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CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIO Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia Journal Club MicroRNA and Lung Cancer Università di Modena e Reggio Emilia CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIO Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia New Engl J Med 2005; June 9; 23:2446-2448 MicroRNA and Lung Cancer Matthias Eder, Michaela Scherr Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA and Lung Cancer • RAS e tumore polmonare • microRNA: definizione e funzione • Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA and Lung Cancer • RAS e tumore polmonare • microRNA: definizione e funzione • Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia LA TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA 1) Mutazioni puntiformi 2) Amplificazione genica 3) Traslocazioni cromosomiche 4) delezioni On ONCOGENE: carattere dominante ONCOSOPPRESSORE: carattere recessivo Oncosoppressori Oncogeni On Oncogeni Off Off Oncosoppressori Chronology of genetic and molecular lesions Normal Hyperplasia Metaplasia Dysplasia ISC Carcinoma 3p9p17pAneuploidy P53 mut Ras mut Telomerase + FHIT Rb C.Brambilla; Eur Respir J 2003; 21 Suppl.39, 36s-44s MAJOR MOLECULAR ALTERATIONS IN LUNG CANCER Clinics in chest medicine, march 2002 vol.23; n1:83 SCLC (%) NSCLC (%) Proto-oncogenes and growth stimulation Putative autocrine loops GRP/GRP receptor SCF/KIT RAS mutation MYC amplification HGF/MET NDF/ERBB <1 15-20 15-30 5-10 75-95 10-35 100 80-85 Other molecular changes BCL-2 expression Telomerase activity RAS Codifica per 3 proteine di 21-kD (H-Ras, N-Ras, K-Ras) che allo stato attivo legano GTP e allo stato inattivo legano GDP Ruolo di GTPasi intrinseca a ras (p21 quiescenza della proteina ras ) nel ritorno allo stato di Attivazione dell’oncogene K-ras mediante mutazione puntiforme al codone 12 (occasionalmente: 13 e 61) avviene nel 30% degli adenocarcinomi del polmone La mutazione è correlata all’abitudine tabagica Am J Respir Crit Car Med vol 161.pp 1355-1367, 2000 MUTAZIONE DI KRAS Clinics in Chest Medicine , march 2002 Vol 23 n°1:83 Drugs that inhibit mutant KRAS expression or function Drugs that block specific downstream signals Mutant KRAS active Inactive KRAS active KRAS GAP Inactive KRAS GTP GDP GTP GAP GDP + + Downstream signal transduction cascade Ras e stimoli proliferativi Cellular Signalling 2000; 12: 425-434 PDGFR EGFR a Integrine GPCR IL-2R b Ras AF-6 Gap Junctions RGL PI3K Raf PLD Akt MAPK Rin1 Effetti biologici BCR Mekk Nore1 JNK ? RAS Mutazione di K-RAS identificata in circa il 30% degli adenocarcinomi polmonari Associata a riduzione della sopravvivenza nei pazienti affetti da neoplasia polmonare NSCLC la presenza di mutazione di K-RAS è associata a resistenza al trattamento con gefitinib Journal of Clinica Oncol 2005;23:3227-3234 MicroRNA and Lung Cancer • RAS e tumore polmonare • microRNA: definizione e funzione • Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA • Piccoli frammenti di RNA (lunghezza 21-25 nucleotidi) non codificanti • Regolazione negativa della trascrizione genica mediante ibridazione a sequenze complementari nella regione 3’ (3’UTR) del mRNA target • Meccanismo simile nelle piante e negli animali • Alcuni miRNA sono alterati nelle neoplasie Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA: sintesi Nature 2005;435:745-746 RISC: RNA-induced silencing complex Interazione tra microRNA e mRNA target Journal of Cell Biology 2002; 156:17-21 Università di Modena e Reggio Emilia Funzione dei microRNA 3’ UTR mRNA 3’ UTR RISC mRNA microRNA RISC microRNA Clivaggio dell’mRNA Cell 2004; 116:281-297 Inibizione della trascrizione proteica Fig. 1. Correlation between FRAs and miRs Sito fragile:regione cromosomica soggetta a rottura spontanea o indotta Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004 Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences Fig. 3. MiRs as cancer players Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004 Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences MicroRNA and Lung Cancer • RAS e tumore polmonare • microRNA: definizione e funzione • Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia Let-7 • lethal-7 (let-7) è un membro della famiglia dei miRNA • La mutazione di let-7 non permette l’uscita dal ciclo cellulare comportando divisione delle cellule in modelli sperimentali • Nell’uomo sono stati identificati geni codificanti per let-7 che mappano regioni delete nelle neoplasie • la iperespressione di let-7 ha inibito la cerscita di linee cellulari di tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia microRNA e tumore polmonare • Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756 • Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005;120:635-647 Università di Modena e Reggio Emilia microRNA e tumore polmonare • Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756 • Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005;120:635-647 Università di Modena e Reggio Emilia Analisi della espressione di let-7 nel tumore polmonare Northen blot in linee cellulari di neoplasie polmonari HNLEC = human normal lung epithelial cell lines 20 linee cellulari di neoplasia polmonare 5S rRNA = controllo Northen blot in neoplasie polmonari in vivo Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756 Sopravvivenza di NSCLC in base all’espressione di let-7 143 NSCLC 105 adk cDNA primer Real-Time Reverse Transcription-PCR Hierarchical Clustering cDNA primer Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756 microRNA e tumore polmonare • Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756 • Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005;120:635-647 Università di Modena e Reggio Emilia LA PRESENZA DI let-7 INFLUENZA LA ESPRESSIONE DI RAS Controllo negativo Cellule HepG2 trasfettate con let-7 Quantificazione della immunofluorescenza di RAS Controllo negativo Cellule HeLa let-7 + transfettate con oligonucleotidi antisenso inibenti Quantificazione della immunofluorescenza di RAS let-7 E’ SCARSAMENTE ESPRESSO NEL TUMORE POLMONARE 20 neoplasie:polmone, colon,mammella NAT: normal adjacent tissue Northen blot 3 Ca squamocellulari Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA-Mediated Regulation of RAS Expression in Caenorhabditis elegans and Humans Eder, M. et al. N Engl J Med 2005;352:2446-2448 MicroRNA and Lung Cancer: Conclusioni • MicroRNA hanno ruolo fondamentale nella regolazione della espressione proteica • let-7 è in grado di inibire la trascrizione di RAS • Nel tumore polmonare è presente una ridotta espressione di let-7 • L’assenza di let-7 si associa ad una iperespressione di RAS e ad un peggioramento della prognosi nel tumore polmonare • Possibilità di terapia genica in futuro? Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA and Lung Cancer • RAS e tumore polmonare • microRNA: definizione e funzione • Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare Università di Modena e Reggio Emilia CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIO Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia Journal Club MicroRNA and Lung Cancer Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA AND Lung Cancer Università di Modena e Reggio Emilia RUOLO DELLA FARNESILTRANSFERASI NELLA ATTIVAZIONE DI RAS RAS CAAX RAS CAAX Proteolysis Isoprenyl group RAS PTI P-P Prenyltransferase + isoprenyl-pyrophosphate Competitive inhibitor of prenyltransferase K RAS Lys lys COCH3 N RAS COCH3 H RAS COCH3 Cell Membrane CANCER RESEARCH 63, 5656-5668, september 15; 2003 c (Rce-1) AAX
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