Download Gene cloning

1
Gene Engineering
การสร้ าง gene ใหม่
 โดยตัดต่ อระหว่ าง DNA จากแหล่ งทีต
่ ่ างกัน


ได้ DNA โมเลกุลใหม่ เป็ นโมเลกุลผสม เรียกว่ า
Recombinant DNA

วิธีการทาหรื อ methodology เรียกว่ า
Recombinant DNA technology หรื อ
Genetic engineering หรื อ Gene cloning
2
I. หลักการ Recombinant DNA (Gene cloning)
 II. ส่ วนประกอบในการทา gene cloning
 III. การประยุกต์ ใช้ Gene cloning

3
I. หลักการทา Recombinant DNA
1. แยก DNA ของพาหะ และ DNA ทีต่ ้ องการทา
cloning
2. ตัด DNA ของทั้ง 2 แหล่ งด้ วย Restriction
endonuclease
3. ผสม DNA ทั้ง 2 แหล่ ง กับ DNA ligase ภายใต้
เงื่อนใขให้ DNAs ต่ อกัน --> ได้ Recombinant
DNA
หรือ Chimeric DNA
4
การสร้ าง Recombinant DNA
5
II. ส่ วนประกอบของการทา Gene Cloning
1. Gene ทีต่ ้ องการศึกษา เรียกว่ า foreign DNA
2. DNA พาหะ เรียว่ า Vector DNA
3. Restriction endonuclease
4. DNA ligase ต่ อระหว่ าง 2 nucleotides
5. Host cells สาหรับ recombinant DNA เพื่อเพิม่
จานวนในขั้นต้ นของกระบวนการ
ทีพ่ ฒ
ั นาใช้ ได้ แล้ วมี bacteria บางชนิด และ yeast
6
ขั้นตอนละเอียดในการทา Gene cloning
1. เลือก DNA โมเลกุลทีต่ ้ องการ clone เรียกว่ า
Foreign DNA และเลือก DNA โมเลกุลทีน่ าหน้ าที่
เป็ นพาหะ เรียกว่ า Vector DNA
 ตัด foreign DNA และ ตัด vector DNA ด้ วย
enzyme ชนิดเดียวกัน Enzyme ทีใ่ ช้ เรียกว่ า
Restriction enzyme (แยกคนละหลอด)
7
2. เลือกท่ อน (fragment) ของ cut foreign DNA ขนาด
พอเหมาะทีจ่ ะ clone โดย


แยก DNA ในแผ่ นวุ้น ใน สนามไฟฟ้า เรียกวิธีนีว้ ่ า
Electrophoresis ซึ่ง DNA จะถูกออกจากกันตามขนาด
ความยาว ได้ ปรากฏเป็ นแถบ (bands) ต่ าง ๆ กัน
ตัดและแยกแถบทีต่ ้ องการออกมาสกัดแยก DNA ท่ อน
(fragment) ทีต่ ้ องการ
8
DNA gel
electrophoresis
สาหรับแยก
ชิ้นส่ วน DNA
9
3. Insert DNA fragment เข้ าไปในโมเลกุลของ cut vector
DNA ด้ วย enzyme Ligase จะได้ DNA ผสมโมเลกุล
ใหม่ เรียกว่ า Chimeric DNA หรื อ Recombinant DNA
4. นา Recombinant DNA เข้ าไปใน host cells ของ
cloning vector โดยวิธี Transformation หรื อ วิธีอื่น ๆ
host cells โดยทัว่ ไปใช้ E. coli และ yeast
5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบ่ งตัวเพิม่ จานวน
เรียกว่ า Amplification และถ่ ายทอดไปพร้ อมกับการ
แบ่ งตัวเพิม่ จานวนของ host ทาให้ ได้ identical copies
หรื อ clones ของ recombinant DNA จานวนมาก
1
หลักการพืน้ ฐาน
ของ Gene cloning
 Clone หมายถึง
ประชากร (copy) ที่
เหมือนกันของ
สิ่ งมีชีวติ หรื อ
โมเลกุล

1
6. ทาการตรวจเลือกหา (screening) host cells มี
recombinant DNA
1
Cloning Vectors
1. Plasmid
2. Bacteriophage
3. Cosmid
4. Phagemid
5. Artificial chromosome
1
1. Plasmid vectors
Plasmids
 เป็ น extrachromosome ใน microorganisms โดยเฉพาะ
bacteria
 เป็ น double-stranded circular โมเลกุล
 ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถึง 200 kb
 มี antibiotic-resistant genes ทีส
่ ามารถใช้ เป็ น markers
สาหร ับค ัดเลือก clones ที่ positive
 pBR322 เป็ น plasmid ตัวแรกทีใ่ ช้ ใน cloning
1
1.1 Plasmid pBR322
ขนาด 4.3 Kb
 มี Ampicillin resisteant gene
Tetracyclin resistant gene
 มี restriction sites มากและ
ง่ ายต่อการใช้ทา cloning
เช่ น EcoRI, PstI, BamHI
 มี Origin of replication
 เป็ น cloning vector ใน prokaryote
 นาเข้ า bacteria โดย Transformation

1

Bacterial
cloning โดย
ใช้
plasmid
pBR322
1
1.2 Yeast episomal plasmids / YEps
ดัดแปลงจาก 2 um plasmid (พิเศษ) ของ yeast
 ขนาด 6 kb
 มี resistant gene ต่ อ inhibitors เช่ น copper และ
methotrexate
 marker คือ leu2 gene
 ใช้ เป็ น cloning vector ใน eukaryote
 Transform yeast

1

Yeast
cloning
โดยใช้
plasmid
ทีม่ ี LEU2
gene
เป็ น
marker
1
1.3 Ti plasmid
Ti plasmid หรื อ T-DNA ใน Agrobacterium tumefaciens
ในดิน
 integrate เข้ า plant chromosomal DNA
 ทาให้ เกิดเนื้องอกในพืช (callus) หรื อ cancer growth หรื อ
crown gall ในพืช

1
Gene cloning โดย
ใช้ Ti plasmid
 เพื่อให้ T-DNA
(tumor DNA) ใน
bacteria infect
(แทรก) เข้ า
chromosome ของ
พืช --> crown gall
--> ชักนาให้ เจริญ
เป็ นต้ นพืช

2
2. Bacteriophage vectors
Double-stranded virus ทีบ่ างระยะของวงจรชีวติ อยู่ในรู ป
Linear duplex
 ส่วนมากใช้ Bacteriophage Lambda (l) ขนาด ~
50 kb
 l มี genes ~ 50 % อยู่ 2 ข้ างของ linear duplex ทีจ
่ าเป็ น
ต่ อ growth
 บริ เวณกลางไม่ จาเป็ นต่ อ growth สามารถตัดออกได้
2
 l package DNA ให้ เป็ น circular form ได้ 78-105 %



การใช้ phage l
cos
เป็ น cloning vector
cos
ส่ วนกลางเป็ นส่ วนที่
ไม่ จาเป็ นในการ
ดารงชีพของ phage
จึงสามารถเอา
foreign DNA ใส่ เข้ า
ไปแทนได้
2
ใน Linear duplex ทีบ่ ริเวณปลายสุ ดทั้ง 2 ข้ างของเส้ นเป็ น
ช่ วง Single strand ขนาด 12 nucleotides เรียกว่ า
Cohesive ends หรื อ COS sites
 Cos sites ทา complementary ต่ อกัน ให้ ได้ circular
duplex DNA ก่ อน pack เข้ า capsule กลายเป็ น
bacteriophage ใหม่


l vector รับ insert ได้ 12-25 % จึงเหมาะสาหรับใน
การทา cloning ของ eukaryotic genes ซึ่งส่ วนมี
ขนาดใหญ่ เช่ น ใช้ ทา Genomic library
2
2.2 M13 vector
Single-stranded phage
 รั บ insert ทีเ่ ป็ น
single-stranded DNA
ระหว่ าง 300-1000 bases
 Rolling circle replication ให้ double strand
 ออกจาก bacteria ในรู ป single strand
 เหมาะสาหรั บใช้ cloning เพื่อ sequence DNA

2
3. Cosmid vector
Vector ทีส่ ร้ าง (construct) จากส่ วนของ
1. Plasmid : drug-resistant marker, origin of replication
และ restriction sites จึงมี replication ได้ เหมือน
plasmid
2. Phage : cos sites สาหรับ packaging cloned DNA ให้
เป็ น phage chromosome ใน in vtro
2
cosmid มีขนาด 4-6 kb
 construct ให้ มี
polycloning site
 cosmid สามารถรั บ insert
foreign DNA ได้ ระหว่ าง
35 - 50 kb
 เหมาะในการ clone gene
ขนาดใหญ่ ของ eukaryote

2
4. Pagemid vector
Vector ที่ construct ให้ มี คุณลักษณะคล้ าย cosmid คือ มี
ทั้งลักษณะของ phage และ plasmid
 มี multiple cloning site insert เข้ าที่ lacZ gene
 มี origin of replication จาก single-stranded f1 คล้ าย
M13 ทาให้ package ได้ single-stranded phagemid DNA

2
Bluescript vector / pBS ใช้ เป็ น Transcription vector
 มี Multiple cloning site
 มี 2 promoters คือ
 T3 promoter ข้ างหนึ่ง และ
 T7 promoter อีกข้ างหนึ่ง
 สามารถ transcribe RNA ใน in vitro
 ใช้ ศึกษา translation in vitro

2
5. Artificial chromosome
เป็ น Construct เพีอ่ ทา cloning ใน yeast เรียกว่ า Yeast
Artificial chromosome / YAC
 เป็ น mini-chromosome ประกอบด้ วย
 1 centromere, 2 telomeres, origin of replication,
และ seletable marker gene(s)


ใช้ ศึกษา chromosome segregation ระหว่ าง meiosis
และ cloning DNA ขนาดใหญ่ ได้ ถึง 150 kb
2
Yeast Artificial chromosome / YAC
3
Restriction Endonuclease
recognize specific nucleotide sequences
 ตัดระหว่ าง 4-8 nucleotide ลาดับเฉพาะแต่ ละชนิด

3

Resstriction
enzymes
ตัด DNA ให้
ปลาย 2 แบบ
Blunt end
 Sticky end

3
DNA ligase
เชื่ อมต่ อระหว่ าง
2 nucleotide ของ
2 DNA โมเลกุล
 Sticky ends :
efficiency ค่ อนข้ าง
ดี
 Blunt ends :
efficiency น้ อยกว่ า

3
3
DNA library
คือ ห้ องสมุด หรื อ sets ของ cloned DNA ใน vectors ที่
เก็บไว้ ท้งั หมดใน host cells เพื่อใช้ ตรวจหาและศึกษา
genes ภายหลัง
 แบ่ งเป็ น 3 ประเภท
1. Genomic DNA library : ห้ องสมุด cloned DNA ของ 1
genome ซึ่งคือ genes ทั้งหมดของ สิ่ งมีชีวติ ใด ๆ เช่ น
human genome library
2. cDNA library : ห้ องสมุด cloned cDNA ของ structural
gene ใด ๆ
3. Chromosome-specific DNA library : ห้ องสมุด cloned
DNA ของ 1 chromosome

3
3
Application ของ Gene Recombinant Technology
1. Physical maps / restriction maps of DNA
molecule
หาแผนผังตาแหน่ งของ gene บน chromosomes
2. Nucleotide sequences of gene
หาลาด ับ base ของ gene
3. In vitro site-specific mutagenesis
ศึกษาการทางาน และการควบคุม
ของ genes โดย การทา mutation เฉพาะ base(s)
3
4. Identification of genes
ชี้บอก gene และรายละเอียดของ gene เช่ น gene ทีท่ าให้
เป็ นโรค
5. Human gene therapy
ร ักษาโรคทางพันธุกรรม โดยหลัง
วิเคราะห์ ได้ ว่า gene ใดเป็ นเหตุของโรค นา gene หรื อ
ผลผลิต (protein) ของ gene นั้นใส่ หรื อใช้ ทดแทน
ป้ องก ันโดยไม่ให้ gene(s) เป็ นสาเหตุของโรค
รุนแรงถ่ ายถอด
3
6. Production of proteins
ผลิต proteins, hormones และ enzymes ใช้ bacteria
ซึ่งเป็ น host ของ recombinant DNA เป็ นผู้ผลิตให้ โดยไม่
ต้ องสกัดจากสิ่ งมีชีวติ ชั้นสู งโดยเฉพาะสั ตว์
7. Transgenic organisms (plants & animals) หรื อ GMO
(Gene modified organism)
crown gall, herbicide และ insecticide resistant plants
เช่ น
่ั
ข้าว ข้าวโพด ถวเหลื
อง มะเขือเทศ มัน
ฝรั่ง หนู (ทดลอง) ฯลฯ
9. Paternity tests & forensic application
DNA fingerprints หาความเป็ นพ่อ-แม่ หาคนร้ าย
3
ตัวอย่ างการประยุกต์ ใช้
Gene Recombinant Technology
4
Genetic
Maps
4
DNA Sequencing
4
Cloning Growth Hormone Gene
4
Gene Therapy : รักษาโรคทางพันธุกรรม
4
Transgenic Animal
การเตรียมฉีด DNA ด้ วย
microinjection เข้ าไปในไข่
Transgenic mouse (ซ้ าย)
4
Transgenic Plants
Glyphosate-tolerant petunia Luciferase plant พืชเรื องแสง
4
DNA Fingerprintings : Identify บุคคล / พ่อ-แม่
การเตรียม DNA
Fingerprintings
4
หาพ่อ - แม่
หาคนร้ ายจากผู้ต้องสงสัย
4
Cell Cloning
ให้ เป็ น cloned animal
1. แยก cell จากสั ตว์ ทโี่ ตเต็มวัยแล้ ว
2. Fuse รวมกับ unfertilized egg ที่ ได้ เอา nucleus ออก
แล้ ว
3. กระตุ้นให้ แบ่ งเซลล์ กลายเป็ นตัวอ่ อน (embryo)
4. นาฝากใส่ มดลูกของสั ตว์ ตัวเมียทีพ่ ร้ อมตั้งครรภ์ l

4
5