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Colture di cellule e di tessuti
animali
• Gli esperimenti biologici si possono
condurre sia su organismi interi che su
organi e tessuti animali isolati. Lavorando
su tessuti e organi gli esperimenti in
genere sono a breve termine, poichè è
necessario mantenere il tessuto il più
possibile in uno stato simile a quello
fisiologico.
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Cos’è una
Cellula Staminale
E’ una cellula non specializzata capace di
dividersi e di dare origine a cellule dei diversi
tessuti adulti. Le distinguiamo in:
• EMBRIONALI, sono totipotenti, possono dare
origine a qualsiasi tipo di cellula;
• FETALI, sono pluripotenti, possono dare
origine solo ad alcuni tipi di cellule;
• PLACENTARI, sono pluripotenti, prelevate dal
sangue del cordone ombelicale o dalla
placenta;
• ADULTE, sono pluripotenti ed ematopoietiche.
L’importanza delle cellule staminali
L'applicazione più importante delle cellule staminali per il futuro risiede nel
campo della Medicina Rigenerativa. Con questa branca s'intende la
produzione di una grande quantità di cellule da utilizzare nelle terapie che
permettono la ricostruzione dei tessuti danneggiati nei malati di
Parkinson e nell'Alzheimer, nelle ustioni, nell'infarto, nel diabete, nelle
osteoartriti e nelle artriti reumatoidi o nei danni alla colonna vertebrale.
Early Moments in Mammalian Development
Zygote
Morula
Blastocyst
Day 5 Human Embryo
Blastocyst Stage, ~ 100 cells
Trophoectoderm
(placenta and amnion)
Inner cell mass
(all tissues in the body)
1/100 inch
Human Embryonic Stem Cells
The inner cell mass gives rise to all the cells
in the body.
Ectoderm
Mesoderm
Endoderm
Germ Cells
Dorsal
Notochord
Outer surface
Skin
CNS
Neuron
Neural Crest
Melanocyte
Digestive Tube
Pancreatic Cell
Paraxial
Bone tissue
Pharynx
Thyriod Cell
Intermediate
Tubule cell of the kidney
Respiratory Tube
Alveolar Cell
Lateral
Red Blood Cell
Blood vessels
Heart
Head
Facial Muscle
Germ Cells
Sperm and Egg
During development, the daughters of the inner
cell mass differentiate into the cell types of the
body.
Gut
Endoderm
Blood
Inner
Cell
Mass
Mesoderm
Hear
t
Ectoderm
Skin
Brain
Germ
Sperm
Or Eggs
Time of Gestation
After Birth
The embryonic stem cell is the stem cell of stem cells
Embryonic Stem Cell
Gut
Scientists have
figured out how
to make inner cell
mass cells selfrenew in plastic
dishes.
Endoderm
Blood
Mesoderm
Hear
t
Ectoderm
A few hundred
cells from one
embryo can be
grown into at
least 1.3 × 1031
cells creating a
stem cell line.
Skin
Brain
Germ
Sperm
Or Eggs
Staminali embrionali:
•
•
•
•
PRO
Sono tutte totipotenti
Presentano una grande
capacità di proliferazione
Possono mantenersi più a
lungo in coltura
Maggior facilità di prelievo
CONTRO
• Presentano un’alta
probabilità di rigetto
• non hanno ancora raggiunto
risultati clinici concreti
• Non è ancora possibile
controllare né l’espressione
genica, che ne determina la
differenziazione, né
l’espansione (per ora se
impiantate si sviluppano
come tumori)
Utilizzo e problemi relativi
alle Staminali Embrionali
• DIFFERENZIAMENTO: deve essere
indotto e la cellula deve raggiungere la
regione lesionata;
• RIGETTO: le SE possiedono un corredo
cromosomico eterologo;
• CANCEROGENICITA’: le cellule del
nodo embrionale della blastocisti sono
capaci di dividersi infinitamente come
quelle cancerose.
Staminali adulte
Cellule staminali sanguigne
Da midollo osseo degli adulti
Queste cellule producono normalmente tutti i tipi di cellule ematopoietiche
(globuli rossi, globuli bianchi, piastrine).
Fino a poco tempo fa, gli scienziati pensavano che fosse impossibile che le
cellule staminali ematopoietiche potessero tornare multipotenti, potendo quindi
reinventarsi per dare origine a tipi di cellule completamente differenti come
quelle cerebrali, nervose, intestinali o epiteliali.
Esperimenti realizzati in diversi centri di ricerca dimostrano che questo è
possibile.
Dal cordone ombelicale,
il cui sangue è ricco di cellule staminali. Le cellule staminali così raccolte
potranno essere utilizzate per curare malattie sanguigne. In futuro, il sangue
del cordone ombelicale potrebbe rappresentare una fonte di cellule staminali
importantissima per curare le lesioni vascolari o cerebrali, il diabete, il morbo di
Parkinson e la distrofia muscolare.
La particolarità della raccolta di queste cellule è quella di poterle prelevare
senza toccare né la madre né il bambino. Sono inoltre compatibili con il
neonato nel caso in cui sviluppi una certa malattia o abbia bisogno di cellule
staminali.
Le cellule staminali adulte sono reperibili anche in altre zone
dell’organismo umano adulto: si possono trovare in zone specifiche del
sistema nervoso, in alcuni tessuti muscolari, nei tessuti adiposi, epiteliali,
connettivi….
Da feti abortiti in modo spontaneo
I feti,spontaneamente abortiti, racchiudono una riserva enorme di cellule
staminali già differenziate (Committed) ma nello stesso tempo ad alta
potenzialità genica e altamente prolifiche
Our bodies have many adult stem cell niches
Blood
Gut
Skin
Bone, Skin, Tendon,
cartilage
Liver
Staminali adulte:
•
•
•
•
PRO
Non presentano rigetto
In alcuni casi si trovano già
nel tessuto da curare
Il loro utilizzo non lede,
non sopprime e non
danneggia nessun altro
essere umano in
qualunque stadio del suo
sviluppo
Sono già stati ottenuti
importanti risultati clinici
CONTRO
• Sono difficili da coltivare e
da isolare
• Presentano una
proliferazione più lenta di
quelle embrionali
Problemi relativi alle Cellule
Staminali Adulte o da
Cordone Ombelicale
• Hanno limitata potenzialità a dare
diversi tipi cellulari;
• Sono presenti in un numero
inferiore;
• Quelle da cordone ombelicale
sono più numerose di quelle
adulte.
Some research suggests
Adult stem cells can be
coaxed into changing fate in culture
Can I be coaxed
Into making neurons
Or cardiac muscle?
Induction of pluripotency by defined factors
K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) reported Reprogramming of mouse
somatic cells with defined factors-
The iPS cells can be generated by the addition of several combinations of
transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc) .The standard mixture
contains Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc, and that mixture can induce
reprogramming in mouse, human, rat, pig, and dog.
iPS esprimenti GFP
Mouse iPS cells can differentiate into all three germ cell
layers and contribute to chimeric mice after they are injected into
blastocysts which indicate their pluripotency.
iPS cells have a unlimited proliferation in vitro,
while maintaining their pluripotency.
These characteristics could allow the iPS cells
to supply patient-specific pluripotent stem
cells.
The original method of iPS induction used a retrovirus vector for
transgene expression. This vector can robustly infect a variety of cell types and
introduce their coding genes into the host genome by reverse transcriptase which
thereby enables constant transgene expression during reprogramming.
The expression of retroviral transgenes continues until the cells become iPS cells.
However, the retrovirally derived iPS cells have numerous transgene integrations in
the genome, and the integrations may result in leaky expression which could disturb
endogenous transcription factor network and lead to failure of differentiation.
Another important problem of transgene integration is tumorigenic risk after
transplantation. In particular, c-Myc, one of the reprogramming factors, is a wellknown oncogene, and its reactivation could give rise to transgene
derived-tumor formation in chimeric mice
Removal of the c-Myc transgene from reprogramming cocktail is one important
approach to make IPS.
Human and mouse iPS cells can be established from fibroblasts with only Oct3/ 4,
Sox2, and Klf4, although the efficiency is significantly reduced
However, the overexpression of Oct3/4 and Klf4 can cause tumor formation, and
various human tumors express OCT3/4, SOX2 and KLF4. In
addition, the retroviral insertion to the genome itself may disturb
endogenous gene structure and increase the risk of tumors .
Other approach is the reduction of integration sites by viral vectors (adenovirus
and Sendai virus), DNA vectors (plasmid, episomal plasmid, and minicircle vector),
and direct protein delivery. Their efficiencies of iPS cell induction are lower
than that with retrovirus vectors, possibly due to low transduction
efficiency, and unstable expression.
Yu et al. reported human iPS induction with a different set of reprogramming
factors, including Oct3/4, Sox2, Nanog, and LIN28 . Inclusion of Oct3/4 and Sox2
in both sets indicates their importance for reprogramming. The
reprogramming efficiency is enhanced by the addition of extra factors, such as
ESRRB, UTF1, Sall4, Tbx3, miRNAs (miR-291-3p, miR-294 and miR-295), and
shRNAs for p53 or p21.
Hanna et al. found some reprogramming factors, such as Lin28 and
shRNA for p53, mainly regulate the reprogramming efficiency
through the control of cell proliferation. In contrast, Nanog is
seemed to enhance the efficiency of reprogramming through
affecting the process itself.
Oct3/4, Sox2, and Nanog induce the expression of stemness genes, such as
STAT3 and ZIC3 . These factors are thought to have the opposite function, to
repress differentiation related genes.
The alteration of epigenetic modifications is also important for iPS cell
induction. iPS cells have epigenetic modification similar to those of ES cells in
terms of DNA methylation and histone modifications. The promoter regions
of Oct3/4 and Nanog in fibroblasts are highly DNA methylated and
inactive, while these regions are demethylated and active in iPS
cells.
Doi et al. found 71 differential methylation regions (DMRs) between ES cells and
iPS cells [31]. The DMRs showed significant accumulation in genes
associated with developmental processes that were hypermethylated
in iPS cells in comparison to ES cells, which could lead to
differentiation failure of iPS cells
Summary
• Methods for the generation of iPS cells remain at a developmental
stage. A reliable method to evaluate the iPS cells must be
established. Although many problems still remained to be resolved,
iPS cells may be applicable for medical treatment in the future.
Studies of disease pathogenesis and drug discovery have already
been launched, and thresults thereof could provide important relief
to countless people throughout the world.
iPS cells generation in patient fibroblasts
• Parkinson’s disease (Wernig and Jaenisch, 2008, Maehr and Melton PNAS 2009).
• Amyopathic Lateral Sclerosis, (Dimos and Eggan Science 2008)
• Type I diabetes (Maehr and Melton PNAS 2009)
• Duchenne dystrophin, Parkinson’s disease, Huntington disease,
Down syndrome,. (Park and Daley Cell 2008).
iPS cells generation from other cell types
•
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Blood cells (Loh and Daley 2009). B-cells (Hanna and Jaenisch Cell 2008)
Blood stem cells (Emiinli and Hochedlinger Nat Genet 2009)
Pancreatic b-cells (Stadtfeld and Hochedlinger Cell Stem Cell2008)
Hepatic and gastric endoderm (Aoi and Yamanaka Science 2008)
Neural stem cells (Kim and Scholar, Nature 2008)