Survey
* Your assessment is very important for improving the workof artificial intelligence, which forms the content of this project
* Your assessment is very important for improving the workof artificial intelligence, which forms the content of this project
172 | Addenda Summary Proteolytic regulation of the activity of cell-surface signalling systems of Pseudomonas bacteria. Cells are the ‘building blocks of life’. The human body is built from billions of cells that specialize to perform dedicated functions (liver cells, heart cells, muscle cells, and so on). A bacterium however only consists of a single cell, which is why we refer to it as a unicellular organism. This one cell contains all the functions that the bacterium requires to survive and multiply. Although bacteria have a bad name because some of them cause disease in humans, animals and plants, they are of the utmost importance for life on earth. In fact, the human body even contains ten times more bacterial cells than own cells! For example, the millions of bacteria that we carry in our intestines are important for the digestion of the food we eat. The genome of bacteria consists of many genes normally found on a single circular DNA molecule that contains all the information required for the production of the main functional components; proteins. However, protein production is an energyconsuming process and therefore some proteins are only made in conditions when the protein is in fact needed. To accomplish this, bacteria contain several signal transduction systems that allow them to sense the presence of specific signals in the environment and respond to them by producing the required proteins. This thesis has focused on the study of these kind of signal transduction mechanisms to better understand how bacteria are able to sense and respond to their environment. We used a specific family of bacteria as model organisms, called Pseudomonas. The best known member of this group is Pseudomonas aeruginosa, which is an opportunistic pathogen and can cause serious infections in susceptible hosts (including humans). In contrast, its close relative Pseudomonas putida does not cause disease and is known for its capacity to colonise the root of plants, thereby providing growth advantages. All bacteria are surrounded by a cell wall that keeps the content, i.e. the cytosol where the DNA is located, safe. This cell wall prevents the entry of damaging molecules such as antibiotics or components of our immune system. In the case of bacteria of the genus Pseudomonas, the cell wall is formed by two membranes (internal and external). The space between these layers is called the periplasm. The inner membrane closes around the inside (the cytosol) of the bacterium to tightly seal it, while the outer membrane is in contact with the environment and functions as a permeability barrier that prevents free entry of foreign molecules. Although these membranes are very important to protect the bacteria, their presence complicates the uptake of essential nutrients that are required for growth and multiplication, such as iron. Iron is crucial for the bacteria as it participates as a cofactor in many enzymatic reactions without which the bacteria cannot survive. However, due to its low solubility iron is only available in very low amounts in the environment or in the (human) host, and therefore Pseudomonas produces and secretes compounds that are able to bind iron with very high affinity. These compounds are called siderophores. In addition, Pseudomonas bacteria are not only able to use their own siderophores but can also steal siderophores produced by other bacteria with which they share a niche. Upon binding of iron, siderophores can be recaptured by the bacterial cell and Pseudomonas utilizes specialized receptors in the outer membrane for their recognition and entry. You Summary/Samenvatting/Resumen | can view these outer membrane receptors as doors in the cell wall that only open with a specific key. Pseudomonas bacteria can produce up to 40 different types of iron receptors. However, these receptors are relatively large and their production costs a lot of energy. Therefore, bacteria will only produce high amounts of these receptors if the specific signal molecule (the siderophore) is present in its environment. The signal transduction systems that enable the production of these receptors are referred to as cell-surface signalling (CSS) and generally consist of three core components: the siderophore receptor (in the outer membrane), an anti-sigma factor (in the inner membrane) and a sigma factor (in the cytosol). In absence of the signal the anti-sigma factor binds the sigma factor and keeps it in an inactive state. The presence of the inducing signal is recognized by the outer membrane receptor, upon which a signalling cascade is initiated that results in the release and activation of the sigma factor in the cytosol. Upon activation, the sigma factor binds to certain areas on the bacterial DNA (called promoters) to induce the transcription of specific genes. This results in the production of proteins required to respond to the signal. Among these proteins is the outer membrane receptor that is necessary for both recognition and transport of the signal molecule (siderophore). To gain understanding in how bacteria are able to detect and respond to their environment, in this thesis we have investigated how CSS signal transduction from the outside to the inside of the bacterium takes place. To do this, we have focused on the role of the antisigma factor in this process, as it is a central component of the CSS system. It receives the signal from the outer membrane receptor and transmits it to the cytosolic sigma factor to allow activation. In Chapter 2 we have shown that anti-sigma factors are degraded (i.e. cut up in pieces) in response to the signal by a process known as Regulated Intramembrane Proteolysis (RIP), in which various proteases play a role (proteins with enzymatic activity that can cleave other proteins). We have identified two proteases involved in this process: Prc, which degrades the periplasmic part of the protein, and RseP, which cuts in the part of the anti-sigma factor located in the inner membrane (known as the transmembrane domain). These cuts result in the release and activation of the sigma factor in the cytosol, and thus the production of the required proteins in response to the signal. In chapter 3 we showed that, independent of the presence of the signal, most anti-sigma factors are already cut in two domains. Although the precise function of this initial cleavage event remains unclear, our work has shown that it is necessary to correctly regulate sigma factor activity in absence and presence of the signal. The remarkable aspect of this cleavage event was that it did not require external protease, and that this process takes place through an internal process in the anti-sigma factor. In chapter 4 we proposed that not enzymatic activity, but a chemical sequence called an N-O acyl rearrangement was responsible for this intrinsic cleavage event. In chapter 5 we performed a mutation analysis of an antisigma factor by randomly changing amino acids in the protein. In this way, we made mutants with constant activity, regardless of the presence of the signal. This analysis has enabled a greater understanding of the molecular mechanism behind the activation of the CSS system and the role of the Prc and RseP proteases in this process. Finally, in chapter 6 we have analyzed an unusual CSS system involved in the regulation of virulence functions in the pathogen P. aeruginosa. In contrast to all other reported CSS systems, this pathway does not seem to respond to iron-chelating molecules but an as yet unidentified molecule likely originating from the host. In fact, our work shows that the expression of this system does not occur in iron-deficient conditions but during lack of inorganic phosphate. 173 & 174 | Addenda In short, the work described in this thesis has considerably advanced our knowledge of the molecular mechanism that leads to Cell-Surface Signalling activation, and therefore of how bacteria sense and respond to the environment. Our study has opened up many new avenues for research on this important signal transduction system, which may have potential biotechnological and clinical implications. Samenvatting Proteolytische regulatie van de activiteit van celoppervlakte signaleringssystemen in Pseudomonas bacteriën. Cellen zijn de ‘bouwstenen van het leven’. Het menselijk lichaam is opgebouwd uit miljarden cellen, die zich specialiseren tot het uitoefenen van specifieke functies (bijvoorbeeld levercellen, hartcellen en spiercellen). Een bacterie bestaat echter maar uit een enkele cel, en daarom noemen we het ook wel een eencellig organisme. Deze cel bevat alle functies die de bacterie nodig heeft om te overleven en zich te vermenigvuldigen. Hoewel bacteriën een slechte naam hebben omdat sommige ziekte kunnen veroorzaken in mensen, dieren en planten, zijn zij van groot belang voor het leven op aarde. Het menselijk lichaam bevat zelfs tien keer meer bacteriële cellen dan eigen cellen! De miljarden bacteriën die we meedragen in onze ingewanden zijn bijvoorbeeld erg belangrijk voor de vertering van het voedsel dat we eten. Het genoom van bacteriën bestaat uit vele genen die op een enkel circulair DNA molecuul zitten. Dit bevat alle informatie die nodig is voor de productie van de belangrijkste functionele component: eiwitten. Eiwit productie kost echter veel energie en daarom worden sommige eiwitten alleen gemaakt in specifieke omstandigheden wanneer het eiwit nodig is. Om dit te bereiken bevatten bacteriën verschillende signaaltransductie systemen die de bacterie in staat stelt de aanwezigheid van specifieke veranderingen in hun omgeving waar te nemen en daarop te reageren door de vereiste eiwitten te produceren. Dit proefschrift heeft zich gericht op de studie van deze signaaltransductie systemen om beter te begrijpen hoe bacteriën op hun omgeving reageren. We hebben een specifieke familie van bacteriën gebruikt als model organisme, genaamd Pseudomonas. Het meest bekende lid van deze groep is Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische pathogeen (ziekteverwekker) die ernstige infecties kan veroorzaken in vatbare gastheren (inclusief de mens). De dicht verwante Pseudomonas putida, in tegendeel, veroorzaakt geen ziekte, maar is bekend vanwege zijn capaciteit de wortels van planten te koloniseren en daarbij groei van de plant te stimuleren. Alle bacteriën zijn omgeven door een celwand, die de inhoud, oftewel het cytoplasma waar het DNA zich bevindt, veilig houdt. De celwand voorkomt dat schadelijke invloeden van buitenaf de cel binnendringen, zoals antibiotica of componenten van ons immuunsysteem. De celwand van Pseudomonas bacteriën is opgebouwd uit twee membranen (de binnenen de buitenmembraan). De ruimte tussen deze twee lagen heet het periplasma. De binnenmembraan sluit om het binnenste (het cytoplasma) van de bacterie en sluit deze goed af, terwijl de buitenmembraan in contact staat met de omgeving en functioneert als een barrière die het binnendringen van vreemde moleculen tegenhoudt. Hoewel deze membranen erg belangrijk zijn in het beschermen van de bacterie, compliceert hun aanwezigheid de opname van essentiële voedingsstoffen die vereist zijn voor groei Summary/Samenvatting/Resumen | en vermenigvuldiging, zoals ijzer. IJzer is van cruciaal belang voor bacteriën, omdat het nodig is voor vele enzymatische reacties zonder welke de bacterie niet kan overleven. Door zijn slechte oplosbaarheid is ijzer echter maar in hele lage hoeveelheden aanwezig in de leefomgeving van de bacterie, en daarom scheidt Pseudomonas verbindingen uit die ijzer kunnen binden met erg hoge affiniteit. Deze noemen we ook wel sideroforen. Pseudomonas bacteriën zijn niet alleen in staat de sideroforen te gebruiken die ze zelf hebben geproduceerd, maar kunnen ook sideroforen stelen die zijn gemaakt door andere bacteriën waarmee ze hun omgeving delen. Wanneer een siderofoor ijzer bindt kan deze weer opgenomen worden door de bacterie door specifieke receptoren in de buitenmembraan. De receptoren zijn verantwoordelijk voor de herkenning en opname van de siderofoor. U kunt deze receptoren zien als deuren in de celwand die alleen open gaan met een specifieke sleutel. Pseudomonas bacteriën kunnen wel 40 verschillende siderofoor receptoren produceren. Maar deze eiwitten zijn vrij groot en hun productie kost veel energie. Daarom produceren bacteriën deze eiwitten meestal alleen als het specifieke molecuul (de siderofoor) aanwezig is in hun omgeving. De signaaltransductie routes die de productie van siderofoor receptoren mogelijk maken noemen we in het Engels ‘Cell-Surface Signalling (CSS)’ systemen en bestaan over het algemeen uit drie kern componenten: een siderofoor receptor (in de buitenmembraan), een anti-sigma factor (in de binnenmembraan) en een sigma factor (in het cytoplasma) (zie ook Figuur 1). De antisigma factor bindt aan de sigma factor in afwezigheid van het signaal en houdt deze in een inactieve staat. De aanwezigheid van het signaal wordt opgemerkt door de receptor in de buitenmembraan, waarop een proces wordt geïnitieerd dat leidt tot de bevrijding en activatie van de sigma factor in het cytoplasma. Na activatie kan de sigma factor binden aan specifieke gebieden op het bacteriële DNA (genaamd promotors) om de benodigde genetische informatie uit te lezen. Dit resulteert in de productie van eiwitten die nodig zijn om te reageren op de aanwezigheid van het signaal. Onder deze eiwitten is vrijwel altijd ook de buitenmembraan receptor die nodig is voor zowel herkenning als transport van de siderofoor. Figuur 1. Schematische weergave van een CSS systeem. Een dwarsdoorsnede van een Pseudomonas bacterie is getekend met de drie componenten van een CSS systeem: de siderofoor receptor in the buitenmembraan, de anti-sigma factor in de binnenmembraan en de sigma factor in het cytosol. Om te begrijpen hoe bacteriën hun omgeving waarnemen en erop reageren hebben we in dit proefschrift onderzocht hoe CSS signaaltransductie plaatsvindt. Hiervoor hebben wij gefocust op de rol van de anti-sigma factor in dit proces, aangezien dit eiwit een centrale component is in het CSS systeem. De anti-sigma factor ontvangt het signaal van de buitenmembraan receptor en geeft deze door aan de cytoplasmatische sigma factor om deze te activeren. In hoofdstuk 2 hebben we laten zien dat anti-sigma factoren worden gedegradeerd (in kleine stukjes geknipt) als reactie op het signaal van buitenaf. Dit gebeurt door een proces dat we in het Engels kennen als ‘Regulated Intramembrane Proteolysis (RIP)’, waarin verschillende proteasen (de scharen: eiwitten met enzymatische activiteit die andere eiwitten kunnen knippen) een rol spelen. We hebben twee proteasen geïdentificeerd die betrokken zijn 175 & 176 | Addenda bij dit proces: Prc, die het periplasmatische deel van het eiwit degradeert, en RseP, die in het deel van de anti-sigma factor knipt welke in het binnenmembraan is gelegen (ook wel het transmembraan domein genoemd). Deze twee knippen leiden uiteindelijk tot het loskomen en de activatie van de sigma factor in het cytoplasma, en daarmee de productie van de vereiste eiwitten in reactie op het signaal. In hoofdstuk 3 hebben we laten zien dat, onafhankelijk van de aanwezigheid van het signaal, de anti-sigma factor al in twee delen wordt geknipt. Hoewel de exacte functie van deze initiële knip nog onduidelijk blijft, heeft ons werk laten zien dat het nodig is om op een correcte manier de activiteit van de sigma factor te reguleren in af- en aanwezigheid van het signaal. Het opmerkelijke aspect van de initiële knip is dat het geen externe protease vereist, maar dat dit proces plaats vindt door een interne reactie in de anti-sigma factor. In hoofdstuk 4 stellen we voor dat de initiële knip niet plaats vindt door enzymatische activiteit, maar door een chemische keten waarnaar we in het Engels verwijzen als een ‘N-O acyl rearrangement’. In hoofdstuk 5 hebben wij een mutatie analyse uitgevoerd van een anti-sigma factor door willekeurige onderdelen te veranderen in dit eiwit. Op deze manier hebben wij mutanten gemaakt die constant activiteit van de sigma factor opwekken, onafhankelijk van de aanwezigheid van het signaal. Deze analyse heeft tot een beter begrip van het moleculaire mechanisme achter de activatie van het CSS systemen geleid en ook van de rol van de Prc en RseP proteasen daarin. Ten slotte hebben we in hoofdstuk 6 een uitzonderlijk CSS systeem geanalyseerd dat een rol speelt in de regulatie van ziekteverwekkende functies in de pathogeen P. aeruginosa. In tegenstelling tot alle andere CSS systemen die tot nu toe zijn onderzocht lijkt dit proces niet geactiveerd te worden door ijzerdragers (sideroforen), maar door een tot nu toe ongeïdentificeerd molecuul dat waarschijnlijk afkomstig is van de geïnfecteerde gastheer. Ons werk heeft laten zien dat dit systeem geen rol speelt wanneer er een tekort is aan ijzer, maar juist in condities met een tekort aan inorganisch fosfaat. Samenvattend, het werk beschreven in dit proefschrift heeft een aanzienlijke bijdrage geleverd aan onze kennis over het moleculaire mechanisme dat leidt tot de activatie van Cell-Surface Signalling. Hierdoor begrijpen we beter hoe bacteriën hun omgeving opmerken en hierop reageren. Onze studies hebben verschillende mogelijkheden opgeleverd voor nieuw onderzoek naar deze belangrijke signaaltransductie systemen, welke potentiële biotechnologische en klinische implicaties kunnen hebben. Resumen Regulación proteolítica de la actividad del sistema de señalización de la superficie celular en bacterias del género Pseudomonas. Las células son los “ladrillos de la vida”. Los humanos somos organismos pluricelulares que estamos formado por miles de millones de células que se han especializado para realizar funciones específicas en nuestro cuerpo (células del hígado, células del corazón, células musculares, y así sucesivamente). Una bacteria, sin embargo, se compone de una única célula, por lo que nos referimos a ella como un organismo unicelular. Esta célula bacteriana contiene todas las funciones que la bacteria necesita para sobrevivir y multiplicarse. Aunque las bacterias tienen una mala reputación debido a que algunas causan enfermedades en humanos, animales o plantas, en realidad las bacterias son de suma importancia para la Summary/Samenvatting/Resumen | vida en la tierra. De hecho nuestro cuerpo contiene diez veces más células bacterianas que células humanas. Y esas células bacterianas realizan funciones muy importantes, como por ejemplo los millones de bacterias que llevamos en nuestros intestinos son cruciales en la digestión de los alimentos que comemos. El genoma de las bacterias está formado por multitud de genes que normalmente se encuentran en una única molécula de ADN circular que contiene toda la información requerida para la producción de los componentes funcionales, es decir, las proteínas. La síntesis de proteínas es un proceso costoso que consume energía y por tanto muchas proteínas sólo se producen en condiciones en las que la función que realizan es necesaria. Para lograr esto, las bacterias contienen sistemas de transducción de señales que les permiten detectar la presencia de señales específicas en el medio ambiente y responder a ellas mediante la producción de las proteínas requeridas. Esta Tesis doctoral se ha centrado en el estudio de estos mecanismos de transducción para entender mejor como las bacterias son capaces de detectar y responder a su ambiente. Como modelo se han utilizado bacterias que pertenecen al género Pseudomonas. El miembro más conocido de este grupo es la bacteria Pseudomonas aeruginosa, que es un patógeno oportunista y puede causar infecciones graves en hospedadores susceptibles incluidos los humanos. Por el contrario, su pariente cercano Pseudomonas putida no causa enfermedad, y esta bacteria es sobre todo conocida por su capacidad para colonizar la raíz de las plantas favoreciendo así su crecimiento. Todas las bacterias están rodeadas por una pared celular que mantiene su contenido, es decir, el citosol donde se encuentra el ADN, seguro. Esta pared celular impide la entrada de moléculas dañinas, tales como antibióticos o componentes de nuestro sistema inmune. En el caso de bacterias del género Pseudomonas, esta pared celular está formada por dos membranas, la interna y la externa, entre las que se encuentra un espacio que se conoce como periplasma. La membrana interna se cierra alrededor del citosol de la bacteria sellándolo herméticamente, mientras que la membrana externa está en contacto con el medio ambiente y funciona como una barrera impermeable que impide la entrada libre de moléculas del exterior al interior de la bacteria. Aunque estas membranas son muy importantes para proteger a la bacteria, su presencia complica la obtención de nutrientes esenciales que la bacteria requiere para su crecimiento y multiplicación, como por ejemplo el hierro. El hierro es crucial para las bacterias ya que participa como cofactor en muchas reacciones enzimáticas sin las que la bacteria no puede sobrevivir. Sin embargo, debido a su baja solubilidad este nutriente sólo está disponible en el medio ambiente y en el cuerpo humano en cantidades muy pequeñas. Para obtener hierro, las bacterias producen y secretan unos compuestos llamados sideróforos que son capaces de unir hierro con mucha afinidad. Además, las bacterias del género Pseudomonas son capaces de utilizar no sólo sus propios sideróforos sino también muchos de los sideróforos producidos por otras bacterias con las que convive como fuente de hierro. Una vez que han unido hierro, los sideróforos son recapturados por la célula bacteriana, y para ello la bacteria utiliza unos receptores de la membrana externa que se han especializado en el reconocimiento y transporte de estos compuestos. Estos receptores pueden verse como puertas en la pared celular bacteriana que sólo se abren con una clave específica. Pseudomonas es capaz de producir más de cuarenta tipos diferentes de receptores para compuestos quelantes de hierro. Sin embargo, estas proteínas receptoras son relativamente grandes y su producción supone un gran gasto energético para la bacteria. Por tanto las bacterias sólo las producen en altas cantidades cuando la molécula que transportan, es decir, el sideróforo, está presente en 177 & 178 | Addenda su entorno. El sistema de transducción de señales que permite la producción específica de estos receptores se conoce como sistema de señalización de la superficie celular (CSS por su nombre en inglés ‘cell-surface signaling’). Estos sistemas están formados por tres componentes principales: el receptor en la membrana externa, un factor anti-sigma en la membrana interna, y un factor sigma en el citosol. En ausencia de la señal inductora del sistema el factor anti-sigma une al factor sigma manteniéndolo en estado inactivo. En presencia de la señal (por ejemplo un sideróforo específico), esta es reconocida por el receptor de la membrana externa que inicia una cascada de señalización que produce la liberación y activación del factor sigma en el citosol. Tras su activación, el factor sigma se une a determinadas zonas del ADN bacteriano (denominadas promotores) activando la transcripción de genes específicos y por tanto la producción de las proteínas necesarias para responder a la señal. Entre estas proteínas de respuesta se incluye el receptor CSS que es necesario tanto para el reconocimiento como para el transporte de la molécula CSS señal (sideróforo). En este trabajo de Tesis doctoral hemos investigado cómo se produce la transducción de la señal desde el exterior hasta el interior de la bacteria a través de los sistemas CSS con el fin de conocer mejor como son capaces las bacterias de detectar y responder a su medio ambiente. Para ello nos hemos centrado en el papel del factor anti-sigma en este proceso ya que es el componente central del sistema CSS, es el que recibe la señal generada por el receptor y la transmite al factor sigma permitiendo su activación. En el capítulo 2 hemos demostrado que la presencia de la señal produce la escisión de los factores anti-sigma mediante un proceso conocido en inglés como ‘regulated intramembrane proteolysis (RIP)’ en el que participan varias proteasas, es decir, proteínas con actividad enzimática para cortar otras proteínas. Hemos identificado dos proteasas implicadas en este proceso: Prc, que degrada la parte externa de la proteína y, RseP, que corta en la parte del factor anti-sigma que se sitúa dentro de la membrana interna (y que se conoce como dominio transmembrana). Estos cortes en el factor anti-sigma producen la liberación y activación del factor sigma en el citosol, y por tanto la producción de las funciones de respuesta a la señal. En el capítulo 3 hemos demostrado que la mayoría de los factores anti-sigma ya están escindidos en dos dominios antes de que la señal CSS inductora esté presente en el medio. Aunque la función concreta de este proceso de escisión inicial se desconoce todavía, nuestro trabajo ha demostrado que es necesario para producir una correcta respuesta a la ausencia y presencia de la señal. Además, cabe destacar que hemos demostrado que este proceso de escisión inicial no requiere la acción de proteasas externas, y que este evento se realiza mediante un proceso de autoescisión del factor anti-sigma. En el capítulo 4 proponemos que esta autoescisión no se produce a través de una actividad enzimática (proteasa) sino mediante una reacción química espontanea conocida como reordenamiento NO acilo. En el capítulo 5 hemos generado multitud de proteínas anti-sigma mutantes que producen la activación del factor sigma de manera constitutiva, es decir, incluso en condiciones en las que la señal inductora no está presente. Este análisis ha permitido un mayor conocimiento del mecanismo molecular que hay detrás de la activación de los sistemas CSS y del papel que juegan las proteasas Prc y RseP en este proceso. Por último, en el capítulo 6 hemos analizado un sistema CSS que está implicado en la regulación de funciones de virulencia en el patógeno P. aeruginosa, y que no responde a móleculas quelantes de hierro como los otros sistemas CSS estudiados sino a una molécula señal del hospedador aun no identificada. De hecho, nuestro trabajo Summary/Samenvatting/Resumen | 179 muestra que la expresión de este sistema no se produce en condiciones de falta de hierro sino por falta de fosfato inorgánico. En resumen, el trabajo descrito en esta Tesis doctoral ha avanzado considerablemente nuestro conocimiento sobre el mecanismo molecular que conduce a la activación de los sistemas CSS bacterianos, y por tanto en cómo las bacterias perciben y responden a su medio ambiente. Nuestro estudio ha abierto nuevas líneas de investigación sobre este importante sistema de transducción de señales lo que tiene un gran potencial clínico y biotecnológico. &