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Master in Medicina della Riproduzione Padova, 29-31 maggio 2013 Indagini microbiologiche nella coppia infertile Prof. Luisa Barzon Dip. Medicina Molecolare Università di Padova Trends in STD epidemiology Epidemiologia delle STD in Italia 800 700 Uretriti NG-NC 600 Sifilide latente 400 Infezione da Clamidia 300 Gonorrea 200 Infezione da Trichomonas 100 Sifilide primaria e secondaria 0 19 90 19 91 19 92 19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 N. casi 500 Fonte: Rete Nazionale Sorveglianza IST Epidemiologia delle STD in Italia Infezioni vaginali NG-NC Condilomi acuminati Uretrite NG-NC Sifilide latente Herpes genitale Infezioni da clamidia Gonorrea Sifilide primaria e secondaria Altro 0 5 10 15 20 25 30 35 Fonte: Rete Nazionale Sorveglianza IST Infezioni genitali e infertilità maschile Patogeni ST (virus e batteri) sono riscontrati frequentemente nel seme di maschi infertili asintomatici. La presenza di patogeni si associa ad alterazioni dei parametri seminali. Bezold et al. Fertil Steril (2007) Bacterial infections have been associated with testicular damage and infertility • Inflammation: Reactive oxygen species and cytokines • Reduction of accessory gland function • Obstruction of sperm transport • Dysregulation of spermatogenesis Bhushan et al. J Reprod Immunol 2009 E. coli decreases sperm motility and viability • E. coli adheres to sperm cells and alters morphology and motility. • E. coli specifically induces sperm cell apoptosis/necrosis, alteration of mitochondrial membrane potential and DNA damage. • E. coli produces and soluble factor, sperm immobilization factor (SIF), which causes sperm immobilization without agglutination (Prabha et al. Adv Urol 2010). N. gonorrhoeae may cause infertility through orchitis or obstruction in the urogenital tract • N. gonorrhoeae can survive in the host epithelium. • No evidence of direct damage on sperm cells. • Urogenital tract infection and inflammation may involve the testis and/or led to obstruction of sperm transport C. trachomatis causes DNA fragmentation and induces sperm cell apoptosis • C. trachomatis LPS decreases sperm cell motility and induces apoptosis via caspase (500 more active than E. coli LPS). Attachment of green fluorescent Chlamydia trachomatis elementary bodies to human sperm (Eley A. Microbiol Today 2003). LPS released from elementary bodies CD14 Apoptosis TLR ROS U. urealyticum reduces sperm concentration • Isolated in 15-40% of infertile males, more frequently than in fertile males (Busolo et al. 1984; de Jong et al. 2000). • It binds to sperm cell membrane, alters sperm motility and morphology, and decreases sperm viability (Reichart et al. 2000, Sanocka-Machiejewka et al. 2005). • It alters glycolipid metabolism in the early primary spermatocytes (Ma & Xu et al. 2004). • It increases sperm cell DNA fragmentation and apoptosis (Xu et al. 2001). Binding of U. urealyticum to human sperm cells (Reichart et al. 2000) Mycoplasma hominis decreases sperm concentration and alters sperm morphology • Serm cell adhesion • Sperm cell invasion • No marked effect on cell viability • Long-term implications on fertility Morphologic alterations observed in M. hominis -infected human spermatozoa. Diaz-Garcia et al. Hum Reprod 2006 C. albicans inhibits sperm motility and induces apoptosis • C. albicans quorum-sensing molecules induce acrosome loss and cell death in human spermatozoa (Rennemeier et al. Infect Immun 2009) • C. albicans and its filtrates reduce the motility and alter the ultrastructure of human spermatozoa (Tian et al. Int J Androl 2007) • Adhesion of spermatozoa via the head to C. albicans and agglutination (Tian et al. Int J Androl 2007) • C. albicans infection may decrease the functional competence of spermatozoa by reducing motility and membrane mitochondrial potential and by promoting molecular apoptosis mechanisms (Burrello et al. Reprod Biomed Online 2009). HPV infection and infertility • In women, treatment for HPV lesions is a cause of decreased fertility. • HPV found in sperm head of young adult males affects the progressive motility. • High prevalence of infection in the semen of patients with risk factors for HPV. • HPV seems to be preferentially located in sperm or exfoliated cells, with different effects on sperm motility. • Infertile patients had a higher HPV DNA prevalence in sperm cells than other patient groups. Foresta et al. Fertil Steril 2010a, Foresta et al. Fertil Steril 2010b Infezione da HIV e infertilità • L’infezione da HIV è stata associata ad oligospermia e ad anomalie spermatiche (Coll et al. Reprod Biomed Online 2007) • L’entità delle anomalie sembra essere inversamente proporzionale al livello di progressione della malattia (Politch et al. Fertil Steril 1994, Nicopoullos et al. Hum Reprod 2004). • Attualmente, molte delle anomalie spermatiche che si osservano nei pazienti HIV-positivi sono dovute agli effetti della terapia antiretrovirale (Barboza et al. Arch Androl 2004). • Nelle donne HIV+ l’infertilità è associata a PID e a alterazioni endocrine nelle fasi avanzate di malattia. C. trachomatis e infertilità femminile • L’infezione colpisce prevalentemente donne <25 anni • Sintomi generalmente lievi, aspecifici o assenti (infezioni asintomatiche: 7080% nella donna, 25-50% nell’uomo). • Cervicite muco-purulenta, che può estendersi anche all’uretra e al retto. • Se non adeguatamente trattata, esito in PID nel 25-30% dei casi. • L’infezione da C. trachomatis è responsabile di ~ 40% delle gravidanze extrauterine, mentre il 60% delle donne con infertilità tubarica presenta evidenza sierologia di pregressa infezione da C. trachomatis. • Anche le infezioni subcliniche possono provocare infertilità. Neisseria gonorrhoeae e infertilità femminile • La donna è più suscettibile dell’uomo all’infezione da N. gonorrhoeae. La mucosa del canale cervicale è quella più suscettibile all’infezione gonococcica. • Il 50-80% delle donne con infezione endocervicale non presenta sintomi specifici almeno nelle fasi iniziali. Nella maggior parte dei casi è la scoperta dell’infezione nel partner che spinge la donna ad eseguire un controllo. • Anche nella donna l’infezione può manifestarsi con un’uretrite, accompagnata da disuria e bruciori minzionali, o con una cervicite, a volte eritematosa ed erosiva. • La principale complicanza è rappresentata dalla PID (~45% delle pazienti con cervicite gonococcica non trattata). Micoplasmi urogenitali • I principali microplasmi isolati nel tratto urogenitale sono: M. hominis, M. genitalium, M. fermentans, M. penetrans, M. spermatophilum, M. primatum, U. urealyticum. • Nella donna le principali malattie infettive da micoplasmi sono: salpingiti, cerviciti, febbri post-partum e post-aborto, ascessi tubo-ovarici. Responsabili del 1% dei casi di PID. La presenza di M.genitalium sia associa frequentemente a uretrite e cervicite. Può essere identificato nell’endometrio di donne con PID. Presenti nel LA nel 20-30% dei casi di parto pretermine. • Nell’uomo M.genitalium e U.urealyticum sono responsabili di uretriti NG, mentre ancora incerto è il ruolo nelle epididimiti, prostatiti acute o croniche e nell’infertilità. Possono aderire alle cellule e provocare alterazioni morfologiche; per questo associati ad infertilità. Diagnostica microbiologica delle infezioni genitali Fase preanalitica Prima dell’esecuzione del prelievo è necessario che il paziente: • si sia astenuto dai rapporti sessuali nelle 24 ore precedenti l’esame; • abbia cessato ogni terapia chemio-antibiotica, sia locale sia generale, dai 3 ai 7 giorni antecedenti (per gli esami eseguiti con tecniche molecolari sarebbe opportuno un intervallo di 4 settimane); • per il tampone uretrale, si sia astenuto dall’urinare, e per i maschi anche dall’eiaculare, per almeno 3 ore prima del prelievo; • esegua il prelievo almeno 3-4 giorni dalla fine delle mestruazioni; • non esegua irrigazioni vaginali nelle 24 ore precedenti l’esame. Processare i campioni più presto possibile. Usare idonei terreni di trasporto. Conservare a 4°C non oltre le 48 ore. Diagnostica microbiologica delle infezioni genitali Fase preanalitica • Prelievo vaginale: dal fornice posteriore, previa introduzione di uno speculum bivalve sterile. Per esame microscopico “a fresco” e dopo colorazione Gram delle colture. Idoneo al test molecolare per C. trachomatis e N. gonorrhoeae. • Prelievo vulvare: Nel caso di sintomatologia a carico dei genitali esterni (micosi, infezione da HSV, condilomi). • Prelievo endocervicale: eseguire previa introduzione di speculum bivalve sterile; il tampone è inserito nell’endocervice per circa 1 cm e ruotato per qualche secondo. Per esame microscopico ed esame colturale per N. gonorrhoeae e micoplasmi urogenitali e ricerca di C. trachomatis. I campioni esocervicali sono più idonei per la ricerca di HSV e HPV. Diagnostica microbiologica delle infezioni genitali Fase preanalitica • Prelievo uretrale: • • Nell’uomo, il prelievo uretrale è indicato in caso di: – secrezione purulenta o vischioso-filamentosa dal meato uretrale, con o senza sintomatologia dolorosa; – isolamento nella partner microrganismi tipicamente responsabili di IST; – screening per l’infertilità. – Non è invece indicato nella diagnosi delle prostatiti. Nella donna, il prelievo uretrale è indicato – in presenza di sintomatologia uretrale con urinocoltura negativa – In caso sindrome uretrale acuta. Per esame microscopico (valutazione della flogosi e per confermare un eventuale sospetto di uretrite nell’uomo), nonché alla ricerca di C. trachomatis, N. gonorrhoeae, micoplasmi urogenitali, T. vaginalis ed eventuali altri patogeni sospetti. Diagnostica microbiologica delle infezioni genitali Fase preanalitica • Liquido seminale: Il prelievo di liquido seminale è finalizzato alla ricerca di C. trachomatis, T. vaginalis, N. gonorrhoeae e altri microrganismi patogeni. E’ opportuno eseguire le diverse ricerche microbiologiche contemporaneamente su liquido seminale ed urina per differenziare meglio un’infezione delle vie seminali da una delle vie urinarie. Results of microbiological tests in semen specimens Microbiology and Virology Lab, Padova, 2008-2011 Test No. patients No. positive % positive Microscopy 6,881 599 9.54 Bacteria culture 6,881 967 16.35 Fungi culture 6,881 17 0.25 Mycoplasma culture 5,384 276 5.40 Chlamydia trachomatis DNA test 5,611 56 1.01 HPV DNA test 1,105 350 46.36 Most commonly isolated bacteria in sperm Microbiology and Virology Lab, Padova, 2008-2011 Bacteria N. isolates % isolates Enterococcus faecalis 304 25,4 Ureaplasma urealyticum 255 21,4 Escherichia coli 216 18,1 Haemophilus parainfluenzae 139 11,6 Proteus mirabilis 44 3,7 Morganella moraganii 35 2,9 Citrobacteri koseri 34 2,9 Streptococcus agalactiae 33 2,7 Klebsiella oxytoca 23 1,9 Corynebacterium glucuronolyticum 22 1,8 Pseudomonas aeruginosa 19 1,6 Klebsiella pneumoniae 14 1,2 Staphylococcus haemolyticus 12 1,0 Mycoplasma hominis 12 1,0 Enterococcus faecium 4 0,3 Citrobacter freundii 4 0,3 Serratia marcescens 3 0,2 Enterobacter aerogenes 3 0,2 Enterobacter cloacae 2 0,2 Proteus vulgaris 2 0,2 Citrobacter braakii 2 0,2 Other species 11 1,1 Significant bacteriospermia – Growth of >103 cfu/mL pathogenic bacteria – Growth of >104 cfu/mL non-pathogenic bacteria (in seminal plasma diluted 1:2 with saline) Diagnosi microbiologica di gonorrea Diagnosi diretta La diagnosi di infezione si basa su: • Esame microscopico previa colorazione (Gram, Giemsa, Blu di metilene) • Esame colturale • Test rapidi per la ricerca di antigeni • NAAT Diagnosi microbiologica di infezione da micoplasmi Esame colturale in microgallerie • • Semina del materiale prelevato in microgallerie contenenti substrati ed antibiotici in forma liofilizzata, che vengono incubate a 37°C per 48 ore. L’identificazione avviene dopo incubazione sulla base dello studio dell’attività biochimica e alla resistenza agli antibiotici. Diagnosi microbiologica di infezione da C. trachomatis Oakeshott et al. BMJ 2010