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Introduction of Bio-lab Technique
And Its Application to
DNA Computing
School of Chemical Engineering
Cell & Microbial Engineering Lab.
Lee Eun Jeong
DNA Computing Protocol
Appropriate Reaction
(Hybridization, Enzyme reaction etc.)
Amplification
Separation
Detection
Characteristic of DNA
Hybridization
Hairpin formation

Triple hybridization

Plasmid
Introduction of
un-common PCR
Exclusive PCR (ePCR )
Whiplash PCR
Real Time PCR
Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)
Exclusive PCR (ePCR ) (1)
Template가 되는 strand가 안정한 hairpin구조를 형성
할 경우, DNA polmerase가 steric hindrance를 받아 증
폭을 계속 할 수 없음
DNA strand 중 hairpin 구조를 형성하지 않은 strand
들만 증폭하게 되고, hairpin을 형성한 strand는 상대
적으로 극소수로 남게 됨
K. Sakamoto et al.
: CNF-SAT problem을 푸는데, ssDNA molecule의 hairpin
형성과 ePCR 방법을 이용
ePCR (2)
DNA Primer
DNA polymerase
5`
3`
Whiplash PCR
부족한 oligomer에 상보적인 sequence가 연속으로
오면 증폭이 멈춤
‘goto’문에 이용, State transition (Sakamoto et al.)
Real Time PCR (1)
형광 label된 oligonucleotide probe를 사용
원하는 product에 대한 signal만을 받아들
여 정확하게 정량
PCR의 product를 실시간으로 확인
: computing mechanism이 효율적으로 잘 이루어
지고 있는지의 확인에 이용
Real Time PCR (2)
• 5'end
: reporter dye labeling
(ex.fluorescein)
• 3'end
: quencher dye labeling
(ex.TAMRA)
• Taq polymerase
: 5' exonuclease activity
: PCR extension 단계에 target 과 결합되어 있던
형광lable 된 hybridization probe를 절단
Reverse Transcriptase-PCR
(RT-PCR)
• High sensitivity
• 소량의 mRNA로부터 cDNA를 얻어 분석
Application of
Triple Hybridization
Triple Hybridization (1)
< Watson-Crick base-pair >
< Hoogsteen base-pair >
Triple Hybridization (2)
Triple Hybridization (3)
Probe로 이용
→ Double strand에 third strand가 hybridization (TAC)
→ Third strand를 probe로 이용, dsDNA의 separation
→ Affinity Chromatography, Bead separation에 이용
Magnetic bar
Triple Hybridization (4)
Advantage
→ ssDNA의 unstability 극복
→ dsDNA 상태로 검출되므로
Integrity의 손상을 입지 않고 separation이 가능
(기존의 방법은 denaturing step을 거침)
Triple Hybridization (5)
Example
→ SAT problem의 각 clause에 대한 True value와 결합
→ MIS problem에서 edge로 연결된 vertex를 포함하는
subset의 제거
MIS problem
- maximum independent set problem
- G=(V,E)로 주어진 graph에서 edge로 연결된
vertex를 모두 포함하지 않는 subset S를 찾
는 문제
Triplet Formation을 이용한
MIS Problem Solving Strategy
Library string
synthesis
Stable dsDNA
library formation
Split into two tube
Passing through The affinity column
immobilized the third strand of each edge’s
variables
Transfer the supernatant
to one tube
Repeat for the all edge
Separation,
Amplify & Sequencing
SAT problem
Triplet Formation을 이용한
SAT Problem Solving Strategy
Library string
synthesis
Passing through The affinity column
immobilized the third strand of each clause’s
variables
Eliminate the supernatant
Make the column
triplex-destabilizing condition
Repeat to all clause
Separation of the solution
Amplify and Sequencing
Plasmid
Plasmid
세균의 세포 내에 염색체와 별개로 존재
독자적으로 증식 가능
고리모양의 유전자
세균이 증식할 때 함께 증폭됨
유전공학 기술에서 널리 응용되는 vector
재조합유전자 DNA합성에 유용한 도구
Plasmid Map Example
Advantage of Plasmid
Computation에 필요한 DNA plasmid를 구입하여
실험 목적에 적합하도록 변형시켜 사용
Plasmid의 환경(효소, buffer, 온도, 염의 농도 등) 변화
→ plasmid 행동의 다양한 변화로, single plasmid로 computer와 유사
하게 구현
Computation 과정 내내 double strand로 유지됨
→ ssDNA의 self-annealing이 일어나지 않음
PCR amplification 불필요
Bacteria (E. coli)에 transformation
→ stock을 만들어두면 저장이 편리하고 쉽게 다시 이용 가능
Plasmid를 이용한 Computing 예 (1)
MIS problem (T. Head et al)
- maximum independent set problem
- vertex를 나타내는 ‘station’ sequence를 모두 포
함하는 DNA segment를 plasmid에 포함시킴
- 각 station의 양끝에 specific한 RE site 첨가
- edge로 연결되는 vertex 중 하나를 제거할 때 RE
이용
MIS에 이용된 plasmid
Computing에 이용될 수 있는
Plasmid Technique
Ampicillin resistance이용-Ampr sequence 사이에 fragment삽입
Gene coding sequence이용 - Protein assay (secretion 문제)
E. coli의 lac Z gene이용 - lac Z gene 사이에 fragment 삽입
Replica Plate – 동일한 sequence지닌 plasmid 복제
Reference
Molecular Computation by DNA Hairpin Formation, Kensaku
Sakamoto et al. science vol. 288, 19 May 2000
State Transitions by Molecules, Kensaku Sakamoto et al. Biosystems
52 (1999) 81-91
Computing with DNA by operating on plasmids, Head et al.,
Biosystems 57 (2000) 87-93
Solution of a 20-Variable 3-SAT Problem on a DNA Computer,
Ravinderjit S. Bralch et al. science vol. 296, 19 April 2002
Recombinant DNA, James D. Watson, Michael Gilman, Scientific
American Books, 2nd ed. 1998
Triple-Helical Nucleic Acids, Valery N. Soyfer, Vladimir N. Potaman,
Springer-Verlag New York, Inc. 1996
Brock Biology of Microorganisms, Madigan, Martinko, Parker,
Prentice Hall, 9th ed., 2000