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DISS. ETH NO. (22792)
Genome-wide RNAi screening approaches to generate an
inventory of human ribosome biogenesis factors
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Lukas Badertscher
Master of Science in Molecular Biology, University of Basel
th
Born June 24 , 1984
Basel, Switzerland
Accepted on the recommendation of
Prof. Ulrike Kutay, examiner
Prof. Witold Filipowicz, co-examiner
Prof. Matthias Peter, co-examiner
2015
Summary
Ribosome biogenesis is one of the most energy consuming and fundamental
processes of the cell. The complexity of this tremendous cellular task is reflected
by the fact that more than 200 non-ribosomal proteins, termed trans-acting
factors, assist in the assembly of both ribosomal subunits in eukaryotes. The
identity of these factors has mainly been derived from studies performed in yeast,
yet, surprisingly little is known about ribosome synthesis in human cells despite
its central role for cellular homeostasis.
In this thesis, we used visual read-outs to follow the maturation routes of both
pre-40S and pre-60S ribosomal particles in combination with RNAi, which
enabled us to systematically identify factors that support the synthesis of
ribosomes in human cells. In a first step, we investigated the contribution of
about 500 candidate factors to ribosome production. Among others, these genes
included ribosomal proteins and human homologs of yeast ribosome synthesis
factors. We are able to demonstrate that core features of ribosome assembly are
highly conserved between yeast and humans. However, certain interspecies
adaptations were observed, for example a contribution of exportin 5 to 60S
subunit export from the nucleus in human cells.
In a second step, the screening approaches were consequently extended to a
genomic scale, which not only allowed generating a first inventory of human
ribosome biogenesis factors for both ribosomal subunits, but also highlighting
analogies and differences between 40S and 60S maturation. Interestingly, the
biogenesis of 40S subunits is highly sensitive to strong 60S maturation defects as
indicated by the presence of RPL proteins in both hit lists. In contrast, depletion
of RPS proteins and 40S biogenesis factors did not affect 60S biogenesis to
similar extents, suggesting that an imbalance in 60S subunit production is sensed
III by cells to maintain subunit balance. Another identified cellular hub required for
ribosome production is the ubiquitin-proteasome system. Impaired proteasome
function affects early biogenesis steps of both subunits. Our data suggests a
potential involvement of CUL4-RING E3 ubiquitin ligases in this process.
Remarkably, we identified a novel vertebrate-specific ribosome synthesis factor,
named RBIS, which acts downstream of rRNA transcription and supports
maturation of both ribosomal subunits, indicated by nucleoplasmic accumulation
of pre-40S and pre-60S particles and a reduction of mature 18S and 28S rRNA
after its depletion. We provide evidence that RBIS is present on pre-ribosomal
particles. Based on its striking resemblance to ribosomal proteins it is likely that
this factor is capable of binding to the negatively charged rRNA backbone. The
importance of RBIS in production of ribosomes was further substantiated by its
conserved function in numerous different human cell lineages.
Moreover, our data revealed a central role of GLUL, the human glutamine
synthetase, in ribosome synthesis. Interestingly, especially the efficient production
of 40S subunits appeared to be hypersensitive not only to changes in extracellular
glutamine levels, but also required intracellular glutamine synthesis. Numerous
cancer cells are addicted to glutamine and this might be connected to the massive
production of ribosomes in these cells.
In conclusion, our screening approaches allowed generating a first overview of
human ribosome synthesis factors for both ribosomal subunits on a genomic scale.
Remarkably, several of the identified genes have been connected to human
diseases, often associated with cancer susceptibility. This emphasizes the central
role of ribosome synthesis in organismal homeostasis and it is likely that more
disease-causing mutations in genes encoding for ribosome synthesis might be
discovered.
IV Zusammenfassung
Die Ribosomenbiogenese ist einer der am meisten Energie verbrauchenden und
fundamentalen Prozesse der Zelle. Die Komplexität dieser gewaltigen zellulären
Aufgabe wird durch die Tatsache reflektiert, dass in Eukaryoten mehr als 200
nicht-ribosomale Proteine, bezeichnet als trans-wirkende Faktoren, beim Aufbau
der beiden ribosomalen Untereinheiten helfen. Die Identität dieser Faktoren
stammt hauptsächlich aus Studien, welche in Hefe durchgeführt wurden, jedoch
ist
überraschenderweise
wenig
bekannt
über
die
Ribosomensynthese
in
menschlichen Zellen - trotz ihrer zentralen Rolle für die zelluläre Homöostase.
In dieser Arbeit haben wir visuelle Marker in Kombination mit RNAi verwendet,
um die Reifungswege beider, prä-40S und prä-60S, ribosomalen Partikel zu
verfolgen, was uns ermöglichte, systematisch Faktoren zu identifizieren, die die
Synthese von Ribosomen in menschlichen Zellen unterstützen. In einem ersten
Schritt untersuchten wir den Beitrag von etwa 500 Kandidatenfaktoren für die
Ribosomenproduktion. Diese Gene beinhalteten unter anderem ribosomale
Proteine und humane Homologe der Hefe Ribosomensynthesefaktoren. Wir sind
in der Lage zu zeigen, dass Kernmerkmale des Ribosomenanfertigung stark
zwischen
Hefe
und
Menschen
konserviert
sind.
Jedoch
wurden
gewisse
artspezifische Anpassungen beobachtet, so zum Beispiel ein Beitrag von Exportin
5 zum Export der 60S-Untereinheit aus dem Zellkern in humanen Zellen.
In einem zweiten Schritt wurden die Screening-Ansätze infolgedessen auf eine
genomische Stufe ausgeweitet, was nicht nur erlaubte das erste Inventar von
menschlichen Ribosomenbiogenesefaktoren für beide ribosomale Untereinheiten
herzustellen, sondern auch die Übereinstimmungen und Unterschiede zwischen
40S und 60S Reifung beleuchtete. Interessanterweise ist die Biogenese der 40S
Untereinheiten sehr empfindlich gegenüber starken 60S Reifungsdefekten, was
V durch die Anwesenheit von RPL Proteinen in beiden Trefferlisten angezeigt wird.
Im Gegensatz dazu hatte eine Depletion von RPS Proteinen und 40S
Biogenesefaktoren keinen Einfluss auf 60S Biogenese in ähnlichem Ausmass, was
andeutet, dass ein Ungleichgewicht in der Produktion der 60S-Untereinheit von
Zellen erfasst wird, um das Gleichgewicht zwischen den Untereinheiten zu
erhalten. Ein weiterer identifizierter zellulärer Knotenpunkt, der für die
Ribosomenproduktion benötigt wird, ist das Ubiquitin-Proteasom-System. Eine
gestörte
Proteasomfunktion
beeinflusst
frühe
Biogenese
Schritte
beider
Untereinheiten. Unsere Daten deuten auf eine mögliche Beteiligung von CUL4RING E3 Ubiquitin Ligasen in diesem Prozess hin.
Bemerkenswert
ist,
dass
wir
einen
neuen,
Vertebraten
spezifischen
Ribobosomensynthesefaktor, genannt RBIS identifiziert haben, der nach der
rRNA Transkription wirkt und die Reifung beider ribosomalen Untereinheiten
unterstützt, angedeutet durch nukleoplasmatische Anhäufung von prä-40S und
prä-60S Partikeln, und einer Reduktion von reifer 18S und 28S rRNA nach
dessen Depletion. Wir erbringen den Nachweis, dass RBIS auf prä-ribosomalen
Partikeln vorhanden ist. Basierend auf seiner verblüffenden Ähnlichkeit mit
ribosomalen Proteinen ist es wahrscheinlich, dass dieser Faktor fähig ist, an das
negativ geladene rRNA Rückgrat zu binden. Die Wichtigkeit von RBIS in der
Produktion von Ribosomen wurde durch seine konservierte Funktion in
zahlreichen verschiedenen menschlichen Zelllinien zusätzlich untermauert.
Darüber hinaus, haben unsere Daten eine zentrale Rolle für GLUL, der
menschlichen
Glutaminsynthetase,
in
der
Ribosomensynthese
enthüllt.
Interessanterweise erschien insbesondere die effiziente Produktion von 40SUntereinheiten überempfindlich nicht nur auf Veränderungen des extrazellulären
Glutaminpegels,
VI sondern
benötigte
auch
intrazelluläre
Glutaminsynthese.
Zahlreiche Krebszellen sind abhängig von Glutamin und dies könnte verbunden
sein mit der massiven Produktion von Ribosomen in diesen Zellen.
Zusammengefasst erlaubten unsere Screening Ansätze das Erzeugen eines ersten
Überblicks über menschliche Ribosomensynthesefaktoren für beide ribosomale
Untereinheiten auf einer genomischen Stufe. Bemerkenswerterweise wurden
mehrere der identifizierten Gene mit menschlichen Krankheiten in Verbindung
gebracht, oftmals assoziiert mit Krebsanfälligkeit. Dies betont die zentrale Rolle
der Ribosomensynthese für die Homöostase des ganzen Organismus und es ist
wahrscheinlich, dass noch mehr krankheitsverursachende Mutationen in Genen,
die für Ribosomensynthesefaktoren kodieren, entdeckt werden könnten.
VII