Download Stanovení proteinů

Stanovení koncentrace
(kvantifikace) proteinů
Bioanalytické metody
(KBC/BAM)
Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc.
Úvod






Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou
založena na možnostech pro vlastní analýzu, množství a
charakter analyzovaného proteinu, přítomnosti interferujících
látek a požadavkem na přesnost.
Např. Lowryho metoda je velmi citlivá, ale na druhé straně je
dvoustupňová a vyžaduje minimální dobu inkubace 40 min.
Metoda dle Bradfordové je mnohem citlivější a výsledek můžeme
znát již za 5 minut, avšak pro proteiny s velmi nízkým obsahem
argininu je nepoužitelná.
Problém odhadu obsahu a charakteru proteinů je v tom, že jako
standard používáme čistý protein, ale analyzujeme obvykle směs,
nebo protein o neznámém aminokyselinovém složení.
Kriteria budou diskutována u jednotlivých metod.
Literatura pro podrobnější studium: Stoscheck, C.M.
Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69
(1990).
Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů
Velmi důležitá analýza bez drahých instrumentů.
Dnes se preferují spektrofotometrické metody,
stanovení dusíku (po mineralizaci) při Kjeldahlově
metodě, nebo gravimetrie a refraktometrie již patří
minulosti.
1. Biuretová metoda; reakce peptidové vazby s Cu(II) v
alkalickém prostředí. Tvoří se modrofialové zbarvení, lmax
= 540 nm. Činidlo obsahuje CuSO4, vínan sodno-draselný a
NaOH. Nutný standard (BSA, ovalbumin), metoda nezávisí
na aminokyselinovém složení, ale je málo citlivá (cca 10 100 mg/mL). Ruší např. NH4+, Tris.
2. Lowryho metoda, od roku 1951, modif. 1972, citlivost 1
mg/mL, jedna z nejcitovanějších prací (viz obr.). Citlivost
biuretové metody zvýšena přídavkem Folin-Ciocalteauova
fenolového činidla.
biuret 
Lowry
Lowryho metoda mnohem více závisí na složení proteinu. K
reakci peptidové vazby s Cu2+ přispívá redukce
fosfomolybdenanů a fosfowolframanů tyrosinem (ale i
tryptofanem a cysteinem). Principem je nejprve provedení
biuretové reakce a pak přídavek Folinova činidla.
Měří se při 650 nm (750 nm), široká absorpce, pro
kalibraci nutné standardy (BSA, OVA). Vyšší citlivost než
biuretová reakce (2-100 mg/mL), zbarvení však není v
čase stabilní. Ruší např. NH4+.
3. BCA metoda; od 1985, citlivost 0, 5 mg/ml, využívá
sodné soli kyseliny bicinchoninové (BCA), která
komplexuje ionty Cu(I) tvořené reakcí peptidové vazby s
Cu(II). Činidlo se připravuje smísením roztoků sodné soli
BCA v alkalickém prostředí (100 dílů) a CuSO4 (1 díl). Měří
se při 562 nm, citlivost na úrovni Lowryho metody, menší
interference (NH4+ ano). Kalibrace na standardy (BSA).
BCA method














Colorimetric method; read at 562 nm
Compatible with most ionic and nonionic detergents
Faster and easier than the Lowry method
All reagents stable at room temperature for 2 years
Working reagent stable for 24 hours
Linear working range for BSA from 20-2,000 µg/ml
Minimum detection level of 5 µg/ml with the enhanced protocol
Adaptable to microplates
Less protein-to-protein variation than dye-binding methods
Applications:
Studying protein:protein interactions
Measuring column fractions after affinity chromatography
Estimating percent recovery of membrane proteins from cell
extracts
High-throughput screening of fusion proteins
Reaction schematic for the bicinchoninic acid (BCA)containing protein assay.
Time comparison of BCA Protein Assay Reagent vs.
Lowry Protein Assay

BCA Protein Assay Reagent
1. Mix reagents 1 minute
2. Add sample and incubate 30 minutes
3. Read at 562 nm 1 minute
Total BCA Time: 32 minutes
Lowry Protein Assay
1. Make reagents 70 minutes
2. Add sample and incubate 20 minutes
3. Add Folin Reagent 1 minute
4. Incubate 30 minutes
5. Read at 750 nm 1 minute
Total Lowry Time: 122 minutes
4. Metoda Bradfordové; principem je adsorpční vazba
barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu
proteinu. Citlivost 1 mg/mL. Závisí na obsahu bazických
(zvl. Arg), ale i aromatických aminokyselin.
Metoda je velmi populární, protože je rychlá (5 min),
množství látek však interferuje, negativně zejména
detergenty (SDS, Triton). Nedává tedy tak spolehlivé
výsledky jako obdobně citlivá BCA metoda, kde tyto látky
neruší. Citlivost je 5 x vyšší než u Lowyho metody, lineární
kalibrace max. po 20 mg proteinu.
Činidlo (vodný roztok) obsahuje barvivo, ethanol a H3PO4.
Barva hnědá, po reakci s proteinem intenzivně modrá, lmax
= 595 nm.
Všechny dosud zmíněné metody jsou destruktivní,
vzorek je pro další analýzu nepoužitelný!
This high performance Bradford reagent exhibits substantially
increased linearity of response, and only half the expected
protein-to-protein variation of other commercial Bradford
protein assays.
Detects protein concentrations from 1-1,5 µg/ml
Ready-to-use dye-binding reagent formulation
 Fast (almost immediate) color development; read at
595 nm
 Compatible with reducing sugars, reducing substances
and thiols (Table 1.)
 Refrigerated reagent is stable for 2 years
 Superior linear response over the range of 125-1,500
µg/ml
 Adaptable to microplates
 Micro protocol useful for protein concentrations from
1-25 µg/ml



Use of Coomassie G-250 Dye in a colorimetric reagent
for the detection and quantitation of total protein
was first described by Dr. Marion Bradford in 1976.
In the acidic environment of the reagent, protein
binds to the coomassie dye. This results in a spectral
shift from the reddish/brown form of the dye
(absorbance maximum at 465 nm) to the blue form of
the dye (absorbance maximum at 610 nm) (Figure 1).
The difference between the two forms of the dye is
greatest at 595 nm, so that is the optimal wavelength
to measure the blue color from the coomassie dyeprotein complex. If desired, the blue color can be
measured at any wavelength between 575 nm and 615
nm. At the two extremes (575 nm and 615 nm) there
is a loss of about 10% in the measured amount of
color (absorbance) compared to that obtained at 595
nm.

Development of color in coomassie dye-based
(Bradford) protein assays has been associated with
the presence of certain basic amino acids (primarily
arginine, lysine and histidine) in the protein. Van der
Waals forces and hydrophobic interactions also
participate in the binding of the dye by protein. The
number of Coomassie dye ligands bound to each
protein molecule is approximately proportional to the
number of positive charges found on the protein. Free
amino acids, peptides and low molecular weight
proteins do not produce color with coomassie dye
reagents. In general, the mass of a peptide or protein
must be at least 3,000 daltons to be assayed with
this reagent. The assay is performed at room
temperature and no special equipment is required.
Simply add the sample to the tube containing reagent
and the resultant blue color is measured at 595 nm
following a short room-temperature incubation. The
coomassie dye containing protein assay is compatible
with most salts, solvents, buffers, thiols, reducing
substances and metal chelating agents encountered in
protein samples.
Nevýhoda

The main disadvantage of coomassie-based
(Bradford) protein assay is its incompatibility with
surfactants at concentrations routinely used to
solubilize membrane proteins. In general, the
presence of a surfactant in the sample, even at low
concentrations, causes precipitation of the reagent.
Since the coomassie dye reagent is highly acidic, a
small number of proteins cannot be assayed with this
reagent due to their poor solubility in the acidic
reagent. Also, coomassie reagents result in about
twice as much protein:protein variation as copper
chelation based assay reagents. In addition,
coomassie dye stains the glass or quartz cuvettes
used to hold the solution in the spectrophotometer
while the color intensity is being measured. (Cuvettes
can be cleaned with strong detergent solutions and/or
methanol washes, but use of disposable polystyrene
cuvettes eliminates the need to clean cuvettes.)
Typical color response curves for BSA and BGG
using the Coomassie Plus – The Better Bradford
Assay Reagent (BGG=bovine gamma globulin) .
Linearita Bradfordové metody
 The
Better Bradford Assay is linear
from 125 to 1,000 µg/ml. When using
bovine gamma globulin (BGG) as the
standard, the Coomassie Plus – The
Better Bradford Assay is linear from
125 to 1,500 µg/ml.
Coomassie Dry Protein Assay Plates
5. Přímá spektrofotometrická stanovení (UV oblast);
díky přítomnosti chromoforů v molekulách proteinů,
které absorbují v UV oblasti spektra. Velkou výhodou
je, že jde o nedestruktivní metodu. Pracuje se s
křemennými kyvetami, nikoli sklo ani plast.
V blízké UV oblasti (280 nm) není velká citlivost – 50 mg /
mL, v daleké UV oblasti (205 nm) pak dochází ke značné
interferenci. Samozřejmě je zde velká závislost na
aminokyselinovém složení proteinu. Vzhledem k tomu, že
UV absorpce je dána aromatickými AK (hlavně Trp a Tyr),
je nutná jejich přítomnost. Interference širokého
absorpčního pásu nukleových kyselin (lmax = 260 nm)
se eliminuje měřením při dvou vlnových délkách a
početní korekcí.
V daleké UV oblasti se využívá vlnová délka 205 nm
(maximum absorpce peptidové vazby je při 192 nm).
Molární absorpce
Vlnová délka (nm)
Při měření v daleké UV oblasti je nutno precizně volit
pufr (aby neabsorboval), vzorky by měly být zbaveny
malých částic (a tím i opalescence) centrifugací, pokud
možno bez velkého obsahu O2.
Vzorce pro přímé UV stanovení:
c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260
c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51
c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01
c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)]
6. Edelhochova metoda; při znalosti aminokyselinového
složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu
e280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu
v molekule.
e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1.cm-1)
7. Fluorescenční stanovení; fluorimetrické stanovení
proteinů je založeno na reakci primárních aminoskupin
v proteinu (Lys, N-koncová aminoskupina) s oftalaldehydem. Citlivost metody může být zvýšena
hydrolýzou proteinů před měřením. Ruší pufry s
obsahem primárních aminoskupin (Tris), nejlépe použít
borátový pufr, pH 10.4.
CHO
CHO
Měří se po přídavku hydroxidu sodného, excitační
vlnová délka 340 nm, emise mezi 440 a 455 nm. Každý
vzorek se měří pouze jednou, ozáření snižuje intenzitu
fluorescence.
Protocol for Quantiation of Proteins using
NanoOrange™
 Protein
concentrations as low as 10
ng/mL can be measured. This level of
sensitivity is much superior to
spectrophotometric techniques such as
the BCA method (0.5 µg/mL), the
Bradford assay (1 µg/mL), the Lowry
assay (1 µg/mL), or 280 nm absorbance
(50 µg/mL). (1-4)The NanoOrange™
assay also shows less protein-to-protein
variability than the Bradford assay.
Protocol for Quantiation of Proteins using NanoOrange™
Invitrogen.

To perform a protein assay, the protein sample is simply added
to the NanoOrange™ reagent in a specialized diluent and this
mixture is heated at 95° C for ten minutes. Fluorescence can be
measured as soon as the mixture has cooled to room
temperature. Alternatively, samples can be read up to six hours
after preparation with no loss in sensitivity, as long as samples
are protected from light.

The NanoOrange™ reagent is virtually nonfluorescent in
aqueous solution, becoming strongly fluorescent at about
570—590 nm upon interaction with proteins, when excited at
about 470—490 nm. Detection of the fluorescence using the
TD-700 fluorometer equipped with a fluorescein filter kit
allows protein concentrations from 10 ng/mL to 10 µg/mL to
be accurately measured relative to a standard curve
Full-range calibration plot for bovine serum albumin (BSA) using
the TD-700 Fluorometer and the NanoOrange™ Protein
Quantitation Kit.
Low-range calibration plot for bovine serum albumin (BSA) using the
TD-700 Fluorometer and the NanoOrange™ Protein Quantitation Kit.
Stanovení proteinů (Protein quantitation)













Absorpce při 280 nm (semi-kvantitativní)
Absorpce způsobená tryptofanovými (tyrosinovými) zbytky.
Výhoda: rychlá, nedestruktivní
Nevýhody:
ruší látky s absorpcí při 280 nm
různá absorpce různých proteinů
z důvodu různých obsahů Trp
Výpočet: A280 = 1 odpovídá 0.5 – 2 mg.ml-1 proteinu
Kolorimetrické metody
(Mikro-)biuretová metoda: Komplex Cu2+ s peptidovými vazbami (-CONH-) v alkalickém prostředí  Cu+-protein komplex, absorbance při 570
nm
Lowry stanovení: Přenos elektronů z navázaných měďnatých iontů a z
aromatických vedlejších skupin na Folinovo činidlo
Stanovení dle Bradfordové: Adsorpce Coomassie Brilliant Blue G250 na
protein (hlavně Arg, ale také His, Lys, Trp, Tyr a Phe vedlejší řetězce)
Stanovení s bicinchoninovou kyselinou: chelatace měďného iontu s BCA
Srovnání nejběžnějších metod stanovení proteinů
Stanovení Citlivost Přesnost
Interference
0 – 1 mg
Aminoskupiny
[Např. (NH4)2SO4]
Biuret
Lowry
Bradford
BCA
Vysoká,
nezávislá na
aminokyselinovém složení
0 – 0.1 mg Částečně
závislá na
aminokyselinovém složení
0 – 0.01 mg Závislá na
aminokyselinovém složení
0 – 0.05 mg Většinou
nezávislá na
aminokyselinovém složení
Kyseliny, chelátory
(EDTA), reduktanty
(DTT, phenol),
(NH4)2SO4
Detergenty
(SDS, Triton X100,
mýdlo)
Redukující látky (2merkaptoethanol,
DTT), chelátory
(EDTA)