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Introduction of Bio-lab Technique And Its Application to DNA Computing School of Chemical Engineering Cell & Microbial Engineering Lab. Lee Eun Jeong DNA Computing Protocol Appropriate Reaction (Hybridization, Enzyme reaction etc.) Amplification Separation Detection Characteristic of DNA Hybridization Hairpin formation Triple hybridization Plasmid Introduction of un-common PCR Exclusive PCR (ePCR ) Whiplash PCR Real Time PCR Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR) Exclusive PCR (ePCR ) (1) Template가 되는 strand가 안정한 hairpin구조를 형성 할 경우, DNA polmerase가 steric hindrance를 받아 증 폭을 계속 할 수 없음 DNA strand 중 hairpin 구조를 형성하지 않은 strand 들만 증폭하게 되고, hairpin을 형성한 strand는 상대 적으로 극소수로 남게 됨 K. Sakamoto et al. : CNF-SAT problem을 푸는데, ssDNA molecule의 hairpin 형성과 ePCR 방법을 이용 ePCR (2) DNA Primer DNA polymerase 5` 3` Whiplash PCR 부족한 oligomer에 상보적인 sequence가 연속으로 오면 증폭이 멈춤 ‘goto’문에 이용, State transition (Sakamoto et al.) Real Time PCR (1) 형광 label된 oligonucleotide probe를 사용 원하는 product에 대한 signal만을 받아들 여 정확하게 정량 PCR의 product를 실시간으로 확인 : computing mechanism이 효율적으로 잘 이루어 지고 있는지의 확인에 이용 Real Time PCR (2) • 5'end : reporter dye labeling (ex.fluorescein) • 3'end : quencher dye labeling (ex.TAMRA) • Taq polymerase : 5' exonuclease activity : PCR extension 단계에 target 과 결합되어 있던 형광lable 된 hybridization probe를 절단 Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR) • High sensitivity • 소량의 mRNA로부터 cDNA를 얻어 분석 Application of Triple Hybridization Triple Hybridization (1) < Watson-Crick base-pair > < Hoogsteen base-pair > Triple Hybridization (2) Triple Hybridization (3) Probe로 이용 → Double strand에 third strand가 hybridization (TAC) → Third strand를 probe로 이용, dsDNA의 separation → Affinity Chromatography, Bead separation에 이용 Magnetic bar Triple Hybridization (4) Advantage → ssDNA의 unstability 극복 → dsDNA 상태로 검출되므로 Integrity의 손상을 입지 않고 separation이 가능 (기존의 방법은 denaturing step을 거침) Triple Hybridization (5) Example → SAT problem의 각 clause에 대한 True value와 결합 → MIS problem에서 edge로 연결된 vertex를 포함하는 subset의 제거 MIS problem - maximum independent set problem - G=(V,E)로 주어진 graph에서 edge로 연결된 vertex를 모두 포함하지 않는 subset S를 찾 는 문제 Triplet Formation을 이용한 MIS Problem Solving Strategy Library string synthesis Stable dsDNA library formation Split into two tube Passing through The affinity column immobilized the third strand of each edge’s variables Transfer the supernatant to one tube Repeat for the all edge Separation, Amplify & Sequencing SAT problem Triplet Formation을 이용한 SAT Problem Solving Strategy Library string synthesis Passing through The affinity column immobilized the third strand of each clause’s variables Eliminate the supernatant Make the column triplex-destabilizing condition Repeat to all clause Separation of the solution Amplify and Sequencing Plasmid Plasmid 세균의 세포 내에 염색체와 별개로 존재 독자적으로 증식 가능 고리모양의 유전자 세균이 증식할 때 함께 증폭됨 유전공학 기술에서 널리 응용되는 vector 재조합유전자 DNA합성에 유용한 도구 Plasmid Map Example Advantage of Plasmid Computation에 필요한 DNA plasmid를 구입하여 실험 목적에 적합하도록 변형시켜 사용 Plasmid의 환경(효소, buffer, 온도, 염의 농도 등) 변화 → plasmid 행동의 다양한 변화로, single plasmid로 computer와 유사 하게 구현 Computation 과정 내내 double strand로 유지됨 → ssDNA의 self-annealing이 일어나지 않음 PCR amplification 불필요 Bacteria (E. coli)에 transformation → stock을 만들어두면 저장이 편리하고 쉽게 다시 이용 가능 Plasmid를 이용한 Computing 예 (1) MIS problem (T. Head et al) - maximum independent set problem - vertex를 나타내는 ‘station’ sequence를 모두 포 함하는 DNA segment를 plasmid에 포함시킴 - 각 station의 양끝에 specific한 RE site 첨가 - edge로 연결되는 vertex 중 하나를 제거할 때 RE 이용 MIS에 이용된 plasmid Computing에 이용될 수 있는 Plasmid Technique Ampicillin resistance이용-Ampr sequence 사이에 fragment삽입 Gene coding sequence이용 - Protein assay (secretion 문제) E. coli의 lac Z gene이용 - lac Z gene 사이에 fragment 삽입 Replica Plate – 동일한 sequence지닌 plasmid 복제 Reference Molecular Computation by DNA Hairpin Formation, Kensaku Sakamoto et al. science vol. 288, 19 May 2000 State Transitions by Molecules, Kensaku Sakamoto et al. Biosystems 52 (1999) 81-91 Computing with DNA by operating on plasmids, Head et al., Biosystems 57 (2000) 87-93 Solution of a 20-Variable 3-SAT Problem on a DNA Computer, Ravinderjit S. Bralch et al. science vol. 296, 19 April 2002 Recombinant DNA, James D. Watson, Michael Gilman, Scientific American Books, 2nd ed. 1998 Triple-Helical Nucleic Acids, Valery N. Soyfer, Vladimir N. Potaman, Springer-Verlag New York, Inc. 1996 Brock Biology of Microorganisms, Madigan, Martinko, Parker, Prentice Hall, 9th ed., 2000