Download Download, PDF - Indonesia Veterinary Pharmacy and

Makalah ilmiah-4
The high performance liquid chromatography validation method of
Doxycycline for residue study in broiler
Agustina Dwi Wijayanti1, R. Gagak Donny Satria2
1,2
Faculty of Veterinary Medicine Gadjah Mada University, Yogyakarta
Jl. Fauna 2, Karang Malang, Yogyakarta 55281 Telp/fax: (0274) 560861
Abstract
The simple, precise and accurate reversed-phase liquid chromatography method
had developed and validated for the determination of doxycycline residue in broiler
meat. The novel commercial drugs of doxycycline have been used as the preventive
agent in broiler and give the risk of accumulated drug in tissues as the consequence
of drug which has widely penetration and distribution. The confirmation method of
residue need to be established for doxycycline. The composition of mobile phase
was acetonitrile:methanol:oxalatic acid solution 0.126% (3:1:6). Separation and
quantification was achieved on a fused silica capillary column (Shimpack ODS
column) with diameter 5µm and 150mm length, equipped with degasser, detector
spectrophotometer uv-vis and controller system. The limit of detection (LOD) of
doxycycline was 0.01µg/mL and limit of quantification (LOQ) was 0.05µg/mL. The
intraday and interday recoveries were 82-104% and 85-105% and precision as
CV% were 0.86 and 1.02 respectively. The spiking of drug on musculus resulted
100.6-100.9% of recoveries and precision as CV% were 0.68-1.79, respectively.
Keywords: Validation method, Doxycycline, Broiler, HPLC.
Pendahuluan
Doksisiklin sebagai turunan tetrasiklin memiliki distribusi yang lebih luas dan
aktivitas farmakologik melebihi golongan tetrasiklin sebelumnya (Prats et al., 2005).
Senyawa ini telah banyak diproduksi sebagai obat veteriner, termasuk diantaranya
untuk pencegahan dan pengobatan infeksi pada unggas. Pemakaian doksisiklin
pada unggas produksi menyebabkan residu dikarenakan sifat penetrasi jaringan
yang tinggi serta mampu menembus cairan serebrospinal, prostat dan mata (Plumb,
1999). Sifat distribusi dan penetrasi doksisiklin yang tinggi sangat memungkinkan
terjadinya residu obat pada jaringan broiler. Kontrol residu antibiotik diperlukan
untuk mengidentifikasi adanya residu dalam produk. Metode screening perlu
diteguhkan dengan metode konfirmasi untuk dapat mengukur kadar residu dari
sampel. Penelitian ini dilakukan untuk melihat tingkat validasi metoda pengukuran
yang ditentukan secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC) untuk
dapat diaplikasikan dalam studi residu pada broiler.
Doksisiklin merupakan bentuk turunan dari oksitetrasiklin dan memiliki waktu
paruh lebih panjang dan ekskresi lebih lama. Aktivitasnya secara in vitro dua kali
lebih besar dibandingkan tetrasiklin (Brander et al., 1991). Menurut Prats et al.
(2005) aktivitas farmakokinetik doksisiklin melebihi golongan tetrasiklin sebelumnya
dalam arti lebih larut lemak, absorpsi lebih baik, distribusi jaringan lebih luas,
eliminasi lebih lama dan afinitas yang rendah terhadap kalsium (Riond dan Riviere,
1990 serta Goren et al., 1998).
Penelitian mengenai profil farmakokinetik jaringan doksisiklin pada broiler
menunjukkan bahwa obat ternyata lebih banyak ditemukan dalam jaringan hati,
ginjal dan otot dibandingkan dalam plasma (Ismail dan El-Kattan, 2004 serta
Wijayanti et al., 2009). Analisis antibiotika golongan tetrasiklin dalam muskulus pada
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
1
Makalah ilmiah-4
ayam telah dilakukan oleh beberapa peneliti. Schneider dan Chen (2004)
melakukan ekstraksi sampel daging ayam diantaranya dengan bufer McIlvine-EDTA
dan sentrifugasi serta memperoleh kadar residu tetrasiklin, oksitetrasiklin dan
klortetrasiklin masing-masing terdeteksi sebesar 100ng/gram pada pembacaan
gelombang 615 nm. Metode lain dikembangkan oleh Schneider dan Lehotay (2004)
berupa homogenisasi sampel muskulus ayam dengan asetronitril dan amonium
hidroksida, kemudian dilanjutkan proses sentrifugasi serta pembacaan supernatan
pada panjang gelombang 505nm.
Metode pemisahan dengan kromatografi cukup baik digunakan untuk
mengidentifikasi senyawa-senyawa antibiotika. Analisis dengan HPLC (High
Performance Liquid Chromatograph) saat ini merupakan metoda yang paling efektif
(method of choice) (Moats, 1992).
Materi dan metode
Bahan -bahan yang digunakan adalah obat standar doksisiklin hyclate ( D9891, untuk HPLC, Sigma-Aldrich, USA), Bufer McIlvine dan Mc Ilvine Ethylen
Diamine Tetra Acetid Acid (Mc Ilvine EDTA), metanol dan asetonitril ( untuk HPLC ,
Merck, Jerman), Aquabidest ( Ikapharmindo Putramas, Jakarta. Analisis kadar
menggunakan seperangkat HPLC merek Shimadzu versi 6,1 dengan kolom C18
Shimpack ODS diameter 5 μm dan panjang 150 μm, LC-10Advp, Detektor UV SPD10A, controller system SCL-10Avp,oven CTO-10Avp dan degasser DGU-14.
Penelitian dibagi menjadi beberapa tahap yaitu untuk melihat linearitas, profil
peak, presisi dan akurasi dari obat standar.Tahap untuk mengukur spesifisitas
dinyatakan dengan melihat tingkat linearitas dan profil peak. Dari larutan standar
dibuat berbagai konsentrasi yaitu 0,05, 0,5, 0,1, 1, 10 dan 25 mg/mL kemudian
diinjeksikan (perulangan 6x) ke HPLC sebanyak 20 µg/mL. Spiking obat dalam
jaringan (muskulus) broiler juga dibuat dengan pengenceran 0,5, 0,1 dan 10 µg/mL.
Ekstraksi jaringan dilakukan menurut metode AOAC internasional (AOAC, 1996)
menggunakan bufer Mc Ilvine EDTA dan serial homogenisasi dan sentrifugasi.
Presisi dihitung dengan melihat nilai rekoveri dan akurasi dihitung berdasarkan
CV% (rerata standar deviasi dibagi perulangan dikalikan 100%).
Diskusi
Beberapa komposisi fase gerak telah dicoba dan disimpulkan bahwa
penambahan metanol menyebabkan waktu elusi senyawa bertambah dan resolusi
peak tidak terlalu baik (tailing). Penambahan larutan asam oksalat mampu
memperpendek waktu elusi dan memperbaiki profil peak menjadi lebih sempit,
sehingga
diperoleh
komposisi
optimal
mobile
phase
adalah
asetonitril:metanol:larutan asam oksalat (0,126%) dengan perbandingan 3:1:6.
Pengaturan alat dipilih dengan laju alir 1 mL/menit, detector uv 346 nm, suhu kolom
30 °C dan volume injeksi 20 µL.
Spesifisitas dilihat dengan melihat kemampuan alat dalam memberikan respon
terhadap sampel, yaitu terhadap obat standar dan spiking obat dalam jaringan
(otot). Terhadap obat standar dan spiking obat dalam jaringan, masing-masing
dibuat serangkaian pengenceran dengan respon seperti dalam Tabel 1. Nilai kadar
obat terendah yang mampu dideteksi (LOD) adalah 0,01µg/mL dan nilai terendah
yang mampu dikuantifikasi (LOQ) adalah 0,05µg/mL.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
2
Makalah ilmiah-4
Tabel 1. Parameter analitik untuk kurva kalibrasi doksisiklin
___________________________________________________________________________
Senyawa
Matrik
Kisaran konsentrasi
Persamaan regresi Koefisien korelasi
___________________________________________________________________________
Doksisiklin fase gerak 0,05-25 µg/mL
Y=2349,2+20796,2x r= 0,99
Doksisiklin muskulus 0,5 - 10 µg/mL
Y=5153,2+995,4x
r=0,99
___________________________________________________________________________
Profil peak doksisiklin terlihat jelas dan tidak tumpang tindih (overlap) dengan
puncak senyawa lain (Gambar 1a dan 1b). Tingkat ketelitian dan ketepatan
pengukuran dinyatakan dengan nilai kesalahan acak (CV%) dan rekoveri intraday
dan interday. Nilai presisi dinyatakan dengan tingkat kesalahan acak (CV%) dan
didapatkan hasil 0,86 (intraday) dan 1,02 (interday). Sementara nilai akurasi
dinyatakan dengan rekoveri dan didapatkan hasil 82-104% (intraday) dan 85-105%
(interday). Hasil spiking obat dalam jarigan otot (muskulus) memberikan nilai akurasi
100,60-100,90% dan presisi 0,68-1,79%.
Gambar 1a. Profil peak doksisiklin sebagai larutan standar dalam fase gerak
dengan waktu retensi 2,650 menit
Gambar 1b. Profil peak doksisiklin dalam spiking muskulus broiler dengan
waktu retensi 2,408 menit.
Menurut Snyder et al., (1997) nilai akurasi cukup baik jika kurang dari 10% dari
nilai sesungguhnya, yaitu 90-110%, sementara presisi dikatakan baik jika dalam
kisaran 10-20% dari nilai sesungguhnya. Suatu metode analisis untuk penelitian
dengan sampel biologis akan memenuhi syarat ketepatan apabila nilai ratarata perolehan kembali berkisar 15 % (85 – 115%) dari nilai sebenarnya,
sedangkan syarat ketelitian dipenuhi jika koefisien variasi (CV) kurang dari 15 %.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
3
Makalah ilmiah-4
Kesimpulan
Berdasarkan hasil validasi , maka metoda analisis secara HPLC untuk
mengukur kadar residu doksisiklin dalam muskulus broiler dalam penelitian ini
memiliki spesifisitas, presisi dan akurasi yang tinggi.
Daftar pustaka
AOAC, 1986. Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th ed. Food
composition, Additives, Natural contaminants. Vol I & II. Pub. By AOAC
International. Maryland. USA. 123-130.
Brander, G.C.,
Pugh, R.J., and Bywater, W.L., 1991. Veterinary Applied
Pharmacology and Therapeutics.5th ed. Bailliere Tindall ELBS. 436,467-473.
Goren, E., De-Jong W.A., Doornenbal P., and Laurense T. 1998. Therapeutic
efficacy of doxycycline hyclate in experimental Escheria Coli infection in broilers.
Vet.Q,. 10.48-52.
Ismail, M.M. and El-Kattan, Y.A. 2004. Dispotition kinetics of doxycycline in
chickens naturally infected with Mycoplasma gallisepticum. Brit. Poultry
Sci. 45 (4.5): 550-556.
Moats, W.A., 1992, Analysis of Antibiotic Drug Residues in Food Products of
Animals Origin, 133-135, Edited by V.K. Agarwal,
Plenum Press,
New York.33-44.
Plumb, D.C., 1999, Veterinary Drug Handbook, 3rd ed. 122-123, Iowa State
University Press/Ames. 125-130.
Prats C., Elkorchi G., Giralt M.,Cristofol C., Pena J., Zorrilla I., Saborit J.,and Perez
B. 2005. PK and PK/PD of doxycycline on drinking water after therapeutic use in
pigs. J Vet Pharmacol Ther .,28: 525-530.
Riond J.L., and Reviere J.E. 1990. Pharmacokinetic and metabolic inertness of
doxycycline in young pigs. Am J Vet Res.,51:1271-1275.
Schneider, M. and Chen,G. 2004. Time-resolved luminescence screening assay for
tetracyclines in chicken muscles. Anal. Chem. Acta : Aug.2004.
Schneider, M. and Lehotay, S. 2004. A rapid fluorescence screening assay for
tetracyclines in chicken muscle. J. AOAC Int. May.2004.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch J.L. 1997. Practical HPLC Method
Development.2nd ed. John Wiley & Son, Inc. New York.1-22,686-700.
Wijayanti, A. D., L. Hakim, I. Widiyono, & T. Irianti. 2009. Pharmacokinetic profile
and pharmacokinetic / phrmacodynamic (PK/PD) parameter of doxycycline in
broiler plasma and tissues after single dose intravenous administration. Media
Ked. Hew. Journal 25:104-109.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
4