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Bioinformatica
Microarray
Dr. Giuseppe Pigola – [email protected]
Microarray
A parte poche eccezioni, ogni cellula del nostro organismo contiene un set
completo di cromosomi composti da geni identici.
In una specifica cellula, solo una parte di questi geni è attiva, e sono proprio
i diversi gruppi di geni attivi che conferiscono proprietà specifiche ad ogni
tipo cellulare.
Per “espressione genetica” si intende la produzione di proteina da parte di
un gene (la trascrizione delle informazioni contenute sul DNA nell’mRNA
che a sua volta viene tradotto nelle proteine che provvedono alle funzioni
di base delle cellule).
Il tipo e la quantità di mRNA prodotto ci dicono quanto un gene sia
espresso.
Ad esempio una alterazione dell’espressione genica può indicare la
presenza di una malattia.





2
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Microarray
Biological question
Differentially expressed genes
Sample class prediction etc.
Experimental design
Microarray experiment
Image analysis
Normalization
Estimation
Testing
Clustering
Discrimination
Biological verification
and interpretation
3
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
Analizzare l’espressione genica vuol dire analizzare la quantità di mRNA o
di proteine prodotte da una cellula in un particolare momento.

I Microarray, chiamati anche DNA chip, permettono l’analisi
dell’espressione di migliaia di geni con un singolo esperimento.

Il principio alla base dell’analisi dell’espressione genica consiste nel
confronto di campioni diversi, ad esempio tessuti sani o malati per studiare
l’espressione genica in una determinata malattia.
4
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Microarray

Le molecole di mRNA si legano
selettivamente, attraverso
l’appaiamento delle basi, ad una
sequenza di DNA complementare;

Migliaia di sequenze di DNA a
singolo filamento vengono
posizionate su una griglia
microscopica di pochi centimetri,
che funge da supporto per
l’appaiamento di molecole di mRNA
che vengono poste sulla sua
superficie (con l’ausilio di robot);
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Microarray
Come già detto si confrontano le espressioni geniche per correlarle a
malattie. Un tipico esempio è quello di confrontare l’espressione genica di
un certo numero di geni in diversi campioni (=pazienti) appartenenti a
diverse classi (=norm vs cancer).

…
Array1
Array2
Array3
rapporto di espressione del gene 5 nel paziente 4
6
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
Una volta preparato il microarray, gli mRNA relativi a determinati geni
vengono trattati con dei coloranti fluorescenti (tipicamente Cy3 e Cy5);

Dei laser applicati al microarray producono una emissione di colori che
indicano l’espressione dei mRNA;

7
A questo punto viene prodotta una
immagine RGB:
 Blu settato a 0;
 Rosso per le intensità di Cy5;
 Verde per le intensità di Cy3;
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PROCESSAMENTO DELL’IMMAGINE

8

Addressing/Gridding: Ad ogni spot è assegnata una
coordinata;

Segmentation: Classificazione dei pixel (backgroud/spot);

Intensity determination: Viene misurata l’intensità di
ciascuno spot in relazione all’intensità del backgroud;
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CREAZIONE DELLA MATRICE DI ESPRESSIONE


Il microarray viene rappresentato da una matrice A(i,j) dove:
A(i,j) = value_R/value_G
Value= Median (Foreground) - Median (Background);
Value = Mean (Foreground) - Mean (Background);
9
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
Software GenPix:
10
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Microarray Data Mining

Una volta ottenuta la matrice che rappresenta il microarray è possibile
applicare tecniche di data mining per:

Trovare biomarcatori che permettono di individuare una determinata classe
(normal/tumor);

Classificare un profilo di espressione genica sconosciuta;
11
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Microarray Data Mining

METODI

12
Esistono diverse tecniche di data-mining per la classificazione di dati di espressione
genica.
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Una nuova tecnica di data mining per costruire un classificatore:

INPUT: Matrice di espressione genica (miRNA);

Ridurre i campioni per classe in modo da equlilbrare la generazione dei NFI;

Filtraggio di geni differentemente espressi nelle varie classi;

Discretizzazione dei dati;

Eliminazione dei geni non discriminanti;

Costruzione di Maxima Frequent Itemset per ciascuna classe;

Estrazione di regole di associazione utilizzate per classificare samples sconosciuti;

Validazione del modello tramite KFCV;
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Profiling
data
Filtering
(i.e. discriminant genes)
Discretization
Binary strategy
Model validation
(KFCV)
Superset of robust
biomarkers
14
Genes patterns
(data mining: max
freq itemsets)
Filtering based on
permutation test
Bayesian Networks
Construction (reverse engineering)
Pathway Perturbation
microRNAs analysis
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
N
Abbiamo N campioni {xi , yi }i 1 dove xi è un vettore M dimensionale e
yi {0,..., k  1} rappresenta la classe di appartenenza.

I geni (miRNA) sono denotati da   {m }mM1 dove m (x) rappresenta i valori di
espressione del campione x per il gene (miRNA) m.
15
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
DISCRETIZZAZIONE

Al fine di calcolare i Maximal Frequent Itemset dobbiamo prima discretizzare. Ogni valore di gene
discretizzato sarà mappato in un Item (quindi i geni-valore sono sostituiti da geni-intervalli)
rappresentato da un numero intero;

Differenti metodi di discretizzazione possono influenzare l’accuratezza del metodo (supervisedunsupervised, global-local, topdown-bottomup (splitting-merging), etc. etc.;

Per discretizzare
16
  {m }mM1
possiamo usare diversi metodi:

Equal Width Interval Bin;

Recursive Minimal Entropy Partitioning;

Class-Attribute Contingency Coefficient;

Unparametrized Supervised Discretization;

Iterative Dicotomizer 3 Discretizer;

……
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Microarray Data Mining

DISCRETIZZAZIONE: Equal Width Interval Bin

Discretizziamo il range di una variabile continua in B bin (contenitori);

Dati i livelli d espressione di un gene
ciascun bin è impostata a
nel range
l’ampieza di
I limiti confini di ciascun sono impostati a
Il metodo è applicato ad ogni gene indipendentemente scegliendo i valori
discretizzati nell’insieme
A seconda del bin in cui cade un valore continuo
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Microarray Data Mining

DISCRETIZZAZIONE: Recursive Minimal Entropy Partitioning

Dato l’insieme
di livelli di espressione genica per il gene
e il confine di partizione Ti, l’entropia della partizione indotta da Ti è
Il punto di partizione Ti che minimizza l’entropia verrà scelto e il procedimento
proseguirà ricorsivamente finché non si verifica una condizione di stop:
Dove
Con a,a1,a2 numero di classi nei set Si, Si1,Si2 rispettivamente e N numero di valori
del gene in Si (Uguali per tutti i geni).
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Microarray Data Mining

DISCRETIZZAZIONE: Recursive Minimal Entropy Partitioning

Ordiniamo i valori di

Siano x1,x2,…,xM i valori ordinati;

Calcoliamo i punti di mezzo
x1
T1=(x1+x2)/2
x3
x2
T2=(x2+x3)/2
x4
T3=(x3+x4)/2
…….
…….

Per ciascuno di questi calcoliamo l’entropia e scegliamo come cutting point quello
in cui abbiamo minima entropia ottenendo cosi due intervalli;

Procediamo ricorsivamente sui due intervalli;
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
DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient

qir (i = 1,2,...,S, r = 1,2,...,n) numero totale di campioni appartenenti alla classe i-esima che
stano nell’intervallo (dr-1,dr];

Mi+ Numero totale di campioni della classe i-esima;

M+r Numero totale di campioni che stanno nell’intervallo (dr-1,dr];

n Numero di intervalli;
C.J. Tsai, C.-I. Lee, W.-P. Yang. A discretization algorithm based on Class-Attribute Contingency Coefficient. Information Sciences
178:3 (2008) 714-731
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Microarray Data Mining

DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient

qir (i = 1,2,...,S, r = 1,2,...,n) numero totale di campioni appartenenti alla classe i-esima che
stano nell’intervallo (dr-1,dr];

Mi+ Numero totale di campioni della classe i-esima;

M+r Numero totale di campioni che stanno nell’intervallo (dr-1,dr];

n Numero di intervalli;
Otteniamo i risultati migliori
quando i valori continui di ciascuna
classe si trovano insieme nello
stesso intervallo.
C.J. Tsai, C.-I. Lee, W.-P. Yang. A discretization algorithm based on Class-Attribute Contingency Coefficient. Information Sciences
178:3 (2008) 714-731
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
DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient
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
DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient
(ESEMPIO)
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
DISCRETIZZAZIONE: Unparametrized Supervised Discretizer

Definiamo:

Pure Value per un attributo: Il valore ha la stessa classe per ogni sua ocorrenza;

Impure Value: Altrimenti;

CutPoint:Valori che delimitano l’intervallo;

Pure Interval: Ogni valore nell’intervallo appartiene alla stessa classe;

Impure interval: Altrimenti;

Majority class per un intervallo: La classe con più occorrenze;

Goodness di un intervallo: La bontà di un intervallo dipende dalla sua purezza;
Goodness = (Cardinalità della classe con più elementi nell’intervallo)/(1+rimanenti elementi nell’intervallo)
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
DISCRETIZZAZIONE: Unparametrized Supervised Discretizer

Algoritmo:
 Calcolo dei cutpoints iniziali: Massimizzare la purity di ogni intervallo (Questo
porta ad avere un numero di intervalli elevato);
 Refinement: gli intervalli vengono ridotti (facendo una join di intervalli adiacenti)
in base alla funzione booleana:
Unioncondition(Ii,Ii+1) = [Ii ha la stessa majority class di Ii+1] AND
[la goodness dell’unione tra i due intervalli è maggiore della media della goodness di Ii e Ii+1]

La condizione viene applicata ad ogni step a tutte le possibili unioni e viene poi
fatta la join di quella coppia di intervalli con goodness migliore;

Alla fine l’algoritmo darà in output l’insieme di intervalli con goodness migliore;
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
DISCRETIZZAZIONE: Iterative Dicotomizer 3 Discretizer

Molto simile al metodo dell’entropia;
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
DISCRIMINANT GENE FILTERING

Se i ( x j ) è equamente distribuito tra le classi, esso non contribuirà alla classificazione. Per
questo motivo calcoliamo
Fissato un threshold TH, definiamo
Se tale funzione restituirà false, allora il gene valore non sarà considerato nella costruzione del
MFI.
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
DISCRIMINANT GENE FILTERING

In pratica, dato un valore discretizzato v e una classe k quello che calcoliamo è:
numero di valori discretizz ati uguali a v nella classe k
log 2
numero di valori uguali a v nelle altre classi

Tale valore sarà:

0 se v ha la stessa frequenza nelle varie classi;

>1 se v compare di più nella classe k rispetto alle altre;

<1 se v compare di più nelle altre classi piuttosto che in k;
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
EFRON TEST

Significatività statistica;

Come per altri casi già visti quantifica (statisticamente) se un valore discretizzato sia
discriminante per una classe solo per caso;

I valori discretizzati hanno una distribuzione nelle varie classi (ad es. per due classi):

D1
D2
…..
Dk
C1
4
19
….
12
C2
5
1
…..
10
Generiamo una distribuzione random dei valori discretizzati nelle varie classi e conteggiamo
(count) quante volte otteniamo una occorrenza maggiore a quella reale nella distribuzione
random (eseguiamno il test per un certo numero di volte);
count
 efronth  valore discretizz ato non discrimina nte
Efroniteration
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Microarray Data Mining

FREQUENT ITEMSETS.

Uno dei problemi più importanti in Data Mining e quello delle regole di
associazione: Si occupa di identificare relazioni «interessanti» tra itemset,
predicendo inoltre associazioni e correlazioni che possono presentarsi i nuovi
dati dello stesso tipo;

Market Basket Analysis: Analizzare i carrelli della spesa per stabilire quali prodotti
vengono venduti assieme;

Questo consente di identificare quei prodotti che fanno da traino (e che quindi
possono innescare con alta probabilità l’acquisto di altri prodotti);

Pannolini  birra; (non vale il viceversa);

Marketing: posizionare in modo opportuno i prodotti negli scaffali;
30
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
FREQUENT ITEMSETS.

Bisogna affrontare il problema del frequent pattern analysis: individuare
un pattern (insieme di item) che si presenta frequentemente nei dati;

In generale nel market-basket problem si vogliono estrapolare regole di
associazione del tipo:


31
Se un cliente compra x1,x2,…,xk allora probabilmente comprerà anche y;
La probabilità minima che pretendiamo si chiama confidenza;
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Microarray Data Mining

FREQUENT ITEMSETS.

Sia I={i1,i2,…,iN} un insieme di item e sia D un un insieme di transazioni
su I. Una transazione è costituita da un sottoinsieme di I;

Itemset di lunghezza k sono indicati con k-itemset;

Ogni itemset XI ha associato un supporto che indica la frazione di transazioni
contenente X;

Un itenset X sarà frequente se ha un supporto superiore a una soglia minima
data (minsupp) sotto forma di numero (assoluto) o percentuale (relativo);
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
FREQUENT ITEMSETS E REGOLE DI ASSOCIAZIONE

Gli insiemi frequenti ci permettono di costruire delle regole di associazione (ad es.
pannolini birra);

Le regole di associazione forniscono delle regole dei tipi IF-THEN
33
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
FREQUENT ITEMSETS E REGOLE DI ASSOCIAZIONE
 Data una regola di associazione XY possiamo definire il supporto e la
confidenza di tale regola come
X Y
X Y
p( XY )
conf ( X  Y ) 
 p(Y | X )
p( X )
supp( X  Y ) 
Dove XY significa che i due itemset sono presenti nella stessa transazione;

In generale il supporto rappresenta la probabilità che una transazione contenga
X e Y cioè p(XY);

La confidenza è quindi una probabilità condizionata che indica quanto robusta è
una implicazione (bisogna come per supp fissare una soglia minconf);
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
FREQUENT ITEMSETS.



Impostiamo minsupp = 50% e minconf=50%
I prodotti che superano la soglia minsupp sono:

Birra 3;

Noccioline 3;

Pannolini 4;

Uova 3;

{birra,pannolini} 3;
Dall’itemset {birra,pannolini} possiamo tirare
fuori le regole di associazione:
Entrambe superano la soglia di minsupp; Tutte le transazioni che contengono birra,
contengono anche pannolini (conf=100%); Nel viceversa solo il 75%
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Microarray Data Mining

APRIORI

Monotonicità: Se un insieme S di articoli è frequente, allora anche suo
sottoinsieme lo è;

L’algoritmo costruisce i singoli insiemi frequenti, a partire da questi costruisce le
coppie di insiemi frequenti, dalle coppie costruisce le triple di insiemi frequenti
(livelli successivi si procede più velocemente), fino ad arrivare a k-uple di insiemi
frequenti in cui non esistono itemset frequenti costituite da k + 1 elementi;
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
APRIORI: ESEMPIO

Minsupp=2;

Ci= candidati;
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
APRIORI: PSEUDOCODICE
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

INSIEMI FREQUENTI, CHIUSI, MASSIMALI
Gli insiemi massimali sono chiusi, e gli insiemi chiusi sono frequenti;
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
MAXIMAL FREQUENT ITEMSETS:

Dato l’insieme di geni discriminanti discretizzato, estraiamo per ogni
classe k l’insieme di itemset massimale (MFI);

Per ogni classe k=0,…,K−1, viene calcolato separatamente l’MFI
corrispondente MFI(0),MFI(1),…, MFI(K-1)

Fissata la classe k MFI(k) sarà composto da un certo numero di itemset
frequenti dove il v-esimo sarà della forma mfiv(k)={I1,I2,…,Ij} (ogni item I
è un valore discretizzato che indica un gene intervallo);

mfiv(k) può essere visto come una regola di associazione nella forma:
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Microarray Data Mining

MAXIMAL FREQUENT ITEMSETS: VALUTAZIONE

Siano allora date le regole di associazione per ogni classe e un campione sconosciuto
(discretizzato):

Possiamo allora valutare quante regole vengono soddisfatte, anche parzialmente per ogni classe.
Fissata la classe k e la regola r v valutiamo il campione sconosciuto assegnando uno score
EVAL cerca di tenere in considerazione il numero di item del campione contenute nella regola
insieme alla cardinalità della regola (più grande è la cardinalità più alto sarà lo score). Tale
score è normalizzato per la cardinalità dell’itemset.

41
Lo score finale per una data classe sarà allora dato da:
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Microarray Data Mining - Validazione

k-Fold Cross-Validation:
 Il training set è diviso in k gruppi distinti;
 Si usano k-1 gruppi come training set e il gruppo escluso come test
input;
 Processo iterato per ognuna delle k possibili scelte del gruppo tolto
dal training-set;
 Risultato: Media dei risultati;

Leave-one-out Cross-Validation:
 Si estra un elemento dal set di dati;
 Il set di dati meno l’elemento verrà usato come training set;
 L’elemento verrà usato come test input;
 Processo iterato;
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
TOOL
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Microarray Data Mining

RISULTATI: LVOCV

Ci siamo confrontati con uno dei più recenti ed efficienti metodi oggi
conosciuti (ANMM4CBR) su quattro dataset.
Dataset
ANMM4CBR
Nuovo Metodo
Leukemia
97.6
1
Colon
86.7
1
SRBCT
99.7
1
CGM
70.0
0.982
Yao B, Li S: ANMM4CBR: a case-based reasoning method for gene expression data classication.
Algorithms for Molecular Biology 2010, 5:14, [http://www.almob.org/content/5/1/14].
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Microarray Data Mining

RISULTATI: BLIND TEST
Dataset
ANMM4CBR
Nuovo Metodo
Leukemia
97.6
0,98
Colon
86.7
1
SRBCT
99.7
1
CGM
70.0
0.73
Yao B, Li S: ANMM4CBR: a case-based reasoning method for gene expression data classication.
Algorithms for Molecular Biology 2010, 5:14, [http://www.almob.org/content/5/1/14].
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