fungsi gene nya, yang tadinya tidak mampu
dilakukan (causes a loss, rather than a gain, of
function.)
Standard Procedure
(National Toxicology Program)
 In the Ames assay, a test tube containing a suspension
of one strain of Salmonella typhimurium (or E. coli) plus
S9 mix or plain buffer without S9, is incubated for 20
minutes at 37º C with the test chemical.
 Control cultures, with all the same ingredients except the
test chemical, are also incubated.
 In addition, positive control cultures are prepared; these
contain the particular bacterial tester strain under
investigation, the various culture ingredients, and a
known potent mutagen*.
 After 20 minutes, agar is added to the cultures and the
contents of the tubes are thoroughly mixed and poured
onto the surface of petri dishes containing standard
bacterial culture medium.
 The plates are incubated, and bacterial colonies
that do not require an excess of supplemental
histidine appear and grow. These colonies are
comprised of bacteria that have undergone
reverse mutation to restore function of the
histidine-manufacturing gene. The number of
colonies is usually counted after 2 days.
Mutasi spontan
 Spontaneous mutations (those that occur by chance, not
by chemical treatment) will appear as colonies on the
control petri dishes.
 If the test chemical was mutagenic to any particular
strain of bacterium, the number of histidine-independent
colonies arising on those plates will be significantly
greater than the corresponding control plates for that
strain of bacteria.
 The positive control plates are also counted, and the
number of mutant colonies appearing on them must be
significantly increased over the spontaneous control
number for the test to be considered valid.
 Failure of the positive control chemical to induce
mutation is reason to discard the experiment.
Interpretasi hasil
 Several doses (usually at least 5) of each test chemical and multiple
strains of bacteria are used in each experiment.
 In addition, cultures are set up with and without added liver S9
enzymes at varying concentrations.
 Therefore, a variety of culture conditions are employed to maximize
the opportunity to detect a mutagenic chemical.
 In analyzing the data, the pattern and the strength of the mutant
response are taken into account in determining the mutagenicity of a
chemical.
 All observed responses are verified in repeat tests. If no increase in
mutant colonies is seen after testing several strains under several
different culture conditions, the test chemical is considered to be
nonmutagenic in the Ames test.
Kontrol positif
For strains tested in the absence of S9







TA98, 2-nitrofluorene or alternatively,
TA98 and TA1538, 4-nitro-o-phenylenediamine
TA100 and TA1535, sodium azide
TA97 and TA1537, 9-aminoacridine
TA102, mitomycin C
TA104, methyl methanesulfonate
E.coli WP2 uvrA pKM101, methyl methanesulfonate
For strains tested with S9
 All strains, 2-aminoanthracene (or occasionally,
sterigmatocystin)
Reference
Mortelmans K, Zeiger E. The Ames
Salmonella/microsome mutagenicity
assay. Mutat Res. 2000 Nov 20;455
(1-2):29-60.
 Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is a heme
monooxygenase that is involved in the metabolic
activation of nitrosamines to electrophilic species that
can react with DNA, resulting in DNA damage and
mutation.1 CYP2E1 is also responsible for the oxidation
of many small lipophilic compounds, including many
solvents and environmental contaminants.2 This
enzyme is one of many cytochromes P450 found
primarily in the liver, but also in other tissues including
the lungs and kidneys. The enzyme is found on the
endoplasmic reticulum of the cell along with cytochrome
P450 reductase, its obligate electron donor protein.
 Nitrosamines have long been recognized as
carcinogens in mammals, but they have been
unexpectedly poor mutagens in bacterial
mutagenicity assays, such as the Ames test.3 A
variety of explanations have been put forward
over the years to explain this lack of correlation
between mutagenicity and carcinogenicity,
 In a standard Ames assay a rat liver
homogenate is used to provide the cytochromes
P450 necessary for activation of mutagens to
their reactive forms.
 The suspected mutagen is mixed with the
homogenate, where it is metabolized to its
reactive form, and then an appropriate tester
strain of Salmonella typhimurium is added to the
mix. The activated mutagen enters the
bacterium and reacts with DNA to cause
mutations; mutations in the operon for histidine
biosynthesis that restore function ("reversions")
allow the bacterium to grow on histidine-deficient
medium, and result in visible colonies on the
assay plate. The greater the number of
colonies, the more mutagenic the chemical.
Table 1. Ames test result for Coral
Numbers of revertants
Samples
Without S9
With S9
Negative control
(spontaneous reversion)
259
332
Positive control
(Sodium Azide 1 ppm)
857
949
Coral
170
243