Download Developmental Genetics

Developmental Genetics
Development
Single fertilized egg cell พัฒนาเป็ น embryo เป็ น
adult ที่ประกอบด้วย cells จานวนหลาย trillions
ซึ่งจัดองค์กรได้เป็ น organs ต่าง ๆ และแต่ละ
organ มีหน้าที่และความชานาญต่างกัน
Development of Amphioxus
Embryoระยะ Blastula
Fate map ด้านขวาของ
blastiderm ของแมลงหวี่
Differentiation
การแสดงออกของ คุณลักษณะพิเศษ (specialized
characteristics) ของเซลล์ type ต่าง ๆ
Specialized cellular functions ขึ้นกับ
1) Proteins : structural proteins for cell shapes
2) Enzymes : specific chemical reactions
3) Hormones : signals from cell to cell
Topics
I. Genetic Basis of Differentiation
II. Control of Gene Expression
in Differentiation
III. Nature of Determination
IV. Gene rearrangement during development
I. Genetic Basis of Differentiation
1. Theory of development
1.1 Mosaic Development
1.2 Regulative Development
2. Substances of development
2.1 Determinats
2.2 Inducers
2.3 Morphogens
Genetic Basis ของ Cell Differentiation
Early embryonic cells : จานวนมากเหมือนกันทั้ง
รูปร่างและ หน้ าที่
Differentiated cells : ผลิต specialized products
1) Fundamental proteins ที่จาเป็ น (vital) ต่อชีวิต
โดย Housekeeping genes : RNA
polymerase
& ribosomal proteins
2) Specialized cell products สาหรับบาง organs
โดย Luxury genes : hemoglobin, insulin,
Different specialized cells ทาให้เกิด
different specialized proteins.
Specialized proteins ตัดสิ นว่า cells
สามารถทาอะไรได้
Cell differentiation เป็ นการสะท้อนถึง
differential gene activity.
Genetic basis of cell differentiation (ต่อ)
1. Theory of Development
Theory เพื่อตอบคาถามว่า
อะไรทาให้ gene หนึ่ง express ใน เซลล์ชนิดหนึ่ง
และ gene อื่น express ในเซลล์อีกชนิดหนึ่ง
Theory ของ Development มี 2 theories
1. Mosaic Development
2. Regulative Development
Mosaic development
differentiation ของ embryonic cells เกิดจากการ
สู ญเสี ย genetic potential ตั้งแต่เริ่ มต้นไปเรื่ อย ๆ
ระหว่างการเปลี่ยนแปลง
ในแต่ละ cell cycle ระหว่าง development เซลล์
ลูกจะไม่ได้ genetic material เท่ากันและเซลล์ไม่
เหมือนกัน เมื่อรวมเซลล์ท้ งั หมดจึงคล้าย mosaic
เรี ยกว่า Mosaic embryo
นัน่ คือ ระหว่าง cell division genes ถูกแบ่งเป็ นส่ วน
(partition) และ genes ส่ วนมากสู ญเสี ย potential
ระหว่าง differentiation คงเหลือแต่
1. Housekeeping genes และ
2. Luxury genes สาหรับ specialized
functions ทาให้ cells มีความ
แตกต่างกัน
ใน invertebrate พบความแตกต่างของเซลล์ใน
embryo ตั้งแต่ระยะ 2 เซลล์ ขึ้นไป และพบว่าถูก
programmed มาแล้ว
เช่นส่ วนที่ differentiate ไปเป็ น ระบบประสาท
หรื อ กล้ามเนื้อ
Regulative development
เซลล์ embryo ของ eukaryote ชั้นสู งติดอยูร่ วมกัน
จนถึงระยะ 8 cells จึงแยกกันเป็ นแต่ละเซลล์ ทั้ง 8
เซลล์สามารถ develop เป็ น 8 organisms
แสดงว่าแต่ละเซลล์ เป็ น Totipotent คือสามารถ
เจริ ญหรื อผลิตให้เป็ น organism ทั้งตัวได้ปกติ
Embryo เรี ยกว่า Regulative embryo
นัน่ คือ เซลล์ embryo รักษา genetic materialไม่ให้
สู ญเสี ย เป็ นเวลานานถึง 3 cell division cycles ซึ่ง
เป็ นเวลานานกว่า mosaic development
พัฒนาการแบบนี้ เรี ยกว่า
Regulative development
เช่น embyro ของ humans ที่เกิดแฝดเหมือนได้หลาย
คน (ถึง 8 คน)
ผ่านระยะนี้แล้ว totipotency ไม่แน่นอน อาจ
 คง totipotent เช่ น stem cells/ precursor cells
ของ เซลล์เม็ดเลือดในใขกระดูก
ในพืช adult cell เพียง 1 เชลล์ เป็ น totipotent
differentiated cells สามารถเจริ ญเป็ นพืชทั้งต้นได้
ซึ่งใช้ประโยชน์ในการทา tissue culture
 สูญเสีย genetic potential ส่ วนมากไป เช่ น
muscle cells และ nerve cells
โดยสรุ ป : animals & plants
บางชนิดมี totipotent differentiated cells
บางชนิดไม่มี
ดังนั้นการสู ญเสี ย genetic material ใน differentiation
ของเซลล์จึงไม่จาเป็ น และไม่มีหลักฐานการ
สู ญเสี ย genes ระหว่าง cell differentiation
แต่มีหลักฐานแสดงว่า cell differentiation มีสาเหตุ
จาก Epigenetic changes ซึ่งเป็ นการเปลี่ยนใน
gene expression ไม่ใช่ที่ตวั genes โดยตรง
Genetic basis of cell differentiation (ต่อ)
2. Substances in
Development
2. 1 Determinant
ก่อนเซลล์ differentiate และ express specific function
เซลล์ตอ้ งผ่านกระบวนการ
Determination
Determination เป็ นระยะที่เซลล์ผา่ น point of no return
หรื อ irreversible commitment ใน Development
program หรื อ fate หรื อตัดสิ นชนิดของเซลล์
พบว่ามี สาร Effector substances ใน cytoplasm
ในใข่เป็ น Determinants
determinants อยูใ่ น egg และกระจายไม่เท่ากัน
แต่กระจายจากมากไปหาน้ อยเป็ นระดับ
(gradient) จาก บน --> ล่าง
(animal pole --> vegetal pole)
และจาก side --> side
Gradient of
determinations
determinants อาจเป็ น Maternal messages
ที่ mRNA สังเคราะห์ข้ ึนจานวนมากแล้วเก็บ
สะสมไว้ระหว่าง การเจริ ญของ egg
(developing egg) หรื อ
determinants อาจเป็ น Transcription factors
ซึ่งจะไม่พบใน egg แต่สงั เคราะห์โดย embryonic
cells ของ embryo ในระยะหลัง
2.2 Inducers
Substance ที่เซลล์หนึ่งขึ้นให้ไปมีอิทธิพลต่อ
การพัฒนาของอีกเซลล์หนึ่ง หรื อเป็ น signal
จาก cell to cell
เช่น เนื้อเยือ่ embryo 3 ชั้น Mesoderm จะ induce
development ของ Ectoderm กล้ามเนื้อ induce
พัฒนาการของ ระบบประสาท
2.3 Morphogens
เป็ น subsets ของ determinant และ inducer
morphogen ตัดสิ นรู ปร่ าง (morphology) ของ
developing embryo ใน vertebrates
morphogen สามารถชักนาให้เกิดการเปลี่ยน
รู ปร่ างในต่าง embryo ได้ในการทา transplantation
เช่น ใน chick limb bud มี Retinoic acid กาหนดและ
ชักนาให้พฒั นาเป็ น digits
พบว่า Retinoic acid เป็ น morphogen ใน
พัฒนาการของหลายเนื้อเยือ่ และหลายสิ่ งมีชีวิต
รวมทั้งคน
Retinoic acid ยังสามารถทางานร่ วมกับ hormones
อื่นใน differentiation ได้ดว้ ย
II. Control of Gene Expression
in Differentiation
Differentiation เกิดโดยการ turn-on ของ genes ที่
เลือกแล้วได้อย่างไร
เป็ น control ของ structural gene expression ระดับ
Transcription,
posttranscription,
translation และ
posttranslation
Control ใน Prokaryote
มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมากใน gene expression
และ cellular activity
เช่น ใน bacteria Sporulation --> Vegetative
เปลี่ยนที่ sigma factor ของ RNA polymerase
และ เป็ น time-dependent shift
Control ใน Eukaryote
Expression ของ luxury genes
1. Hormone activation of genes
2. Hormone-responsive elements
3. Light-induction of plant genes
1. Hormone activation of genes
Hormone ทางานโดย turn on transcription ของ
specific genes ใน target cells ได้
1. โดยตรง โดย เข้าไปจับกับ gene ใน nucleus
2. โดยอ้อม โดยผ่าน second messenger ที่ cell
membrane/cytoplasm
Hormone action เป็ น complex process ทั้ง 2
วิธี ต้องมี receptor เฉพาะชนิด hormone
ใน development และ differrentiation พบว่า
steroid hormone แสดงบทบาทสาคัญ
Steroid hormone ซึมผ่าน cell membrane เข้า
cytoplasm เข้า nucleus ไปจับกับ receptor
ได้เป็ น hormone-receptor complex แล้วไปจับ
chromatin ไป activate corresponding genes
ให้มี transcription
Steroid hormone action
Activation ของ estrogen ต่อ ovalbumin gene ใน
chick oviduct พบว่า estrogen-receptor complex มี
binding site ที่ระหว่าง 250-300 base pairs upstream
จาก TATA box
hormone-receptor complex ก็คือ transcription factor
ที่ bind และ stimulate ที่ตาแหน่ง enhancer ของ gene
มี hormone อีกหลาย family ที่มี receptor ใน nucleus
เช่น
1) glucocorticoid receptor : mediate gene โดย
hormone cortisol
2) vitamin D3 receptor
มีบทบาท
3) thyroid hormone receptor
สาคัญใน
4) retinoic acid receptor
developnemt
response ของเซลล์ ขึ้นกับการมี receptor หรื อไม่
2. Hormone-responsive elements
Hormone-responsive element (HRE) หรื อ site
บน DNA ซึ่งก็คือ Enhancer สาหรับให้
hormone-receptor complex จับ พบว่า
1. Retinoic acid responsive element (RARE)
binding site บน DNA สาหรับ Retinoic acid
receptor (RAR)
RAR เป็ น Finger protein ที่มี 2 Zinc fingers
RAR จับกับ RARE ได้ RAR-RARE complex
แล้ว retinoic acid จึงจับกับ complex ที่หลัง
จากนั้น complex ทั้งหมดจึงไป stimulate gene ที่
อยูใ่ กล้
RARE พบใน growth hormone gene ใน pituitary
ซึ่งผลิด growth hormone ก่อนและหลังเกิด
RAR-RARE interaction
Zinc finger protein
Transcription factors
ใน Development
Helix-turn-helix
Copper fist
Leucine zipper
2. RARE เป็ น enhancer ของ Thyroid
hormone receptor (THR) ด้วย
ทาให้ thyroid hormone ทางานร่ วมกับ
retinoic acid ในการควบคุม growth hormone
โดย thyroid hormone receptor จับกับ RAR
ได้ dimer ไปจับ growth hormone RARE -->
turn on growth hormone gene --> growth
hormone
3. RARE เป็ น enhancer ของ Vitamin D3
Vitamin D3 ทางานร่ วมกับ retinoic acid โดยจับ
กับ VDR และ RAR ตามลาดับ เพื่อร่ วมกัน turn on
Osteocalcin gene ให้ product เกี่ยวกับ
differentiation ของ immature osteoblast (เซลล์
กระดูก) ให้ uptake calcium ทาให้ cell mature
Cells ทั้งหมด response ต่อ hormoneไม่เหมือนกัน
เพราะ มี specific hormone receptor ไม่เหมือนกัน
Hormones ส่ วนมากมี target เพียง 2-3 cell types
กรณี ของ retinoic acid ใน vertebrate มี receptor 3 types
โดยเฉพาะ type RARa พบมีในเซลล์เกือบทุกชนิด
Retinoic acid จึงเป็ น Morphogen พื้นฐาน
Hormone receptor เองเป็ น protein ก็เป็ นผลของ
differentiation ด้วย
3. Light-induction of plant genes
Seedling ของพืชเจริ ญในความมืด จะไม่สร้าง
photosynthetic apparatus ซึ่งคือ chlorophyll เป็ น
การประหยัดพลังงาน
จนเมื่อได้รับแสง seedling จึงเปลี่ยนเป็ นสี เขียว
enzyme สร้าง chlorophyll เป็ น light-activated
enzyme ชื่อ Ribose biphosphate carboxylase หรื อ
Rubisco
Rubiscao gene และ light-inducible genes อื่น ๆ
Promoter :
sequence จาก -35 ถึง -46 เป็ น light dependent และ
ที่ -35 base pair region มี TATA box
จากตาแหน่ง -46 upstream response ต่อแสง
Enhancer :
region จาก -327 ถึง -48 ช่วย stimulate rubisco
gene response ต่อแสง
Light activation of plant gene
Control Expression ของ gene ใน cell
differentiation ใน plants และ animals
๏ มี regulatory region / 5’-flanking region แบบ
cis-acting DNA คือ control region อยูบ่ นสาย
เดียวกับ structural gene เช่น TATA box และ GC
box และ
๏ มี trans-acting protein เช่น transcription factor
III. Nature of Determination
Determination
คือ process ที่ cells make irreversible decision
เพื่อให้ cell ดาเนินไปตาม developmental pathway
ซึ่งจะเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนสภาวะทางกายภาพ
ของ Chromatin โดย factor ที่ป้องกัน histones
ไม่ให้ไปจับที่ control regions ของ genes
1. DNase Hypersensitivity
บางแห่งบน active chromatin ไวต่อการย่อยด้วย
DNase I เรี ยกว่า DNase hypersensitive site ซึ่ง
เป็ น site ที่ไม่มี Nucleosome เป็ นช่วง sequence
ประมาณ 300 bp ระหว่าง 2 nucleosomes
(nucleosome คือ chromosomal protein หรื อ Histones
ที่จบั อยูก่ บั DNA ให้เป็ น chromatin / chromosome)
พบว่า DNase hypersensitive region ก็คือ
5’- flanking region / regulatory region (promoter
& enhancer) ที่ transcribed ด้วย RNA Pol II
Hypersensitive region ทาหน้าที่ turn on/off gene
โดยต้องมี factor (protein) ป้องกันไม่ให้บริ เวณ
hypersensitivity นี้มีการสร้าง Nucleosome
Chromosome organization
Determination ของ globin gene สร้าง globin
ในเม็ดแดงของกบ
Hypersensitivity region ที่ 60-260 upstream
พบ factor ป้องกันการสร้าง nucleosome เมื่อ
embryo อายุ 14 วัน
นัน่ คือ globin gene ของกบ active
เมื่ออายุ 14 วันเป็ นต้นไป
Activation ของ adult  -globin gene
2. Control ของ 5S rRNA genes
5S rRNA genes (ในกบ) มี 20,000
genes
แบ่งเป็ น 2 family
1. Oocyte 5S rRNA genes : 98 % ,
transcription เฉพาะใน oocytes
2. Somatic 5S rRNA genes : 2 % ,
transcription ใน somatic cells
Transcription โดย RNA Pol III มี factors คือ
TFIIIA, TFIIIB, และ TFIIIC
ใน immuture egg และ developing embryo :
oocyte rRNA genes express แต่
somatic rRNA genes ถูก repressed และ
สลับกันเมื่อ embryo ระยะ gastrula (~ 3,200
cells)
Expression ของ rRNA
genes เกิดจาก
competition ระหว่าง
transcription factors กับ
histones บน
hypersensitivity
region หลัง replication
แต่ละรอบของ cell
division
พบว่า determination สาเหตุจาก competition
ของ genes 2 ชนิดนี้ และ TFIIIA ลดจานวน
ลงเรื่ อย ๆ ระหว่าง development จนเหลือ
1 โมเลกุล / oocyte rRNA gene
ทาให้ rRNA gene ถูก repressed โดย histones
และ somatic rRNA gene ชนะจะ express
3. DNA methylation
การใส่ methyl (-CH3) group เข้าที่ base/sugar
ของ nucleotide
Active genes มี low methyl groups หรื อ
undermethylated
Methylation ของ DNA ทาให้ repress gene
และถ่ายทอดได้ และเป็ น signal ให้ DNA สาย
ใหม่มี methylation ด้วย
กฎ methylation ใน higher eukaryote ต้องเกิด
กับ C ที่เป็ น 5’-CG-3’ dinucleotides
Determination โดย mehtylation เพื่อ
1) Repress gene activity และ 2) permanent
จัดเป็ น Epigenetic mechanism เพราะ methylation
ไม่ทาให้ genetic change แต่ทาให้ gene turn off
เร็ วระหว่าง development เช่น
X chromosome ใน female พบว่าถูก methylated
และ หยุด develop เร็ ว
Inactive X chromosome เรี ยกว่าถูก Lyonized ทา
ให้เห็นรู ปร่ างเป็ น Barr body
Methylation
Barr body
No Barr body
Barr body
Genes ต้นเหตุ Determination
Fruit fly Drosophila: ศึกษาพบ genes ที่ทาให้
เกิด determination จาก mutant ซึ่งเรี ยกว่า
Homoeotic genes หรื อ Homeotic
genes
โดยการทา Homoeosis หรื อทา mutation แล้ว
ทาให้เกิด transformation ส่ วนของร่ างกายจาก
ส่ วนหนึ่งไปเป็ นอีกส่ วนหนึ่ง
เช่น Antennapedia (Antp) mutant มีขาที่หวั ใน
ตาแหน่งของหนวด
แสดงว่าหนวดของ mutant นี้ได้ถูกเปลี่ยนให้
เหมือนขา หรื อ cells ปกติที่ควร develop เป็ น
หนวดได้ถูก programmed ให้ develop เป็ นขา
Transformation ใน mutant จะต้องเกี่ยวข้องกับ
activity ของหลาย genes โดยมี เพียง gene เดียวที่
ถูก mutated และ gene นี้ตอ้ ง control genes อื่น
Antennapedia phenotype
Homeotic genes ของแมลงหวี่
นัน่ คือ Homeotic gene เป็ น Master gene ที่เกี่ยวข้อง
กับ determination
ถ้า mutate gene นี้จะทาให้ determination เปลี่ยนไป
ในสู่ วถิ ี / programใหม่
Homeotic genes จึงมีบทบาทเป็ น ศูนย์กลางใน
development ในแมลงหวี่ศึกษาพบแล้ว 2 กลุ่มคือ
Antennapedia complex (ANT-C) และ
Bithorax complex (BX-C)
Homeobox
Common DNA sequence ประมาณ 180 bp
 ใน Homeotic genes ซึ่ งเป็ น complex (cluster)
genes และ
 ใน genes อื่น ๆ ที่ไม่ใช่ homeotic genes ซึ่ ง
ไม่ได้ทาให้เกิด transform ของ body part แต่กม็ ี
ความสาคัญเช่นเดียวกับ homeotic genes ในการ
development ด้านกายภาพและการจัดระบบของ
embryo
ลักษณะของ Homeobox
75 % - 79 % conserved ทาให้สามารถ share
และ control genes อื่น ให้ develop อย่างเป็ น
ขั้นตอน
 code ให้ DNA-binding domain ซึ่ งเป็ น protein ที่
เป็ น positively charged มาก
 protein เป็ น transcription factor จะ migrate ไปที่
nucleus ไปจับ control region ของ genes ที่
ควบคุม

Homeodomain proteins
Copper fist protein
Helix-turn-helix protein
Zinc finger protein
Arrangement ของ homeobox containing genes
เหมือนกันทั้ง vertebrate และ invertebrate คือ
เรี ยงตาม anterior-posterior body axis ที่ express
โดย genes ที่อยูเ่ ริ่ มต้นของ complex เป็ น genes ที่
express ไปทาง anterior และ genes อยูส่ ุ ดท้ายของ
complex จะ express ไปทางด้านหลัง
ตัวอย่าง homeobox genes
 engrailed (en) gene ~ แบ่ง embryo ออกเป็ นส่ วน
Anterior และ Posterior
 ftz gene (fushi tarazu) ~ การมี segmentation
pattern ที่ถูกต้อง mutation ของ gene นี้จะ lethal
 Antp ~ development ของ antenna บนส่ วน head
 Ubx ~ gene หนึ่ งใน BX-C ~ control pattern ของ
segments ของ thorax และ abdomen และควบคุมให้
Antp turn on นัน่ คือ gene ด้านหลัง repress gene ที่
อยูด่ า้ นหน้า
Vertebrate homeoboxes
• sequence ของ homeoboxes ของ แมลงหวีก่ บั ของ
vertebrate คล้ายกันมากถึง 95%
• การจัดเรี ยงของ genes เป็ น cluster ในลาดับเดียวกันที่
express
คือ homeotic genes ที่อยูต่ อนต้นของ clusters express
ไปข้างหน้า และ genes ที่อยูต่ อนปลายของ clusters
express ไปข้างหลัง
• homeobox gene ของ vertebrate active ช้ากว่า
และ active ทั้งก่อนและหลัง differentiation
• homeobox proteins ใน vertebrates เป็ นทั้ง
Transcription factor และ regulator ใน
development ของ embryo
• เช่น Pit -1 protein ใน mouse dwarf (dw) gene
ควบคุม development ของ pituitary glands ซึ่ง
ผลิต growth hormone, prolactin hormone และ
thyroid - stimulating hormone
แสดงว่า Pit - 1 มี multiple effects ต่อ
develepment
ของ pituitary gland
Maternal Effect Genes
 Genes ที่ code ให้ products ใน egg แล้ว
ปริ มาณ ของ products กระจายจากมากไปหาน้อย
(gradient) หรื อ ทาให้ egg มี polarity
 products มี effect ต่อ development ของ body
parts
 bicoid (bcd) gene ~ การเกิด anterior body parts
ส่ วน heads & thoraxes
Maternal effect genes
Segmentation genes
 Pair-rule genes หน้าที่ control organization ของ
segments เป็ นคู่
 ftz gene ใน segment เว้น segment เป็ น pair-rule
genes แสดงออกใน embryo ระยะต้น
 engrailed gene แบ่งembryo ออกเป็ น anterior &
posterior
Expression ของ ftz
gene ในแมลงหวี่
เปรี ยบเทียบความ
คล้ายกันใน
Expression ของ genes
ระหว่าง
Invertebrate และ
Vertebrate