Download Análise de expressão gênica

Universidade Federal do Espírito Santo
Laboratório de Biotecnologia Aplicado ao Agronegócio
Análise de expressão gênica
Fernanda Bravim
EXPRESSÃO GÊNICA
• Processo pelo qual a informação
contida em um gene é traduzido
em estruturas presentes em
um determinado tipo
celular (mRNA ou proteínas).
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA
• Nos microrganismos o controle da expressão gênica serve
principalmente para permitir que as células se ajustem às
mudanças nutricionais no ambiente, de forma que o seu
crescimento e divisão sejam otimizados;
•Em organismos multicelulares a expressão gênica controlada
regula
um
programa
genético
fundamental
para
o
desenvolvimento embrionário e a diferenciação.
ERA “ÔMICA”
Coleção de RNAs
Estuda o conjunto de
(transcritos) presentes
proteínas e suas
em uma célula/tecido
isoformas contidas em
em
uma célula/tecido que
um dado momento
são determinadas pelo
genoma da mesma
A metabolômica é o
estudo que visa
identificar e
quantificar o
conjunto de
metabólitos
produzidos e/ou
modificados por um
organismo
• O acumulo exponencial de sequencias gênicas e genomas depositados em bancos de
dados públicos mundiais têm aumentado consideravelmente a demanda por
metodologias que permitam sua identificação funcional ou confirmação de
homologia, além da elucidação dos padrões de expressão
ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA EM LARGA ESCALA
• Identificação de todos os RNAs expressos em um dado organismo ou tecido;
• Comparação do perfil de expressão gênica em diferentes condições ambientais,
estados patológicos, fisiológicos ou de desenvolvimento;
• Caracterização de polimorfismos associados aos genes transcritos: formas
alternativas de splicing e SNPs (- Variações na sequencia de DNA dos humanos
pode afetar como eles desenvolvem as doenças e respondem aos patógenos, as
drogas e as vacinas – medicina personalizada).
QUAIS INFORMAÇÕES PODEM SER OBTIDAS
ATRAVÉS DA ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA?
• Identificação de genes e vias moleculares envolvidas em processos
biológicos: genes com perfil de expressão semelhante podem estar funcionalmente
relacionados ou sob o mesmo mecanismo e controle;
- Manipulação de drogas;
- Melhoramento de plantas;
• Fornecer pistas sobre as funções de genes ainda não caracterizados a partir do
estudo do padrão espacial (localização sub-celular) e temporal de expressão;
• Identificar marcadores para diagnóstico molecular de doenças;
•Podem ainda indicar alterações no proteoma e/ou metaboloma.
ANÁLISE FEITA DE MODO COMPARATIVO
• Expressão do conjunto de genes em um tecido tumoral X os genes
encontrados em amostras controle de tecido normal;
• Traçar o perfil de expressão gênica em uma determinada anomalia,
fazendo a investigação em um determinado nº de indivíduos (ou
organismos) portadores dessa anomalia;
• Identificação de genes envolvidos em numerosos processos biológicos;
- Identificação de genes expressos durante diferentes etapas do
desenvolvimento;
- Identificação e comparação de genes expressos diferencialmente em
tecidos normais e malignos;
- Diagnóstico, avaliação, prognóstico.
MÉTODOS PARA ESTUDO DE TRANSCRITOMA
A quantidade de expressão de um gene em uma célula pode ser medida pelo
número de cópias de um transcrito de mRNA de um determinado gene
presente em uma amostra. Para detectar e quantificar a expressão gênica
de pequenas quantidades de RNA, a amplificação dos genes transcrito é
necessária.
Permitem a quantificação do nível de expressão gênica
• Northem Blot
• RT-PCR – qRT-PCR;
Uma técnica usada para
É
usado
para a quantificação do
• SAGE (Serial Analysis of Gene Expression); produzir um
rápida população
transcriptoma e análise
de mRNA em uma amostra de
estutural .
• Microarrays de DNA;
interesse na forma de pequenas
Next-generation sequencing
etiquetas que corresponde a
technology.
• RNA-seq
fragmentos desses transcritos
A levedura Saccharomyces cerevisiae
• Organismo-modelo
Espécies diferentes
Respostas no organismo modelo
outras
Processos similares
parcialmente aplicadas a
1- Ascomiceto unicelular;
2- São muito utilizadas nas indústrias de fermentação,
para a produção de bebidas, biocombustível e massas;
3- Linhagens laboratoriais são haploide;
4- São a E. coli do eucariotos:
A levedura Saccharomyces cerevisiae
- São pequenas;
- Completam seu ciclo de vida em 90 min;
- Podem ser cultivadas em meios de cultura muito facilmente;
- Produzem colônias quando plaqueadas (mutações e “replica-plate”);
- Ciclo de divisão mitótico.
5- Não são patogênicas;
6- Genoma sequenciado desde 1996.
A levedura Saccharomyces cerevisiae
• Principais contribuições:
1- Ciclo celular:
- Etapas específicas na progressão do ciclo celular;
- Controles anormais da divisão celular que levam ao câncer humano.
2- Recombinação:
- Crossing over.
3- Genética mitocondrial:
- Estrutura do genoma mitocondrial.
4- Genética do tipo reprodutivo:
- Transdução de sinal durante a detecção e
resposta aos hormônios reprodutivos do tipo oposto.
5- Genética da senescência
Saccharomyces cerevisiae AND cell cycle
AND cancer
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term
=saccharomyces+cerevisiae+AND+cell+cy
cle+AND+cancer
GENOMA
Genoma sequenciado desde 1996.
GENOMA
1- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)
• Um dos variantes da PCR;
• Utilizada em biologia molecular para detectar
os níveis de expressão de RNA;
• Para a reação o RNA é primeiro convertido
em cDNA usando a transcriptase reversa;
• O cDNA será usado como template para a
amplificação exponencial usando PCR;
• Qualquer gene pode ser detectado por esta técnica??
 RT-PCR semiquantitativo ou relativo:
• Envolve a amplificação de um controle interno simultaneamente com o
gene de interesse;
Controle interno
Normalizar as amostras
• Depois de normalizado: comparação dos transcritos;
• Comparar os níveis dos transcritos em diferentes amostras.
 Aplicações:
- Pesquisa;
- Diagnóstico de doenças genéticas;
- Detecção de câncer.
Controle
50 MPa
15
30
60
 qRT-PCR: Real-time RT-PCR / Real-time PCR
• É usada para amplificar e simultaneamente
quantificar uma molécula de DNA alvo;
• Detecção e quantificação;
• Quantificação: absoluta ou relativa;
• Técnica EFICIENTE, SENSÍVEL e RÁPIDA;
• Segue o mesmo principio da PCR – Porém a detecção acontece em tempo
real (na fase exponencial da ciclagem);
• A quantidade de DNA é medida depois de cada ciclo pelas sondas
fluorescentes;
• Equipamento: capacidade
fluorescência das sondas;
de ciclagem termal e
de capturar a
• Plot de amplificação: representa o acumulo de produto pela duração da
reação
• Sondas fluorescentes:
 Não-específicas: se ligam a qualquer fita dupla de DNA
• Um aumento na quantidade de DNA/RNA conduz a um aumento na
intensidade de fluorescência e é medido a cada ciclo;
• SYBR Green;
• Produtos de PCR não específicos: dímeros
• 1 Par de primers: redução do custo.
• Sondas fluorescentes:
 Sequencias-específicas: detecta apenas o DNA contido na sequencia da
sonda
• 2 primer e a sonda TaqMan;
• Especificidade maior.
Barras brancas: 50 MPa
Barras pretas: 50 MPa + 15 min
2- Microarray ou DNA chip
• Medir o nível de expressão de vários genes simultaneamente;
• Os arranjos pré-definidos de moléculas de DNA são quimicamente
ligadas à uma superfície sólida (lâminas de microscópio);
• As amostras são postas para
hibridar com o DNA fixado no
array (complementariedade de
bases). A detecção é possível
pois as amostras são
"marcadas" com fluorocromos
cianina 3 (Cy3) ou
cianina 5 (Cy5)
Vermelho: expressos
Verde: reprimidos
Preto: não há diferença na expressão
Vermelho: expressos
Verde: reprimidos
Preto: não há diferença na expressão
 Análise dos dados por análise de bioinformática
• Quantidade grande de dados geradas
Genes classificados em diferentes categoria do MIPS-CYGD
• Poucas variações na expressão imediatamente após o tratamento e
aumento após o tratamento;
• Classe 4: Defesa celular (estresse oxidativo e osmótico)
• Classe 9: energia – Ácido cítrico, fermentação e fosforilação oxidativa,
genes relacionados a síntese de metionina e glutamato.
Este artigo identificou os fatores de transcrição ativados
durante um tratamento sub-letal de pressão hidrostática,
utilizando diferentes ferramentas de bioinformática.
• Foram identificados os fatores de transcrição e seu correspondentes motivos de
DNA e RNA em resposta a alta pressão hidrostática.
• Além disso, foi observado que diferentes motivos estão presentes na promoção
de genes induzidos ou reprimidos durante o tratamento de pressão hidrostática.
• Os genes ativados imediatamente após a pressão estão relacionados com a
adaptação e ao crescimento, enquanto genes envolvidos na parada do
ciclo celular e metabolismo energético continuam expressos 15 min após o
tratamento.
• Os genes que fazem parte de um
módulo altamente conectado
normalmente fazem parte de
importantes processos biológicos;
• Motivos relacionados a genes
associados com metabolismo de energia
e resposta a estresse;
• Estes genes normalmente estão
superexpressos
• Cor do círculo: maior abundância de
conexões
• Genes relacionados ao complexo
proteossomico compartilham o mesmo
motivo em ambos os módulos.
• Msn2/4 pode estar relacionados na
transcrição de genes envolvidos na
degradação de proteínas via
proteossomo.
• O módulo B:
• Motivos relacionados a genes
requeridos para a síntese de
RNA , DNA e proteínas.
• Maioria está reprimida.
Rgm1p: envolvido na repressão de processos necessários para o crescimento
celular normal;
Cin5: resposta a estresses;
Abf1p: controle do crescimento celular;
Oaf1p: beta-oxidação de ácido graxo.
AGRADECIMENTOS
OBRIGADA!
Fernanda Bravim
[email protected]