Download Western Blot

Southern,
Northern e
Western Blot
Teorias e Aplicações
Gerhard Wunderlich e Carsten Wrenger
BMP-5777
Western Blot:
Proteínas
• Bloqueio: reduz as interações não específicas entre membrana e o anticorpo
• 1ª anticorpo: (monoclonal ou policlonal) é específico para a proteína de interesse
• 2ª anticorpo: (anti IgG espécie-espécifico) conjugado com uma enzima que
permite a identificação visual
• Detecção: colorimétrica
quimioluminescente
fluorescente
radioativa
Western Blot:
- Proporciona um método para comparações de
proteínas a nível de expressão
- Diagnósticos médicos (ex. Teste confirmatório para HIV,
além de outras doenças infecciosas, auto-imunes,
alergias, e outros)
Southern Blot:
DNA
• Denaturação: digestão da dupla fita do DNA com enzimas de restrição e o
tratamento do gel com solução alcalina (NaOH)
• Transferência do ssDNA para uma membrana: A membrana é aquecida
(no caso da nitrocelulose) ou exposta a radiação ultravioleta (no caso do
nylon) para ligar permanentemente o DNA à membrana.
• Sonda Hibridizadora: é uma molécula de DNA ou RNA cuja seqüência é
conhecida (idêntica ou complementar a seqüência de interesse). A sonda
de DNA é marcada normalmente incorporando-se átomos radioativos ou
ligando-se corantes quimioluminescentes
• Revelação: por uma auto-radiografia em um filme de raio-x, ou pelo
aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada.
Southern Blot:
- Análises de sequências genomicas, para verificar se
uma determinada seqüência de DNA está ou não
presente em uma amostra de DNA analisada
- Alterações em um único nucleotídeo; detecção de
inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de
fragmentos do DNA; fragmentos de cromossomo.
Northern Blot:
mRNA
•
Denaturação: adição de formaldeído, que funciona como um desnaturante.
•
Transferência do RNA para uma membrana: aquecimento (no caso da
nitrocelulose) ou exposição a radiação UV (no caso do nylon)
•
Altamente sensível a RNAses
•
Sonda Hibridizadora: é uma molécula de DNA ou RNA cuja seqüência é
conhecida e complementar a seqüência de interesse, marcada
normalmente com átomos radioativos ou corantes quimioluminescentes
•
Revelação: exposição a filme de raio-x, ou pela detecção de fluorescência.
Northern Blot:
• Úteis em estudo de expressão gênica (verificar se um determinado gene
de um genoma é ou não transcrito em RNA)
• Estudo de diferentes tecidos
• Estudo do padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento
do indivíduo
Professor Sir Edwin M. Southern
Southern, E. M. (1975). "Detection of specific sequences among DNA
fragments separated by gel electrophoresis". Journal of molecular
biology 98 (3): 503–517
H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS