Download 9 General discussion and future perspectives

9
General discussion and future
perspectives
CHAPTER 9
Introduction
Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent solid cancers in both men
and women in developed countries. Annually, 1.2 million cases are recorded
worldwide, and more than 600.000 patients die of this disease.1 While surgical
resection of the primary colorectal carcinoma is the preferred treatment, it has been
associated with higher risk for metastases development.2-4 Approximately 20-25%
of all patients already have metastatic disease upon diagnosis of CRC.5 However,
another ~10-25% of patients who do not have visible evidence of metastases at
the time of diagnosis and in whom the tumor is removed surgically, will develop
metastases within 5 years.6 This supports the presence of minimal residual disease
that grows out into metastases after surgery. The liver is the major target organ for
development of colorectal metastases, and accounts for ~70% of colorectal-related
deaths.7
Previously, it was demonstrated that peritoneal surgery resulted in vascular
damage in the liver that caused the exposure of sub-endothelial extracellular
matrix (ECM) proteins.4 These are ligands for adhesion molecules like integrins
that are expressed on the cells surface.8 Importantly, adhesion of tumor cells to
the exposed ECM was observed. This supported that performing surgery in the
abdominal cavity initiated systemic inflammatory responses, which enabled tumor
cell adhesion in the liver. Therefore, I investigated the relation between surgeryinduced inflammation and liver metastases development in more detail to gain
new insights in this phenomenon (chapter 2-6). Furthermore, in chapters 7 and
8 it is shown that surgery-induced liver metastases outgrowth can be prevented
with peri-operative monoclonal antibody therapy. The implications for future
perspectives are furthermore discussed in this chapter.
Role of integrin molecules in metastases development
Development of metastases is usually a highly inefficient process. Firstly, tumor
cells need to detach from the primary tumor by down regulating the expression of
adhesion molecules, and enter lymphatic or blood vessels. Secondly, disseminated
tumor cells have a limited life span when they are unable to adhere, and can be
rapidly cleared by the immune system. However, previous studies supported
that surgical trauma increased the risk of metastases development.9, 10 It was
demonstrated that animals undergoing laparotomy (opening of the peritoneal
cavity) developed more liver metastases compared to non-operated control
animals.4 Therefore, it was previously proposed that during surgery tumor cells
may be spilled from the primary tumor without the need of reduced expression
of adhesion molecules on cells surface.4 Because of high expression of adhesion
molecules on tumor cells and surgery-induced exposure of ECM proteins, to
which these cells adhere preferentially, metastases formation is increased. It was
demonstrated in animal models that blockade of integrins a2 or b1 prevented
tumor cell adhesion in the liver or peritoneal cavity, respectively, whereas a5
was not involved.2, 4 Importantly, when integrin a2 on tumor cells was blocked,
development of liver metastases was successfully prevented, supporting that
138
GENERAL DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES
integrin a2 was essential for tumor cell adherence. In chapter 2 we investigated
the expression of integrins a2, a5 and b1 in primary colorectal tumors and
correlated this with the survival of patients. In this retrospective study we found
that high expression of integrin a2 positively correlated with lower overall survival.
Moreover, patients with high integrin a2 expression in the primary tumor had
higher risk of metastases development. Unfortunately, this did not reach statistical
significance, which may be due to limited numbers of participating patients. In a
previous study higher expression levels of integrin a2 in colorectal liver metastases
was observed, compared to lung metastases.11 Therefore I speculate, the liver may
contain a specific composition of ECM proteins, which favors the adhesion of
tumor cells with high levels of a2 integrins expression. Adhesion of these cells may
result in formation of liver metastases. Alternatively, it is also possible that because
of high expression of integrin a2 tumor cells from colorectal cancers are able to
adhere easily in the first organ they pass, which is the liver, and grow out into
metastases. We did not find any correlation between integrins a5 or b1 expression
and patients’ survival. Previously, it was shown that blockade of integrin b1 was
not sufficient to prevent tumor cells adherence in the liver.4 Strikingly, tumor cells
adhesion to the peritoneal cavity was inhibited when cells were incubated with
antibody against integrin b1.2 Furthermore, it was demonstrated that high levels
of integrin a5 gave rise to kidney metastases formation.12 All these data indicate
that expression of specific integrins on tumor cells facilitate metastases formation
in different target organs.
Because expression of integrins on tumor cells mediates metastases formation,
blockade of integrins on tumor cells may represent an attractive therapeutic
strategy. However, resection of the primary tumor unavoidably introduces a
wound in the peritoneal cavity and the intestines. Wound healing is a process in
which the integrins also play a central role.13, 14 Thus, blockade of integrins on tumor
cells with the intention to prevent tumor cells adhesion, may impair wound healing
as well. Hampered wound healing may cause post-surgical anastomic leakage.
Since patients with anastomic leakage were shown to have serious complications
and poorer survival,15 I strongly caution against these therapies before extensive
research has been performed to prove safety of this approach.
Role of surgery-induced inflammation in development of liver metastases
Previous studies demonstrated that surgery caused the release of inflammatory
mediators, including reactive oxygen species (ROS).16-18 These compounds were
suggested to be involved in tumor development by facilitating tumor cells
adhesion.19 Incubation of endothelial monolayers with ROS for 12 hours was shown
to result in up-regulation of adhesion molecule expression on endothelial cells such
as endothelial-selectin (E-selectin), inter-cellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)
and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1).19 These adhesion molecules were
suggested to be involved in enhanced tumor cells adhesion to endothelial cells. In
chapter 3 we now demonstrate that incubation of endothelial monolayers with
comparable amounts of ROS resulted in damage of the monolayers. Subsequently,
139
9
CHAPTER 9
intercellular gaps were formed that led to exposure of sub-endothelial ECM
components to which tumor cells adhered preferably. Furthermore, we showed that
surgery led to impairment of liver vasculature both in experimental animal models
and in human liver samples. Treatment of animals with a ROS scavenger prevented
vascular damage. Importantly, when rats were treated with a ROS scavenger we
observed significantly less tumor cell adherence in the livers compared to rats that
were treated with the vehicle only. When liver resident macrophages, Kupffer cells
(KCs) were depleted, we also observed less tumor cells adhesion, suggesting that
KCs are involved in ROS production. Unfortunately, treatment with ROS scavenger
was not sufficient for prevention of metastases development. Previous studies
demonstrated that KCs recognize and kill malignant cells in a ROS dependent
manner.20, 21 Thus, scavenging of ROS during surgery likely acts as a double-edged
sword. First, surgery stimulates the production of ROS by KCs, which leads to
disruption of endothelial lining. This causes the exposure of sub-endothelial ECM
proteins to which circulating tumor cells bind preferably. Second, interruption of
ROS production and/or scavenging system may imbalance the tumor cell killing
by KCs, which also requires ROS. This may finally lead to outgrowth of metastases
from adhered tumor cells. Thus, overall scavenging of ROS may not have beneficial
clinical effects in prevention of liver metastases formation.
Role of bacterial products in metastases development
Resection of the primary colorectal tumor furthermore resulted in translocation
or spillage of bacterial products from the gut lumen to the peritoneal cavity.15,
22-26
Interestingly, patients with positive bacterial translocation or anastomic
leakage had poor clinical outcome.15, 24 Bacterial products are potent activators of
strong immune responses, which may be involved in mediating damage to liver
vasculature. This subsequently may lead to liver metastases formation. Because
in our experimental laparotomy model the intestines were not resected, the
additional effects of bacterial components on metastases formation were not
investigated. Therefore, we developed a second experimental colectomy model in
which a small part of the colon was removed surgically, that was followed by endto-end anastomosis (chapter 4). Smear samples were taken from the peritoneal
surface of the colon of rats undergoing colectomy at the begin and the end of the
surgical procedure. Bacterial outgrowth was significantly increased in the samples
that were taken from the anastomosis. Moreover, we observed decreased levels
of tight junction protein expression in the livers of rats that received colectomy,
compared with the livers of control rats or rats that underwent laparotomy.
Subsequently, enhanced numbers of adhered tumor cells were detected in the
livers of rats that underwent colectomy, compared to the livers of control rats or rats
from the laparotomy group. Importantly, rats from the colectomy group developed
significantly more liver metastases. Previous studies demonstrated that severity of
surgical trauma correlated with development of liver metastases development.27
Thus, one explanation might be that rats undergoing colectomy developed more
liver metastases because of higher extent of surgical trauma. However, in our
colectomy model we also found significantly increased bacterial contamination
140
GENERAL DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES
after surgery, which also is observed in patients. This may lead to systemic exposure
to bacterial products. Importantly, patients with bacterial translocation or anastomic
leakage after surgery had significantly shorter disease-free survival and lower overall
survival. Moreover, local and systemic recurrence rates were higher in patients
with anastomic leakage after surgery.15 This indicated that exposure to bacterial
components during surgery has a negative effect on long term clinical outcome.15, 24,
28
Therefore, we propose that enhanced tumor development in our colectomy model
is mainly caused by bacterial products that are released or spilled during resection
in the colon.
Bacterial products are potent initiators of inflammatory immune responses through
interacting with Toll-like receptors (TLRs). For instance, the bacterial outer membrane
component LPS is the main ligand for TLR4. This receptor is expressed by wide variety
type of immune cells such as polymorphonuclear cells (PMNs) and KCs.29 Previously,
it was demonstrated that abdominal surgery led to attraction of high numbers of
PMNs to the peritoneal cavity.30 Interestingly, depletion of PMNs prevented local
recurrence of tumors. Furthermore, it was demonstrated that incubation of PMNs
with mesothelial monolayers enhanced the expression of adhesion molecules on
mesothelial cells. These molecules mediated increased tumor cells adherence.31
Thus, these data suggested that PMNs might be involved in development of tumors.
Therefore, in chapter 5 we investigated the potential role of PMNs in initiation of
liver metastases development. In the livers of rats that had received laparotomy,
increased numbers of PMNs were observed, compared to the livers of control
rats. Moreover, the numbers of PMNs was further increased when rats underwent
colectomy. As we observed enhanced bacterial translocation in rats after colectomy
(see above), exposure to bacterial components likely led to sequestration of PMNs
in the liver. This is supported by previous studies that showed that LPS injection
resulted in accumulation of PMNs in the livers of mice.32, 33 Importantly, the numbers
of adhered tumor cells in the livers of rats either undergoing laparotomy of
colectomy were elevated as well, compared to control rats. This suggested a relation
between high numbers of PMNs and tumor cells adherence. As was demonstrated
previously,34 incubation of PMNs with LPS rapidly induced ROS release. In chapter 3
we observed that ROS had detrimental effects on endothelial monolayers. Therefore,
we investigated whether incubation of endothelial monolayers with PMNs and LPS
causes endothelial damage. When endothelial monolayers were incubated with
PMNs and LPS, formation of intercellular gaps were observed. This consequently
led to exposure of sub-endothelial ECM proteins, as we demonstrated in chapter 3.
Furthermore, injection of rats with LPS resulted in high numbers of both PMNs and
tumor cells in their livers. This suggested that LPS led to significant attraction of PMNs
to the liver that subsequently caused damage to the liver vasculature, resulting in
increased tumor cell adhesion. Importantly, both PMN and tumor cell accumulation
that was caused either by laparotomy or LPS administration (without surgery) was
prevented when rats were treated with a ROS scavenger. Thus, these data suggested
that activation of PMNs by LPS led to ROS production, which subsequently caused
damage to the liver vasculature and facilitated tumor cell adhesion.
141
9
CHAPTER 9
Additionally, it was shown that LPS activates KCs.35 Furthermore, previously it was
suggested that macrophages play a role in liver metastases development.21 Therefore,
we evaluated the involvement of KCs in initiation of metastases development (chapter
6). When rats were injected with LPS (in the absence of surgery), tumor cell adherence in
the livers was ameliorated significantly, compared to the livers of rats that were injected
with saline. A previous study suggested that LPS increased the expression of adhesion
molecules on tumor cells.36 Therefore, we tested whether LPS influenced tumor cells
adhesion to either different ECM coatings or endothelial layers. Incubation of tumor cells
with varying concentrations of LPS for different time points, did not affect the adherence
of tumor cells on various ECM coatings (data not shown). Moreover, incubation of tumor
cells or endothelial monolayers with LPS did not enhance tumor cell adherence to
endothelial layers. These data indicated that tumor cell adhesion that was increased by
LPS injection of rats was not caused by enhanced or altered adhesion to the endothelial
lining.
KCs are however in close proximity of sinusoidal endothelial cells.37 Interaction of LPS
with its receptor on KCs was furthermore shown to induce the release of inflammatory
mediators including ROS.29, 35, 38 Subsequently, release of ROS by KCs may be harmful for
the integrity of liver vasculature. Therefore, we tested the effect of LPS to co-cultures
of endothelial cells and macrophages. We found that addition of LPS had detrimental
effects on endothelial monolayers and caused intercellular gaps formation. Moreover,
endothelial damage was prevented when ROS scavengers were added. This indicated
that tumor cell adherence that was enhanced by LPS injection was due to damaged liver
vascular lining. Importantly, depletion of KCs or using a ROS scavenger in vivo significantly
reverted tumor cell adherence that was enhanced by LPS injection. Thus, LPS-mediated
tumor cells adherence is ROS dependent and KCs play an important role in this process.
In chapter 5 we observed that the highest numbers of tumor cells had adhered
after 1.5 hours following laparotomy, while the numbers of PMNs was maximal after
6 hours. This suggested that tumor cells adherence might be PMNs independent.
Because we found that KCs play a pivotal role in tumor cells adherence, we studied
whether KCs are involved in accumulation of PMNs and tumor cells after laparotomy
or LPS injection. Interestingly, the livers of rats in which KCs were depleted contained
significantly less PMNs and tumor cells after laparotomy or LPS injection (Figure 1).
Thus, KCs play a regulatory role in sequestration of PMNs and tumor cells in the liver.
Therefore I hypothesize that activation of KCs results in release of ROS, which damages
the liver vasculature. Subsequently, sub-endothelial ECM is exposed to which both
PMNs and tumor cells adhere in high numbers (Figure 2). Additionally, as soon as PMNs
are adhered and activated they may also release ROS and exacerbate liver vasculature
damage. Our data are supported by a previous study, which demonstrated that PMNs
sequestration in the liver during inflammation is diminished when KCs were depleted
or non-functional.39 Furthermore, it was demonstrated that increased binding of
PMNs in the liver vasculature after LPS treatment was due to altered interaction with
ECM.33 The authors speculated that LPS-induced ROS production led to modification
to ECM in the liver that facilitated the increased PMNs adherence.
142
0
+
o
n
tr
L ole
P
S
d
e
p
+ let
L ed
P
S
0.5
0
s
C
u
s
+
K
C
u
s
K
+
o
n
rg tr
e ol
ry
C
s
d
+ ep
su l e
rg te
er d
y
0
1.0
20
C
0
1.5
40
C
5
2.0
K
0.25
TCs
o
n
tr
L ole
P
S
s
d
e
p
+ let
L ed
P
S
10
PMNs
+
0.50
60
C
15
2.5
***
C
0.75
***
80
K
20
# His48+ cells per 145 mm2
25
B
1.00
# TCs per 145 mm2
***
*
o
n
rg tr
e ol
ry
C
s
d
+ ep
su l e
rg te
er d
y
# His48+ cells per 145 mm2
A
# TCs per 145 mm2
GENERAL DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES
Figure 1: KCs regulate the accumulation of PMNs and tumor cells in the liver. a: the numbers of PMNs
and tumor cells in the liver of control and KCs depleted rats after laparotomy. b: PMNs and tumor cells
in the livers of control or KCs depleted rats, that were treated with saline or LPS. green=His48+ cells;
blue=cell nudei. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
Antibody therapy
Thus, surgery leads to undirected activation of KCs resulting in undesired damage
of liver vasculature and increased tumor cell adhesion. However, directed activation
of KCs that specifically target tumor cells was suggested to be advantageous in
prevention of liver metastases development.40 Anti-tumor immune responses
can be stimulated with the use of monoclonal antibodies (mAb). Previously it was
demonstrated that mAbs may reduce tumor growth directly by inhibiting tumor cell
proliferation, induction of programmed cell death (apoptosis) or sensitizing tumor
cells for chemotherapy.41 Alternatively, mAbs may also control tumor progression
indirectly by involving the immune system. One of the indirect mechanisms is
complement dependent cytotoxicity (CDC).42 In this process, mAb binding to
antigens activates molecules of the classic complement pathway, resulting in
perforation of the cell membrane, leading to cell death. Additionally, mAb can form
a bridge between tumor cells and Fc receptor-expressing immune cells, which can
lead to lysis of tumor cells via a process referred to as antibody-dependent cellular
cytotoxicity (ADCC).43 Traditionally, natural killer (NK) cells have been considered
as main effector cells for ADCC.44 After formation of immune synapses between the
mAb-opsonized target cells and NK cells, target cells are eliminated by directed
release of cytotoxic compounds from NK cells.
Alternatively, a role for macrophages was proposed in tumor targeting
antibody immunotherapy. A previous study demonstrated that liver metastases
development was successfully prevented by mAb treatment, which was dependent
on the presence of either FcgRI or FcgRIV.45 Since monocytes/ macrophages are the
only cells that express both receptors in mice, a role for these cells was strongly
supported. Recognition of mAb-coated target cells by macrophages or monocytes
leads to phagocytosis and subsequent degradation in a process that is referred as
antibody-dependent phagocytosis (ADPh).46
143
9
CHAPTER 9
Before
KCs
Endothelial cells
Hepatocytes
After
PMNs
Tumor cells
ROS
ECM
LPS
Figure 2: Schematic overview of the liver microvasculature before and after surgery. Surgery-released
factor(s) such as LPS cause the initiation of systemic immune responses that result in activation of the
liver resident macrophages, KCs. Activated KCs release ROS that damages the sinusoidal endothelial
cells and leads to exposure of sub-endothelial extracellular matrix (ECM) proteins. Circulating PMNs
and tumor cells preferably adhere to exposed ECM. Additionally, adhered PMNs can produce ROS as
well, and may exacerbate the damage to the sinusoidal microvasculature, stimulating the adherence of
tumor cells that grow out in liver metastases.
144
GENERAL DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES
In a previous study, co-localization of tumor cells and KCs in the liver was observed.46
Interestingly, treatment with mAb in vivo increased co-localization with 14%.
Nonetheless, even though mAb therapy only marginally increased co-localization
of tumor cells and KCs, massive impact on survival was observed, as mAb treated
animals did not develop liver metastases, in contrast to isotype-treated controls.45,
46
Since depletion of KCs was shown to abolish the anti-tumoral effects of mAbs,
an essential role for KCs in tumor prevention was proposed.45, 46 However, the
exact mechanism of how KCs are involved in mAb-mediated prevention of tumor
development remained unknown. To understand these results and investigate
the mechanisms of effective mAb therapy in more detail, we therefore performed
intravital microscopy (in chapter 7). Kupffer cells were able to sample small parts of
tumor cells when mice were treated with PBS or an isotype control, but phagocytosis
of whole tumor cells was limited. Still, these results explained why co-localization
between Kupffer cells and tumor cells was observed with immunohistochemistry
experiments. By contrast, Kupffer cells phagocytosed complete tumor cells rapidly
when mice were treated with tumor specific mAb. Thus, although no difference
was observed in the numbers of tumor cells that were in contact with KCs, a
significantly increased number of tumor cells were ingested by KCs of mice that had
been treated with specific anti-tumor mAb. Furthermore, the fate of tumor cells 24
hours after injection was investigated. Although red fluorescent dye was still visible
(indicative of tumor material), particles were significantly smaller in mAb-treated
mice, supporting breakdown inside macrophages. 3D reconstruction confirmed
that tumor cells in the livers of untreated mice poorly co-localized with Kupffer
cells. Furthermore, large clusters of tumor cells were observed, which supports
outgrowth. In contrast, most tumor material was encapsulated by Kupffer cells in
mAb-treated animals, indicating effective degradation of tumor cells.
Recently, mice were injected with tumor cells and mAb against tumor cells in the
peritoneal cavity.47 After peritoneal lavage, interactions between cells were studied
microscopically. Interestingly, formation of immune synapses between tumor
cells and immune cells after mAb treatment was demonstrated, suggesting the
elimination of tumor cells via ADCC.48 In contrast, we observed the liver of mice
constantly after injection of tumor cells with an intravital microscope. We found
that treatment with mAb led to effective uptake of tumor cells by KCs through
ADPh within minutes after injection. Moreover, depletion of KCs abrogated mAbmediated anti-tumoral response. This strongly indicated that mAbs therapy leads
to ADPh in the liver and KCs are the main effector cells in this process.
Importantly, previous studies demonstrated the presence of circulating tumor cells
in peripheral blood of colorectal cancer patients.49-56 Moreover, the numbers of
circulating tumor cells were increased during or after surgery, especially in portal
blood, suggesting the dissemination of tumor cells by surgical manipulation.
Increased numbers of circulating tumor cells furthermore correlated with
poor patient prognosis.57, 58 Thus peri-operative mAb treatment may eliminate
disseminated tumor cells. Successful mAb therapy however depends on the
145
9
CHAPTER 9
expression of an (specific) antigen by tumor cells. Epidermal growth factor receptor
(EGFR) is up regulated in 60-80% of colorectal cancer cases and was therefore
suggested as a potential target for mAb therapy.59 The anti-EGFR mAb Cetuximab
is an antibody that is already approved for clinical use. It was demonstrated that
binding of Cetuximab to EGFR prevented cell proliferation and therefore inhibited
tumor progression.60 However, in patients with established colorectal tumors
Cetuximab treatment resulted in disappointing response rates of 11% that were
increased to 23% when mAb therapy was combined with chemotherapy.59 Previous
studies suggested that therapeutic actions of Cetuximab was mainly dependent
on the RAS/RAF signaling cascade.60, 61 Interference with RAS/RAF signaling results
in disruption of several processes such as cell cycle progress and apoptosis, which
finally prevents tumor growth.60 Mutational changes in these proteins impair the
response to anti-EGFR mAb therapy, which is likely the cause of disappointing
clinical results. However, anti-EGFR mAb may be used successfully in patients with
colorectal tumors who undergo surgical resection of the tumor, as binding of mAbs
to EGFR on circulating tumor cells may result in phagocytosis by macrophages.
In chapter 8, we demonstrate that incubation of tumor cells with a mAb against
EGFR (Zatulumumab) effectively enhanced tumor cell phagocytosis and killing by
macrophages. This was only dependent on surface expression of EGFR on malignant
cells. Importantly, cell lines with mutated proteins of RAS or RAF were also efficiently
phagocytosed and killed. Subsequently, after phagocytosis, lysosomal fusion with
the phagosome led to cancer cell degradation. Thus, anti-EGFR mAbs may be
used successfully for prevention of surgery-induced liver metastases. Importantly,
mutations of cell signaling proteins do not affect this process. As we showed in
animal models, surgery-induced liver metastasis is successfully prevented by mAbs
that target tumor specific antigens. Therefore, I propose that clinical studies must
be implemented as soon as possible to investigate this in patients.
Conclusions
In this thesis I show that surgery-induced inflammation and/or bacterial products
that are spilled during surgery cause the activation of KCs. Activated KCs release
the inflammatory mediator ROS that damages the sinusoidal endothelial lining
and disrupts liver microvasculature. Subsequently, this leads to exposure of subendothelial ECM proteins. Circulating tumor cells and PMNs adhere to exposed
ECM via their adhesion molecules like integrin proteins (Figure 2). However,
experimental therapy using an anti-oxidant to prevent metastases formation
was not successful. This may be due to interference with ROS dependent tumor
cell killing by macrophages. Importantly, injection of tumor specific mAb led to
effective phagocytosis of tumor cells by KCs and therefore was sufficient for
prevention of liver metastases formation.
Future perspectives and recommendations
Detailed knowledge of inflammatory responses that occur in the period during and
immediately after surgery is pivotal for development of new therapeutic strategies
to prevent metastases development. We demonstrated that abdominal surgery
146
GENERAL DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES
and the bacterial component LPS – is spilled during surgery - stimulated tumor cell
adhesion. Thus, improvement of surgical techniques to minimize surgical trauma,
bacterial translocation and spillage of tumor cells may improve patients’ outcome.
However, surgical resection of the primary colorectal tumor inevitably leads to
tissue damage. Therefore, additional therapies are required to prevent surgeryinduced inflammatory responses. For instance, prevention of the interaction
between LPS and its receptor TLR4 on immune cells may avoid undesired activation
of macrophages that facilitates tumor cell adherence. Effects of LPS scavengers or
TLR4 antagonists on tumor cells adherence should be investigated in more detail.
Furthermore, spillage of bacteria may also result in enhanced concentration of
other bacterial components such as lipoproteins, lipopeptides or flagellin. Each of
these bacterial components can trigger different TLRs such as TLR1, 2, 5 and 6 and
initiate similar potent immune responses, compared to TLR4.29 To find out which
bacterial product(s) or TLRs are involved in enhanced tumor cells adhesion, animals
with specific knock outs of these receptors or TLR signaling pathway proteins
may be used. Detailed knowledge about the role of bacterial products in tumor
development may serve to design novel targeted therapies. Moreover, clinical
studies can be performed investigating whether selective decontamination of the
digestive tract, eliminating the bacterial presence in the intestines, may prevent
recurrence of local or distant metastases.
Furthermore, we demonstrated that undirected activation of KCs during surgery
facilitated tumor cell adhesion. However, we also showed that KCs are the most
important effector immune cells in mAb therapy against circulating tumor cells.
Thus, directed activation of KCs may improve their anti-tumoral actions and
prevent tumor formation. Therefore, I hypothesize that pre- or peri-operatively
administration of mAbs against tumor antigens, which induce efficient ADPh, will
inhibit metastases development. Clinical studies should be executed to investigate
the effects of mAbs on surgery-induced liver metastases development.
9
147
CHAPTER 9
Reference list
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
148
Jemal,A. et al. Global cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
Oosterling,S.J. et al. Anti-beta1 integrin antibody reduces surgery-induced adhesion of colon carcinoma
cells to traumatized peritoneal surfaces. Ann. Surg. 247, 85-94 (2008).
ten Raa,S. et al. Surgery promotes implantation of disseminated tumor cells, but does not increase growth
of tumor cell clusters. J. Surg. Oncol. 92, 124-129 (2005).
van der Bij,G.J. et al. Blocking alpha2 integrins on rat CC531s colon carcinoma cells prevents operation-induced augmentation of liver metastases outgrowth. Hepatology 47, 532-543 (2008).
Sutcliffe,R.P. & Bhattacharya,S. Colorectal liver metastases. Br. Med. Bull. 99, 107-124 (2011).
Bird,N.C., Mangnall,D., & et al Biology of colorectal liver metastases: A review. J. Surg. Oncol. 94, 68-80
(2006).
Garcia-Foncillas,J. & az-Rubio,E. Progress in metastatic colorectal cancer: growing role of cetuximab to
optimize clinical outcome. Clin. Transl. Oncol. 12, 533-542 (2010).
Barczyk,M., Carracedo,S., & Gullberg,D. Integrins. Cell Tissue Res. 339, 269-280 (2010).
Coffey,J.C. et al. Excisional surgery for cancer cure: therapy at a cost. Lancet Oncol. 4, 760-768 (2003).
Georges,C., Lo,T., Alkofer,B., Whelan,R., & Allendorf,J. The effects of surgical trauma on colorectal liver
metastasis. Surg. Endosc. 21, 1817-1819 (2007).
Yoshimura,K. et al. Integrin alpha2 mediates selective metastasis to the liver. Cancer Res. 69, 7320-7328
(2009).
Tani,N. et al. Expression level of integrin alpha 5 on tumour cells affects the rate of metastasis to the kidney. Br. J. Cancer 88, 327-333 (2003).
Grose,R. et al. A crucial role of beta 1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous
wound repair. Development 129, 2303-2315 (2002).
Watt,F.M. & Fujiwara,H. Cell-extracellular matrix interactions in normal and diseased skin. Cold Spring Harb.
Perspect. Biol. 3, (2011).
Law,W.L., Choi,H.K., Lee,Y.M., Ho,J.W., & Seto,C.L. Anastomotic leakage is associated with poor long-term
outcome in patients after curative colorectal resection for malignancy. J. Gastrointest. Surg. 11, 8-15 (2007).
Fricova,J., Stopka,P., Krizova,J., Yamamotova,A., & Rokyta,R. The effect of laparotomy on hydroxyl radicals,
singlet oxygen and antioxidants measured by EPR method in the tails of rats. Neuro. Endocrinol. Lett. 30,
373-376 (2009).
Ni,C.N. & Redmond,H.P. Cell response to surgery. Arch. Surg. 141, 1132-1140 (2006).
Ure,B.M. et al. Peritoneal, systemic, and distant organ inflammatory responses are reduced by a laparoscopic approach and carbon dioxide versus air. Surg. Endosc. 16, 836-842 (2002).
ten Kate M. et al. The role of superoxide anions in the development of distant tumour recurrence. Br. J.
Cancer 95, 1497-1503 (2006).
Fang,F.C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nat. Rev. Microbiol. 2, 820-832 (2004).
Heuff,G. et al. Macrophage populations in different stages of induced hepatic metastases in rats: an immunohistochemical analysis. Scand. J. Immunol. 38, 10-16 (1993).
Buttenschoen,K. et al. Endotoxemia and acute-phase proteins in major abdominal surgery. Am. J. Surg.
181, 36-43 (2001).
Buttenschoen,K. et al. Effect of major abdominal surgery on endotoxin release and expression of Toll-like
receptors 2/4. Langenbecks Arch. Surg. 394, 293-302 (2009).
Chin,K.F., Kallam,R., O’Boyle,C., & MacFie,J. Bacterial translocation may influence the long-term survival in
colorectal cancer patients. Dis. Colon Rectum 50, 323-330 (2007).
Koratzanis,G., Giamarellos-Bourboulis,E.J., Papalambros,E., & Giamarellou,H. Bacterial translocation
following intrabdominal surgery. Any influence of antimicrobial prophylaxis? Int. J. Antimicrob. Agents 20,
457-460 (2002).
Reddy,B.S. et al. Commensal bacteria do translocate across the intestinal barrier in surgical patients. Clin.
Nutr. 26, 208-215 (2007).
Mutter,D. et al. Increased tumor growth and spread after laparoscopy vs laparotomy: influence of tumor
manipulation in a rat model. Surg. Endosc. 13, 365-370 (1999).
Lin,J.K. et al. The influence of fecal diversion and anastomotic leakage on survival after resection of rectal
cancer. J. Gastrointest. Surg. 15, 2251-2261 (2011).
Kawai,T. & Akira,S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 11, 373-384 (2010).
van den Tol,M.P. et al. The post-surgical inflammatory response provokes enhanced tumour recurrence: a
crucial role for neutrophils. Dig. Surg. 24, 388-394 (2007).
van Grevenstein,W.M. et al. Surgery-derived reactive oxygen species produced by polymorphonuclear
GENERAL DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES
Reference list
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
leukocytes promote tumor recurrence: studies in an in vitro model. J. Surg. Res. 140, 115-120 (2007).
Ramaiah,S.K. & Jaeschke,H. Role of neutrophils in the pathogenesis of acute inflammatory liver injury.
Toxicol. Pathol. 35, 757-766 (2007).
McDonald,B. et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil
sequestration in inflamed liver sinusoids. J. Exp. Med. 205, 915-927 (2008).
Gomes,N.E. et al. Lipopolysaccharide-induced expression of cell surface receptors and cell activation of
neutrophils and monocytes in whole human blood. Braz. J. Med. Biol. Res. 43, 853-858 (2010).
Su,G.L. et al. Kupffer cell activation by lipopolysaccharide in rats: role for lipopolysaccharide binding
protein and toll-like receptor 4. Hepatology 31, 932-936 (2000).
Hsu,R.Y. et al. LPS-induced TLR4 signaling in human colorectal cancer cells increases beta1 integrin-mediated cell adhesion and liver metastasis. Cancer Res. 71, 1989-1998 (2011).
Dancygier,H. Microscopic Anatomy 2010).
Spolarics,Z. Endotoxemia, pentose cycle, and the oxidant/antioxidant balance in the hepatic sinusoid. J.
Leukoc. Biol. 63, 534-541 (1998).
Knudsen,E., Benestad,H.B., Seierstad,T., & Iversen,P.O. Macrophages in spleen and liver direct the migration pattern of rat neutrophils during inflammation. Eur. J. Haematol. 73, 109-122 (2004).
van der Bij,G.J. et al. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in
patients with colorectal cancer. Ann. Surg. 249, 727-734 (2009).
Clynes,R. Antitumor antibodies in the treatment of cancer: Fc receptors link opsonic antibody with
cellular immunity. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 20, 585-612 (2006).
Ferris,R.L., Jaffee,E.M., & Ferrone,S. Tumor antigen-targeted, monoclonal antibody-based immunotherapy: clinical response, cellular immunity, and immunoescape. J. Clin. Oncol. 28, 4390-4399 (2010).
Clynes,R., Takechi,Y., Moroi,Y., Houghton,A., & Ravetch,J.V. Fc receptors are required in passive and active
immunity to melanoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95, 652-656 (1998).
Alderson,K.L. & Sondel,P.M. Clinical Cancer Therapy by NK Cells via Antibody-Dependent Cell-Mediated
Cytotoxicity. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 379123 (2011).
Otten,M.A. et al. Experimental antibody therapy of liver metastases reveals functional redundancy
between Fc gammaRI and Fc gammaRIV. J. Immunol. 181, 6829-6836 (2008).
van der Bij,G.J. et al. Experimentally induced liver metastases from colorectal cancer can be prevented by
mononuclear phagocyte-mediated monoclonal antibody therapy. J. Hepatol. 53, 677-685 (2010).
Dustin,M.L. & Long,E.O. Cytotoxic immunological synapses. Immunol. Rev. 235, 24-34 (2010).
Hubert,P. et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity synapses form in mice during tumor-specific antibody immunotherapy. Cancer Res.(2011).
Gervasoni,A. et al. Comparison of three distinct methods for the detection of circulating tumor cells in
colorectal cancer patients. Oncol. Rep. 25, 1669-1703 (2011).
Koch,M. et al. Hematogenous tumor cell dissemination during colonoscopy for colorectal cancer. Surg.
Endosc. 18, 587-591 (2004).
Koch,M. et al. Detection of hematogenous tumor cell dissemination predicts tumor relapse in patients
undergoing surgical resection of colorectal liver metastases. Ann. Surg. 241, 199-205 (2005).
Weitz,J. et al. Detection of disseminated colorectal cancer cells in lymph nodes, blood and bone marrow.
Clin. Cancer Res. 5, 1830-1836 (1999).
Wind,J. et al. Circulating tumour cells during laparoscopic and open surgery for primary colonic cancer in
portal and peripheral blood. Eur. J. Surg. Oncol. 35, 942-950 (2009).
Tien,Y.W., Lee,P.H., Wang,S.M., Hsu,S.M., & Chang,K.J. Simultaneous detection of colonic epithelial cells in
portal venous and peripheral blood during colorectal cancer surgery. Dis. Colon Rectum 45, 23-29 (2002).
Yamaguchi,K., Takagi,Y., Aoki,S., Futamura,M., & Saji,S. Significant detection of circulating cancer cells in
the blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction during colorectal cancer resection. Ann.
Surg. 232, 58-65 (2000).
Conzelmann,M., Linnemann,U., & Berger,M.R. Detection of disseminated tumour cells in the liver of
colorectal cancer patients. Eur. J. Surg. Oncol. 31, 38-44 (2005).
Fujita,S., Kudo,N., Akasu,T., & Moriya,Y. Detection of cytokeratin 19 and 20 mRNA in peripheral and
mesenteric blood from colorectal cancer patients and their prognosis. Int. J. Colorectal Dis. 16, 141-146
(2001).
Rahbari,N.N. et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis
in patients with colorectal cancer. Gastroenterology 138, 1714-1726 (2010).
Cunningham,D. et al. Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory
metastatic colorectal cancer. N. Engl. J. Med. 351, 337-345 (2004).
Banerjee,S. & Flores-Rozas,H. Monoclonal antibodies for targeted therapy in colorectal cancer. Cancer
Biol. Ther. 9, 563-571 (2010).
149
9
CHAPTER 9
Reference list
150
61.
Benvenuti,S. et al. Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response
of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies.
Cancer Res. 67, 2643-2648 (2007).
Appendices
A. Dutch summary/ Nederlandse samenvatting
B. Acknowledgements/ Dankbetuiging
CHAPTER 9
Nederlandse samenvatting
Tumoren in de dikke darm en de endeldarm, ook wel colorectal tumoren genoemd,
zijn één van de meest voorkomende gezwellen bij mannen en vrouwen in Westerse
landen. Wereldwijd worden jaarlijks 1,2 miljoen mensen met deze vorm van kanker
gediagnosticeerd en meer dan 600.000 patiënten overlijden aan de gevolgen ervan.
Operatief verwijderen van het gezwel geeft naar de huidige maatstaven de beste
kansen voor overleving. Helaas brengt deze methode een verhoogd risico met zich
mee dat de tumorresten zich verspreiden naar andere organen waar ze uitgroeien
tot nieuwe tumoren, uitzaaiingen, metastases of secundaire tumoren genoemd.
Bij ~25% van de patiënten die geen zichtbare uitzaaiingen hadden ten tijde van
de operatieve verwijdering van de primaire, de oorspronkelijke tumor vindt men
alsnog binnen vijf jaar uitzaaiingen in organen zoals de lever. Uitzaaiingen naar de
lever worden het vaakst gevonden in het geval van een primaire colorectale tumor
en dat leidt in ~70% van de gevallen tot het overlijden van de patiënt. Om deze
patiënten te kunnen helpen, is het noodzakelijk om te begrijpen wat de relatie is
tussen het ontstaan van levermetastasen en de chirurgie die nodig is voor operatief
verwijderen van de primaire tumor.
Eerdere studies hebben aangetoond dat een groot deel van de patiënten met
colorectale tumoren vrije tumorcellen in het bloed hebben. Dit kan toenemen
tijdens het operatief verwijderen van de tumor, omdat tumorcellen kunnen
losraken en in het bloed terecht kunnen komen. Tumorcellen hebben specifieke
aanhechtingsmoleculen op hun oppervlak. Dit zijn eiwitmoleculen die zich
aan bindweefsel kunnen binden. Daarmee kunnen de vrije tumorcellen in
de lever aanhechten en uitgroeien tot levermetastasen. In mijn onderzoek
heb ik mij geconcentreerd op een specifieke soort aanhechtingsmoleculen,
die integrines worden genoemd. Integrines zijn een grote groep aan elkaar
verwante membraaneiwitten, bestaande uit 18 α en 8 β subunits. Onderzoek in
proefdiermodellen heeft aangetoond dat de ontwikkeling van levermetastases
kan worden geremd wanneer ervoor gezorgd wordt dat een van de integrines,
integrine α2, niet aan het bindweefsel kan binden. Dit suggereert dat integrines
een belangrijke rol spelen in het ontstaan van uitzaaiingen. In hoofdstuk 2 hebben
we in tumorbiopten van patiënten de relatie tussen verschillende integrines en het
ontstaan van metastases onderzocht. Onze resultaten laten zien dat de prognose
van patiënten afhankelijk is van de hoeveelheid integrine α2 op het oppervlak
van de tumorcellen. Hoe meer integrine α2 wordt aangetroffen, hoe slechter
de prognose is, zelfs als de primaire tumor operatief verwijderd is. De patiënten
met hoge integrine α2 expressie in de primaire tumor hadden meer uitzaaiingen
die zich hoofdzakelijk in de lever manifesteerden. Concluderend kunnen we dus
zeggen dat uitgroei van levermetastases afhankelijk is van integrine α2 expressie
op het oppervlak van tumorcellen van de primaire tumor
Vervolgens hebben we onderzocht hoe het komt dat tumorcellen na operatie juist
in de lever aanhechten (hoofdstuk 3). Met behulp van een experimenteel diermodel
152
APPENDICES
hebben we aangetoond dat zuurstofradicalen na operatie de bloedvaten van
de lever beschadigen waardoor het onderliggende bindweefsel bloot komt te
liggen (figuur 1). Dit biedt de circulerende tumorcellen de gelegenheid om zich
beter en sneller te hechten. De zuurstofradicalen kunnen door geactiveerde
immuuncellen, zoals macrofagen, worden uitgescheiden. Om te testen wat het
effect is van neutralisatie van zuurstofradicalen op tumorcel aanhechting, hebben
we de ratten voor de operatie behandeld met een antioxidant. Dit is een stof die
de zuurstofradicalen neutraliseert, waardoor ze onschadelijk zijn. De levers van
ratten die behandeld waren met antioxidant bevatten minder tumorcellen dan
de levers van de onbehandelde controleratten. Nader onderzoek wees uit dat het
vaatbed van de levers van de ratten die waren behandeld met antioxidant intact
was gebleven. Dus, operatie leidt tot vrijkomen van zuurstofradicalen die het
levervaatbed beschadigen waardoor tumorcelaanhechting wordt gestimuleerd.
Voor de operatie
Na de operatie
tumorcel
integrin
bindweefsel
endotheelcellen
Figuur 1: levervaatbed voor operatie en na operatie. Zonder operatie is het vaatbed intact. Tumorcellen
kunnen moeilijk aanhechten en kunnen dus niet uitgroeien tot metastases. Door operatie raakt het
levervaatbed beschadigd waardoor het bindweefsel toegankelijker wordt voor de circulerende
tumorcellen. Hierdoor kunnen de tumorcellen met behulp van integrines in de lever aanhechten en
uitgroeien tot metastases.
153
9
CHAPTER 9
Omdat de lever de grootste populatie van macrofagen bevat die na activatie
in staat zijn tot uitscheiding van zuurstofradicalen, hebben we vervolgens
mogelijke betrokkenheid van deze immuuncellen bij tumorcelaanhechting nader
onderzocht. Verrassend genoeg hadden de ratten waarin de lever macrofagen
waren uitgeschakeld geen schade aan de leverbloedvaten. Bovendien was de
tumorcelaanhechting minimaal. Dit suggereert dat activatie van levermacrofagen
na de operatie leidt tot schade aan het levervaatbed, waardoor tumorcellen zich
gemakkelijk kunnen aanhechten. Helaas was toediening van een antioxidant niet
voldoende om de levermetastasering te voorkomen. De ratten die waren behandeld
met antioxidant hadden juist meer leveruitzaaiingen dan de onbehandelde
controleratten. Dit zou te maken kunnen hebben met de rol van macrofagen,
die ook wel “grote eters” worden genoemd. Ze spelen een belangrijke rol in het
herkennen en opnemen (fagocyteren) van tumorcellen. Na de opname worden
de tumorcellen onder andere met behulp van zuurstofradicalen afgebroken.
Neutralisatie van zuurstofradicalen kan er dus voor gezorgd hebben dat de
tumorcellen niet afgebroken konden worden. Dit kan hebben geleid tot uitgroei
van meer levermetastases.
Eerdere studies hebben aangetoond dat patiënten van wie de colorectaltumor
was verwijderd hogere concentraties van bacteriële componenten zoals
lipopolysaccharide (LPS) in hun bloed hadden. De darmen bevatten veel bacteriën
en de kans is dus erg groot dat bacteriële producten tijdens de operatie vrijkomen.
Om te onderzoeken of bacteriële componenten een rol spelen bij het ontwikkelen
van levermetastases bij patiënten met colorectalkanker, hebben we de operatie
die de patiënten ondergaan in ons diermodel nagebootst (hoofdstuk 4).
Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat bij patiënten waarbij de hechting
van de darmen na de operatie losraakt een naadlekkage kan ontstaan, waarbij
bacteriële producten als het ware in de buikholte lekken. Deze patiënten hadden
een slechtere prognose en ontwikkelden meer metastases dan patiënten zonder
naadlekkage. Dit suggereert dat bacteriële componenten een rol spelen in het
ontwikkelen van metastases. In ons diermodel werd een klein deel van de dikke
darm operatief verwijderd waarna de uiteinden van de darm weer werden
verbonden, hierna colectomie genoemd. In tegenstelling tot de ratten waarvan de
buikwand alleen open en dicht was gemaakt (hierna gerefereerd als laparotomie),
lieten uitstrijkjes van de darmnaad van de ratten in de colectomiegroep een
verhoogde hoeveelheid van bacteriën zien. Nader onderzoek wees uit dat de
tumorcelaanhechting in de lever van de ratten na de colectomie was verhoogd
ten opzichte van de aantallen van tumorcellen in de levers van niet-geopereerde
controleratten en de ratten na laparotomie. Deze resultaten suggereerden dat de
bacteriële producten die tijdens de operatie uit de darmen lekken de aanhechting
van tumorcellen stimuleren. Wanneer macrofagen in kweek waren geïncubeerd
met plasma dat was afgenomen op verschillende tijdstippen na laparotomie, zagen
we activatie van macrofagen. Dit betekende dat plasma van ratten na operatie
macrofaag activerende bestanddelen bevatten.
154
APPENDICES
In leverbiopten van patiënten en ratten na operatie vonden we verhoogde aantallen
van neutrofielen ten opzichte van de aantallen van neutrofielen bij het begin van
de operatie. Dit zijn witte bloedcellen die in het bloed circuleren. Na blootstelling
aan lichaamsvreemde stoffen, zoals bacteriën, raken ze geactiveerd en hechten ze
aan in de organen zoals de lever. Deze bevindingen suggereren dat operatie leidt
tot een systemische ontstekingsreactie en dat dit ten grondslag ligt aan verhoogde
uitgroei van uitzaaiingen in de lever. Omdat we in de levers van ratten na de
laparotomie en de colectomie veel neutrofielen vonden, hebben we de mogelijke rol
van deze cellen in de ontwikkeling van uitzaaiingen verder onderzocht (hoofdstuk
5). Om te onderzoeken of de bacteriële componenten die vrijkomen na de operatie
verantwoordelijk zijn voor de aantrekking van neutrofielen naar de lever, en hiermee
de tumorcelhechting mogelijk maken, hebben we de ratten behandeld met de
bacteriële component LPS. We vonden al na 45 minuten verhoogde aantallen van
neutrofielen en tumorcellen in de levers van de ratten na LPS-behandeling. Incubatie
van endotheelcellen met neutrofielen en LPS leidt tot schade aan de endotheellaag
en ontbloot het onderliggende bindweefsel. Schade aan de endotheellaag werd
mogelijk aangericht door zuurstofradicalen die door de neutrofielen werden
uitgescheiden. Behandeling van ratten voor de operatie met een antioxidant
resulteerde in lagere aantallen van aangehechte neutrofielen en tumorcellen.
Zoals hierboven beschreven, operatie leidt tot verhoogde aantallen neutrofielen en
tumorcellen in de lever. Echter, terwijl het aantal tumorcellen al na 1,5 uur piekte, was
de maximale hoeveelheid neutrofielen pas 6 uur na operatie bereikt. Dit suggereert
dat aanhechting van neutrofielen en tumorcellen in de lever mogelijk door een ander
immuuncel wordt gefaciliteerd.
Een ander type immuuncel dat zuurstof radicalen kan uitscheiden zijn de macrofagen,
waarvan de grootste populatie zich in de lever bevindt. Verrassend genoeg waren we
in staat om de aanhechting van neutrofielen en tumorcellen drastisch te remmen
door levermacrofagen uit te schakelen. De exacte rol van de macrofagen hebben we
daarom nader onderzocht (hoofdstuk 6).
Incubatie van de macrofagen met LPS leidde tot de activatie van deze cellen. In
een co-kweek van endotheelcellen met macrofagen veroorzaakte LPS schade aan
de endotheellaag. Beschadiging van het endotheellaag kon worden voorkomen
wanneer zuurstofradicaal-neutraliserende enzymen aan de co-kweek met LPS
werden toegevoegd. Door in vivo gebruik te maken van een antioxidant of door
levermacrofagen uit te schakelen werd de verhoogde tumorcelaanhechting geremd.
Dit suggereert dat activatie van macrofagen door de bacteriële component LPS,
tumorceladhesie in de lever stimuleert.
In hoofdstukken 2 tot en met 6 hebben we laten zien dat een operatie, die essentieel
is voor het verwijderen van de colorectale tumormassa, leidt tot aanhechting van
circulerende tumorcellen in de lever. In de hoofdstukken 7 en 8 hebben we de
mogelijkheden van potentiële therapieën bestudeerd.
155
9
CHAPTER 9
In hoofdstuk 7 hebben we met behulp van een microscoop tumorcellen in de
levers van levende muizen gevolgd. De macrofagen in de levers van onbehandelde
muizen tasten de tumorcellen af, maar waren niet in staat om de tumorcellen op
te nemen (te fagocyteren). Vervolgens hebben we de muizen geïnjecteerd met
eiwitten die specifieke membraaneiwitten van tumorcellen herkennen en die
binden (hierna antilichamen genoemd). In deze experimenten vonden we dat de
levermacrofagen wel in staat waren om de tumorcellen snel te herkennen en te
fagocyteren (figuur 2). Terwijl de levers van de onbehandelde controlemuizen 24
uur na toediening nog steeds grote clusters van tumorcellen bevatten, vonden we
in de levers van muizen die waren behandeld met antilichaam kleine afgebroken
resten van tumorcellen. Dit suggereert dat behandeling met antilichaam de
afbraak van tumorcellen stimuleert waardoor de ontwikkeling van levermetastases
wordt geremd. Omdat de korte termijn experimenten suggereerden dat lever
macrofagen een belangrijke rol spelen in eliminatie van de tumorcellen, hebben
we de rol van deze immuuncellen bij tumoruitgroei nader onderzocht. Wanneer
we de lever macrofagen uitschakelden vonden we geen verschil in de afbraak van
tumorcellen tussen de levers van onbehandelde muizen en muizen die waren
behandeld met het antilichaam. Bovendien was er geen verschil in tumoruitgroei
tussen de onbehandelde en de behandelde muizen als de levermacrofagen
waren uitgeschakeld. Daarentegen, antilichaambehandeling was succesvol in het
voorkomen van tumorgroei in de levers van de muizen. Deze data impliceren dat
antilichaamtherapie een effectieve methode is om lever metastasering te remmen.
Levermacrofagen spelen een centraal rol in antilichaambehandeling.
De benadering met tumorspecifieke antilichamen resulteert dus tot de preventie
van tumoruitgroei die ontstaat door aanhechting van vrij circulerende tumorcellen.
Eerdere studies hebben laten zien dat patiënten van wie de primaire tumor operatief
wordt verwijderd vrij circulerende tumorcellen in hun bloed of lever hebben.
Andere studies hebben aangetoond dat deze patiënten na operatie binnen 5 jaar
leveruitzaaiingen ontwikkelen. Dit heeft geleid tot de hypothese dat behandeling
met antilichaam gericht tegen een eiwit op het oppervlak van tumorcellen voor de
operatie het ontstaan van levermetastases zou kunnen voorkomen. In hoofdstuk
+
antilichaam
tumorantigen
tumorcel
macrofaag
Figuur 2: antilichaamtherapie. Antilichamen gericht tegen tumoreiwitten binden specifieke eiwitten
op het oppervlak van tumorcellen. Antilichaam gebonden tumorcellen kunnen door macrofagen beter
en sneller worden herkend. Dit leidt tot opname en afbraak van tumorcellen waardoor tumorvorming
wordt voorkomen.
156
APPENDICES
8 hebben we het onderzoek naar de epidermal growth factor receptoren (EGFR),
beschreven. De EGFR is een membraaneiwit en komt in meer dan 80% van de
colorectale tumoren verhoogd tot expressie. Een antilichaam die specifiek gericht is
tegen EGFR zou dus gebruikt kunnen worden om de tumorcellen als kwaadaardig te
markeren. Hierdoor zouden de macrofagen tumorcellen beter kunnen herkennen.
Het antilichaam Zatulumumab wordt in de kliniek voorgeschreven aan patiënten
met bestaande tumoren. Deze behandeling leidt echter niet tot het gewenste
resultaat, namelijk het kleiner worden van de tumor. Dit zou verklaard kunnen
worden door de mechanistische werking van deze behandeling. Zatulumumab
grijpt aan op het eiwit EGFR. Door signalen binnenin de cel te sturen wordt de
groei van de tumor geremd. De signaaleiwitten zijn in tumoren echter vaak
gemuteerd, waardoor de signalen niet worden doorgegeven en tumorgroei niet
wordt geremd. Integenstelling tot de huidige toepassing zou Zatulumumab
kunnen worden gebruikt om de tumorcellen die los zijn geraakt van de primaire
colorectaltumor te markeren. In hoofdstuk 8 laten wij zien dat de macrofagen bij
gebruik van Zatulumumab tumorcellen beter kunnen herkennen en fagocyteren.
Wij hebben ook aangetoond dat de herkenning van tumorcellen in aanwezigheid
van antilichaam onafhankelijk is van de mutaties van de signaaleiwitten.
Fagocytose van tumorcellen door macrofagen in aanwezigheid van antilichaam is
afhankelijk van de EGFR expressie op het membraan van de tumorcel. Dit betekent
dat tumorcellen met hogere expressie van EGFR beter worden gefagocyteerd dan
tumorcellen met lagere expressie van EGFR.
Voor
macrofaag
endotheelcel
neutrofiel
Na
tumorcel
zuurstofradicaal
bindweefsel
LPS
Figuur 3: samenvatting. Veel patiënten met
kanker hebben circulerende tumorcellen in
bloed. Tijdens het operatief verwijderen van
dikke darm- of rectumtumor kunnen bacteriële producten vrijkomen, die vervolgens
macrofagen kunnen activeren. Geactiveerde
macrofagen scheiden onder andere zuurstofradicalen uit waardoor het levervaatbed
beschadigd raakt en bindweefsel wordt ontbloot. Circulerende tumorcellen en neutrofielen kunnen aan het ontblootte bindweefsel
binden. Aangehechte neutrofielen kunnen
vervolgens de schade aan het vaatbed verergeren waardoor de aanhechting van tumorcellen aanhechting nog verder wordt gestimuleerd. Aangehechte tumorcellen kunnen
uitgroeien tot levermetastases.
157
9
CHAPTER 9
Conclusies
Een operatie die noodzakelijk is voor het verwijderen van een grote tumormassa
leidt tot activatie van levermacrofagen en daarmee tot het vrijkomen van
zuurstofradicalen. Deze beschadigen het vaatbed van de lever waardoor het
bindweefsel vrij komt te liggen. Circulerende tumorcellen kunnen makkelijker aan
het ontblootte bindweefsel aanhechten en uitgroeien tot levermetastases (figuur
3). Door te behandelen met antilichamen die gericht zijn tegen eiwitten op het
membraan van de tumorcellen, kunnen de levermacrofagen de tumorcellen beter
als kwaadaardig herkennen, fagocyteren en vervolgens afbreken.
Aanbevelingen
Operatief verwijderen van de primaire colorectale tumoren is noodzakelijk en de
beste optie voor betere en langere overleving van patiënten. Helaas geeft deze
methode grotere kans op uitzaaiingen in de lever. Ontstekingsreacties als gevolg
van operatie en/of bacteriële componenten die tijdens de operatie vrijkomen,
zorgen ervoor dat levermacrofagen geactiveerd worden. Het optimaliseren van
operatietechnieken zou de mate van de ontstekingsreactie en het vrijkomen
van bacteriële producten kunnen verminderen, waardoor de macrofaagactivatie
enigszins kan worden voorkomen. Aangezien de resectie van de tumor altijd
gepaard gaat met weefselschade, kunnen we de activatie van macrofagen
niet volledig voorkomen. Daarom hebben we naast de minimaal invasieve
operatietechnieken ook additionele behandelingsmethodes nodig.
Het is gebleken dat het bacteriële product LPS een belangrijke rol speelt in de
initiële stap van de ontwikkeling van uitzaaiingen. Eerdere onderzoeken hebben
aangetoond dat interactie van LPS met Toll-like receptor (TLR) 4, tot activatie van
immuuncellen zoals macrofagen leidt. Activatie van macrofagen zou kunnen
worden geremd door LPS weg te vangen of door de interactie van LPS met TLR4 te
blokkeren. Anderzijds, is het ook mogelijk dat andere bacteriële producten, zoals
lipoproteinen, lipopeptiden of flagellin, die aangrijpen op andere TLRs zoals TLR1, 2,
5 en 6, tijdens de operatie vrijkomen en daardoor een rol spelen in de ontwikkeling
van uitzaaiingen. Door gebruik te maken van experimentele diermodellen, waarin
deze receptoren ontbreken, kan men een uitspraak doen over de mogelijke rol van
deze receptoren. Gedetailleerde kennis over de rol van bacteriële producten kan
een bijdrage leveren aan het ontwikkelen van een gepaste therapie.
Verder hebben we aangetoond dat wanneer er gebruik wordt gemaakt van
antilichamen tegen tumoreiwitten, macrofagen de tumorcellen beter herkennen
en fagocyteren, waarna de tumorcellen worden afgebroken. Ik stel dan ook voor
om de toepasbaarheid van deze benadering in de kliniek te evalueren.
158
APPENDICES
Dankwoord
Yes, het zit erop!!! 4 jaar lang ploeteren, pipeteren, opereren, snijden, kleuren, en
schrijven heeft uiteindelijk geresulteerd in dit proefschrift. Ik kan terugkijken op
een ontzettend leuke tijd waarin ik mij zowel op wetenschappelijk als persoonlijk vlak heb kunnen ontwikkelen. Maar natuurlijk heb ik dit niet alleen gedaan, en
daarom wil ik graag mijn dank uitspreken naar iedereen die op de een of andere
manier heeft bijgedragen aan dit proefschrift. Mogelijk zal ik mensen vergeten
bij naam te noemen, maar dat wil niet zeggen dat ik jullie hulp en inzet niet ook
enorm waardeer: heel veel dank voor alle moeite!
Als eerste wil ik de commissie bedanken voor de tijd en moeite die ze heeft genomen om mijn proefschrift te lezen: dr. Hein Stockmann, prof.dr. Arjan Griffioen,
dr. Arjan van Loosdrecht, prof.dr. Elga de Vries, prof.dr. Jaap Bonjer en prof.dr. Paul
Kubes.
Vervolgens mijn copromotor dr. Marjolein van Egmond. Beste Marjolein, wat heb
ik toch een mazzel gehad met jou als begeleider!! Ik bewonder je toewijding aan
jouw mensen en je enthousiasme voor het onderzoek. Ik wil je bedanken voor wat
je voor mij hebt gedaan en nu nog steeds doet. Je hoorde mijn wildste ideeën
altijd geduldig aan, om mij dan vervolgens ervan te overtuigen dat het misschíen
toch niet zulke goede ideeën waren. Trouwens, hoe lang is het lijstje “je hebt gelijk,
Marjolein” inmiddels geworden?
Mijn promotor prof.dr. Robert H.J. Beelen. Beste Rob, ik wil je ontzettend bedanken
voor je steun en interesse in mijn onderzoek. Je wist me met twee benen op de
grond te houden.
Prof.dr. Paul Kubes. Dear Paul, we met during an endothelial meeting in Miezenmortel in 2010. While enjoying a monastery beer, we discussed the possibilities
for collaboration in intravital microscopy and liver metastases model. A couple of
months later, you gave me the opportunity to visit your lab for a few months and
use the intravital microscope. The experiments done during my visit are described
within this thesis. Thank you very much for a pleasant collaboration. Hereby I take
the opportunity to thank the members of Kubes lab: Derrice, Connie, Craig, Breadon, Björn, Woo Yong, Keir, Rosalie, Carla. Thank you very much for having me and
helping me around. Kerstin, I also would like to thank you for your work for our
manuscript. Hopefully we can get it published soon.
Mijn paranimf Lydia. Lieve Lydia, ik bewonder je vanaf het moment dat ik je heb
leren kennen. Je enthousiasme en doorzettingsvermogen zijn aanstekelijk. Een
praatje met jou op de momenten dat het even niet lekker ging, hebben mij steeds
weer het positieve doen inzien. Ontzettend bedankt voor de leuke en gezellige tijd.
Succes met de afronding van jouw promotieonderzoek. Volgend jaar jouw feestje?
159
9
CHAPTER 9
Mijn paranimf Leonie. Lief meissie, dank je wel dat je mij op zo’n bijzondere dag
wilt bijstaan. Met jou aan mijn zijde voel ik me versterkt. Dankjewel voor je vriendschap en veel geluk met je gezinnetje.
Leden van de Tumor Immunologie Groep: bedankt voor jullie inzet en gezelligheid. Beste Marijn, omdat je al een tijd bij Marjolein als analist had gewerkt, wist
je al veel over het onderwerp. Je hebt me dan ook erg geholpen en wegwijs gemaakt op het lab. Al die uurtjes in het UPC hebben toch hele mooie resultaten
opgeleverd. Succes met het geregel voor je promotie en verdere carrière.
Beste Simran, ik wil je bedanken voor je inzet!! Succes met je promotie.
Beste Rens, succes met je promotieonderzoek. Ik hoop dat onze projecten veel
overlap hebben, ik vind het heel erg prettig om met je samen te werken.
Stephan, bedankt voor al je ondersteuning en goede organisatie rondom de dierexperimenten. Zonder jou waren een aantal dingen niet mogelijk geweest.
Andere leden van het “van Egmond” clubje: Jantine, Kees, Sonja, Rianne en Miel en
alle andere groeners. Bedankt voor de leuke tijd op en buiten het lab!!
Oude en nieuwe kamergenoten op kamers J275 en J283: Ellen, Gijs, Rosalie, Jasper, Miel, Ida, Jamie, Jantine, Geert, Joost en Maarten. Bedankt voor de gezellige
tijd!
Ook wil ik alle andere MCBI collega’s bedanken voor de gezellige tijd. Dankzij jullie
voelt de afdeling als heerlijk thuiskomen.
Natuurlijk wil ik ook mijn dank uitspreken naar de medewerkers van het UPC. In
het bijzonder Carla en Erwin voor het mogelijk maken van de in dit proefschrift
beschreven dierproeven. Beste Carla, bedankt voor de gezellige uurtjes boven de
operatietafel. Zonder jou was het een stuk minder leuk.
De Roei- en marathoners: in het bijzonder Iris, Gerhard, Eric, Carolien. Helaas, helaas, helaas!!! Afgelopen twee jaar heb ik nauwelijks geroeid laat staan marathons
“weggetikt”. Hopelijk kan ik binnenkort wat meer trainen. Bedankt voor de afleiding en plezier naast het werk, maar ook voor jullie warme belangstelling.
Lieve vrienden Barbara, Pieter, Annemarie, Joost, Laura, Björn, Gitta, Darrin, Natasja, Christiaan, Leonie, Marco en Masha: bedankt voor de nodige ontspanning
naast het drukke AIO-bestaan. Barbara, succes met het opzetten van een eigen
bedrijf. Met jouw planmatige aanpak en doorzettingsvermogen kan het gewoon
niet anders dan een succes worden.
Mijn zussen Fadi en Gülay en broertje Yılmaz, eniște Michaël en Niels. Ik hou toch
zo veel van jullie! Het is elke keer een feest om bij jullie te zijn. Zoals jullie enişte
het zegt: ‘als er meer dan een Gullie in de kamer is, is het alleen maar lachhuh….’
160
APPENDICES
Anneciĝim ve babam. Sizin yardımınız olmasaydı bu kitabı yazamazdım. . Hersey
için çok teşekkürler.
Beste schoonfamilie: Nellie, Frans, Willeke, Bas, Pim, neefje Rick en nichtje Alice. Zeker in het laatste jaar hebben jullie ontzettend veel hulp gegeven. Bedankt voor
jullie steun, oprechte interesse en hartelijkheid. Frans, ik wil jou in het bijzonder
bedanken voor de layout van het boekje en je schitterende creatieve cover. Ik ben
er ongelofelijk blij mee.
Als laatste de meest belangrijke mensen in mijn leven:
Jan-Willem, mijn liefie, mijn maatje, mijn klankbord, mijn steun en toeverlaat! Waar
een cursus wiskunde toch toe kan leiden. Jouw bijdrage aan dit werk is enorm.
Zonder jouw steun zou dit promotieonderzoek niet met succes zijn afgerond. Jouw
vertrouwen in mij en mijn kunnen maken mij tot wat ik ben. Seni seviyorum.
Dünya, sari saçli, mavi gözlü güzelim!!! De dochter die ik altijd al had willen hebben.
Jij bent het beste wat mamma en pappa ooit is overkomen!!
9
161
CHAPTER 9
162
Notes
163
Notes
164