Download Summary

172
|
Addenda
Summary
Proteolytic regulation of the activity of cell-surface signalling systems of
Pseudomonas bacteria.
Cells are the ‘building blocks of life’. The human body is built from billions of cells that
specialize to perform dedicated functions (liver cells, heart cells, muscle cells, and so on). A
bacterium however only consists of a single cell, which is why we refer to it as a unicellular
organism. This one cell contains all the functions that the bacterium requires to survive
and multiply. Although bacteria have a bad name because some of them cause disease in
humans, animals and plants, they are of the utmost importance for life on earth. In fact,
the human body even contains ten times more bacterial cells than own cells! For example,
the millions of bacteria that we carry in our intestines are important for the digestion
of the food we eat. The genome of bacteria consists of many genes normally found on a
single circular DNA molecule that contains all the information required for the production
of the main functional components; proteins. However, protein production is an energyconsuming process and therefore some proteins are only made in conditions when the
protein is in fact needed. To accomplish this, bacteria contain several signal transduction
systems that allow them to sense the presence of specific signals in the environment and
respond to them by producing the required proteins. This thesis has focused on the study of
these kind of signal transduction mechanisms to better understand how bacteria are able
to sense and respond to their environment. We used a specific family of bacteria as model
organisms, called Pseudomonas. The best known member of this group is Pseudomonas
aeruginosa, which is an opportunistic pathogen and can cause serious infections in
susceptible hosts (including humans). In contrast, its close relative Pseudomonas putida
does not cause disease and is known for its capacity to colonise the root of plants, thereby
providing growth advantages.
All bacteria are surrounded by a cell wall that keeps the content, i.e. the cytosol where
the DNA is located, safe. This cell wall prevents the entry of damaging molecules such
as antibiotics or components of our immune system. In the case of bacteria of the genus
Pseudomonas, the cell wall is formed by two membranes (internal and external). The
space between these layers is called the periplasm. The inner membrane closes around
the inside (the cytosol) of the bacterium to tightly seal it, while the outer membrane is in
contact with the environment and functions as a permeability barrier that prevents free
entry of foreign molecules. Although these membranes are very important to protect the
bacteria, their presence complicates the uptake of essential nutrients that are required for
growth and multiplication, such as iron. Iron is crucial for the bacteria as it participates as a
cofactor in many enzymatic reactions without which the bacteria cannot survive. However,
due to its low solubility iron is only available in very low amounts in the environment or
in the (human) host, and therefore Pseudomonas produces and secretes compounds that
are able to bind iron with very high affinity. These compounds are called siderophores. In
addition, Pseudomonas bacteria are not only able to use their own siderophores but can
also steal siderophores produced by other bacteria with which they share a niche. Upon
binding of iron, siderophores can be recaptured by the bacterial cell and Pseudomonas
utilizes specialized receptors in the outer membrane for their recognition and entry. You
Summary/Samenvatting/Resumen
|
can view these outer membrane receptors as doors in the cell wall that only open with a
specific key. Pseudomonas bacteria can produce up to 40 different types of iron receptors.
However, these receptors are relatively large and their production costs a lot of energy.
Therefore, bacteria will only produce high amounts of these receptors if the specific signal
molecule (the siderophore) is present in its environment. The signal transduction systems
that enable the production of these receptors are referred to as cell-surface signalling
(CSS) and generally consist of three core components: the siderophore receptor (in the
outer membrane), an anti-sigma factor (in the inner membrane) and a sigma factor (in
the cytosol). In absence of the signal the anti-sigma factor binds the sigma factor and
keeps it in an inactive state. The presence of the inducing signal is recognized by the
outer membrane receptor, upon which a signalling cascade is initiated that results in the
release and activation of the sigma factor in the cytosol. Upon activation, the sigma factor
binds to certain areas on the bacterial DNA (called promoters) to induce the transcription
of specific genes. This results in the production of proteins required to respond to the
signal. Among these proteins is the outer membrane receptor that is necessary for both
recognition and transport of the signal molecule (siderophore).
To gain understanding in how bacteria are able to detect and respond to their environment,
in this thesis we have investigated how CSS signal transduction from the outside to the
inside of the bacterium takes place. To do this, we have focused on the role of the antisigma factor in this process, as it is a central component of the CSS system. It receives the
signal from the outer membrane receptor and transmits it to the cytosolic sigma factor to
allow activation. In Chapter 2 we have shown that anti-sigma factors are degraded (i.e. cut
up in pieces) in response to the signal by a process known as Regulated Intramembrane
Proteolysis (RIP), in which various proteases play a role (proteins with enzymatic activity
that can cleave other proteins). We have identified two proteases involved in this process:
Prc, which degrades the periplasmic part of the protein, and RseP, which cuts in the part
of the anti-sigma factor located in the inner membrane (known as the transmembrane
domain). These cuts result in the release and activation of the sigma factor in the cytosol,
and thus the production of the required proteins in response to the signal. In chapter 3
we showed that, independent of the presence of the signal, most anti-sigma factors are
already cut in two domains. Although the precise function of this initial cleavage event
remains unclear, our work has shown that it is necessary to correctly regulate sigma factor
activity in absence and presence of the signal. The remarkable aspect of this cleavage event
was that it did not require external protease, and that this process takes place through an
internal process in the anti-sigma factor. In chapter 4 we proposed that not enzymatic
activity, but a chemical sequence called an N-O acyl rearrangement was responsible for
this intrinsic cleavage event. In chapter 5 we performed a mutation analysis of an antisigma factor by randomly changing amino acids in the protein. In this way, we made
mutants with constant activity, regardless of the presence of the signal. This analysis has
enabled a greater understanding of the molecular mechanism behind the activation of the
CSS system and the role of the Prc and RseP proteases in this process. Finally, in chapter 6
we have analyzed an unusual CSS system involved in the regulation of virulence functions
in the pathogen P. aeruginosa. In contrast to all other reported CSS systems, this pathway
does not seem to respond to iron-chelating molecules but an as yet unidentified molecule
likely originating from the host. In fact, our work shows that the expression of this system
does not occur in iron-deficient conditions but during lack of inorganic phosphate.
173
&
174
|
Addenda
In short, the work described in this thesis has considerably advanced our knowledge of
the molecular mechanism that leads to Cell-Surface Signalling activation, and therefore
of how bacteria sense and respond to the environment. Our study has opened up many
new avenues for research on this important signal transduction system, which may have
potential biotechnological and clinical implications.
Samenvatting
Proteolytische regulatie van de activiteit van celoppervlakte signaleringssystemen
in Pseudomonas bacteriën.
Cellen zijn de ‘bouwstenen van het leven’. Het menselijk lichaam is opgebouwd uit miljarden
cellen, die zich specialiseren tot het uitoefenen van specifieke functies (bijvoorbeeld
levercellen, hartcellen en spiercellen). Een bacterie bestaat echter maar uit een enkele cel,
en daarom noemen we het ook wel een eencellig organisme. Deze cel bevat alle functies
die de bacterie nodig heeft om te overleven en zich te vermenigvuldigen. Hoewel bacteriën
een slechte naam hebben omdat sommige ziekte kunnen veroorzaken in mensen, dieren
en planten, zijn zij van groot belang voor het leven op aarde. Het menselijk lichaam bevat
zelfs tien keer meer bacteriële cellen dan eigen cellen! De miljarden bacteriën die we
meedragen in onze ingewanden zijn bijvoorbeeld erg belangrijk voor de vertering van het
voedsel dat we eten. Het genoom van bacteriën bestaat uit vele genen die op een enkel
circulair DNA molecuul zitten. Dit bevat alle informatie die nodig is voor de productie van de
belangrijkste functionele component: eiwitten. Eiwit productie kost echter veel energie en
daarom worden sommige eiwitten alleen gemaakt in specifieke omstandigheden wanneer
het eiwit nodig is. Om dit te bereiken bevatten bacteriën verschillende signaaltransductie
systemen die de bacterie in staat stelt de aanwezigheid van specifieke veranderingen in hun
omgeving waar te nemen en daarop te reageren door de vereiste eiwitten te produceren.
Dit proefschrift heeft zich gericht op de studie van deze signaaltransductie systemen om
beter te begrijpen hoe bacteriën op hun omgeving reageren. We hebben een specifieke
familie van bacteriën gebruikt als model organisme, genaamd Pseudomonas. Het meest
bekende lid van deze groep is Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische pathogeen
(ziekteverwekker) die ernstige infecties kan veroorzaken in vatbare gastheren (inclusief
de mens). De dicht verwante Pseudomonas putida, in tegendeel, veroorzaakt geen ziekte,
maar is bekend vanwege zijn capaciteit de wortels van planten te koloniseren en daarbij
groei van de plant te stimuleren.
Alle bacteriën zijn omgeven door een celwand, die de inhoud, oftewel het cytoplasma waar
het DNA zich bevindt, veilig houdt. De celwand voorkomt dat schadelijke invloeden van
buitenaf de cel binnendringen, zoals antibiotica of componenten van ons immuunsysteem.
De celwand van Pseudomonas bacteriën is opgebouwd uit twee membranen (de binnenen de buitenmembraan). De ruimte tussen deze twee lagen heet het periplasma. De
binnenmembraan sluit om het binnenste (het cytoplasma) van de bacterie en sluit deze
goed af, terwijl de buitenmembraan in contact staat met de omgeving en functioneert
als een barrière die het binnendringen van vreemde moleculen tegenhoudt. Hoewel
deze membranen erg belangrijk zijn in het beschermen van de bacterie, compliceert
hun aanwezigheid de opname van essentiële voedingsstoffen die vereist zijn voor groei
Summary/Samenvatting/Resumen
|
en vermenigvuldiging, zoals ijzer. IJzer is van cruciaal belang voor bacteriën, omdat het
nodig is voor vele enzymatische reacties zonder welke de bacterie niet kan overleven.
Door zijn slechte oplosbaarheid is ijzer echter maar in hele lage hoeveelheden aanwezig
in de leefomgeving van de bacterie, en daarom scheidt Pseudomonas verbindingen uit
die ijzer kunnen binden met erg hoge affiniteit. Deze noemen we ook wel sideroforen.
Pseudomonas bacteriën zijn niet alleen in staat de sideroforen te gebruiken die ze zelf
hebben geproduceerd, maar kunnen ook sideroforen stelen die zijn gemaakt door
andere bacteriën waarmee ze hun omgeving delen. Wanneer een siderofoor ijzer bindt
kan deze weer opgenomen worden door de bacterie door specifieke receptoren in de
buitenmembraan. De receptoren zijn verantwoordelijk voor de herkenning en opname
van de siderofoor. U kunt deze receptoren zien als deuren in de celwand die alleen open
gaan met een specifieke sleutel. Pseudomonas bacteriën kunnen wel 40 verschillende
siderofoor receptoren produceren. Maar deze eiwitten zijn vrij groot en hun productie
kost veel energie. Daarom produceren bacteriën deze eiwitten meestal alleen als het
specifieke molecuul (de siderofoor) aanwezig is in hun omgeving. De signaaltransductie
routes die de productie van siderofoor receptoren mogelijk maken noemen we in het
Engels ‘Cell-Surface Signalling (CSS)’ systemen en bestaan over het algemeen uit drie kern
componenten: een siderofoor receptor (in de buitenmembraan), een anti-sigma factor (in
de binnenmembraan) en een sigma factor (in het cytoplasma) (zie ook Figuur 1). De antisigma factor bindt aan de sigma factor in afwezigheid van het signaal en houdt deze in een
inactieve staat. De aanwezigheid van het signaal wordt opgemerkt door de receptor in
de buitenmembraan, waarop een proces wordt geïnitieerd dat leidt tot de bevrijding en
activatie van de sigma factor in het cytoplasma. Na activatie kan de sigma factor binden
aan specifieke gebieden op het bacteriële DNA (genaamd promotors) om de benodigde
genetische informatie uit te lezen. Dit resulteert in de productie van eiwitten die nodig zijn
om te reageren op de aanwezigheid van het signaal. Onder deze eiwitten is vrijwel altijd
ook de buitenmembraan receptor die nodig is voor zowel herkenning als transport van de
siderofoor.
Figuur 1. Schematische weergave van een
CSS systeem. Een dwarsdoorsnede van een
Pseudomonas bacterie is getekend met de
drie componenten van een CSS systeem: de
siderofoor receptor in the buitenmembraan,
de anti-sigma factor in de binnenmembraan
en de sigma factor in het cytosol.
Om te begrijpen hoe bacteriën hun omgeving
waarnemen en erop reageren hebben we in dit
proefschrift onderzocht hoe CSS signaaltransductie
plaatsvindt. Hiervoor hebben wij gefocust op de rol
van de anti-sigma factor in dit proces, aangezien dit
eiwit een centrale component is in het CSS systeem.
De anti-sigma factor ontvangt het signaal van de
buitenmembraan receptor en geeft deze door aan de
cytoplasmatische sigma factor om deze te activeren.
In hoofdstuk 2 hebben we laten zien dat anti-sigma
factoren worden gedegradeerd (in kleine stukjes
geknipt) als reactie op het signaal van buitenaf.
Dit gebeurt door een proces dat we in het Engels
kennen als ‘Regulated Intramembrane Proteolysis
(RIP)’, waarin verschillende proteasen (de scharen:
eiwitten met enzymatische activiteit die andere
eiwitten kunnen knippen) een rol spelen. We hebben
twee proteasen geïdentificeerd die betrokken zijn
175
&
176
|
Addenda
bij dit proces: Prc, die het periplasmatische deel van het eiwit degradeert, en RseP, die
in het deel van de anti-sigma factor knipt welke in het binnenmembraan is gelegen (ook
wel het transmembraan domein genoemd). Deze twee knippen leiden uiteindelijk tot het
loskomen en de activatie van de sigma factor in het cytoplasma, en daarmee de productie
van de vereiste eiwitten in reactie op het signaal. In hoofdstuk 3 hebben we laten zien
dat, onafhankelijk van de aanwezigheid van het signaal, de anti-sigma factor al in twee
delen wordt geknipt. Hoewel de exacte functie van deze initiële knip nog onduidelijk blijft,
heeft ons werk laten zien dat het nodig is om op een correcte manier de activiteit van de
sigma factor te reguleren in af- en aanwezigheid van het signaal. Het opmerkelijke aspect
van de initiële knip is dat het geen externe protease vereist, maar dat dit proces plaats
vindt door een interne reactie in de anti-sigma factor. In hoofdstuk 4 stellen we voor dat
de initiële knip niet plaats vindt door enzymatische activiteit, maar door een chemische
keten waarnaar we in het Engels verwijzen als een ‘N-O acyl rearrangement’. In hoofdstuk
5 hebben wij een mutatie analyse uitgevoerd van een anti-sigma factor door willekeurige
onderdelen te veranderen in dit eiwit. Op deze manier hebben wij mutanten gemaakt die
constant activiteit van de sigma factor opwekken, onafhankelijk van de aanwezigheid van
het signaal. Deze analyse heeft tot een beter begrip van het moleculaire mechanisme achter
de activatie van het CSS systemen geleid en ook van de rol van de Prc en RseP proteasen
daarin. Ten slotte hebben we in hoofdstuk 6 een uitzonderlijk CSS systeem geanalyseerd
dat een rol speelt in de regulatie van ziekteverwekkende functies in de pathogeen P.
aeruginosa. In tegenstelling tot alle andere CSS systemen die tot nu toe zijn onderzocht
lijkt dit proces niet geactiveerd te worden door ijzerdragers (sideroforen), maar door een
tot nu toe ongeïdentificeerd molecuul dat waarschijnlijk afkomstig is van de geïnfecteerde
gastheer. Ons werk heeft laten zien dat dit systeem geen rol speelt wanneer er een tekort
is aan ijzer, maar juist in condities met een tekort aan inorganisch fosfaat.
Samenvattend, het werk beschreven in dit proefschrift heeft een aanzienlijke bijdrage
geleverd aan onze kennis over het moleculaire mechanisme dat leidt tot de activatie van
Cell-Surface Signalling. Hierdoor begrijpen we beter hoe bacteriën hun omgeving opmerken
en hierop reageren. Onze studies hebben verschillende mogelijkheden opgeleverd voor
nieuw onderzoek naar deze belangrijke signaaltransductie systemen, welke potentiële
biotechnologische en klinische implicaties kunnen hebben.
Resumen
Regulación proteolítica de la actividad del sistema de señalización de la superficie
celular en bacterias del género Pseudomonas.
Las células son los “ladrillos de la vida”. Los humanos somos organismos pluricelulares que
estamos formado por miles de millones de células que se han especializado para realizar
funciones específicas en nuestro cuerpo (células del hígado, células del corazón, células
musculares, y así sucesivamente). Una bacteria, sin embargo, se compone de una única
célula, por lo que nos referimos a ella como un organismo unicelular. Esta célula bacteriana
contiene todas las funciones que la bacteria necesita para sobrevivir y multiplicarse. Aunque
las bacterias tienen una mala reputación debido a que algunas causan enfermedades en
humanos, animales o plantas, en realidad las bacterias son de suma importancia para la
Summary/Samenvatting/Resumen
|
vida en la tierra. De hecho nuestro cuerpo contiene diez veces más células bacterianas que
células humanas. Y esas células bacterianas realizan funciones muy importantes, como
por ejemplo los millones de bacterias que llevamos en nuestros intestinos son cruciales en
la digestión de los alimentos que comemos. El genoma de las bacterias está formado por
multitud de genes que normalmente se encuentran en una única molécula de ADN circular
que contiene toda la información requerida para la producción de los componentes
funcionales, es decir, las proteínas. La síntesis de proteínas es un proceso costoso que
consume energía y por tanto muchas proteínas sólo se producen en condiciones en las que
la función que realizan es necesaria. Para lograr esto, las bacterias contienen sistemas de
transducción de señales que les permiten detectar la presencia de señales específicas en el
medio ambiente y responder a ellas mediante la producción de las proteínas requeridas.
Esta Tesis doctoral se ha centrado en el estudio de estos mecanismos de transducción para
entender mejor como las bacterias son capaces de detectar y responder a su ambiente.
Como modelo se han utilizado bacterias que pertenecen al género Pseudomonas. El
miembro más conocido de este grupo es la bacteria Pseudomonas aeruginosa, que es un
patógeno oportunista y puede causar infecciones graves en hospedadores susceptibles
incluidos los humanos. Por el contrario, su pariente cercano Pseudomonas putida no causa
enfermedad, y esta bacteria es sobre todo conocida por su capacidad para colonizar la raíz
de las plantas favoreciendo así su crecimiento.
Todas las bacterias están rodeadas por una pared celular que mantiene su contenido, es
decir, el citosol donde se encuentra el ADN, seguro. Esta pared celular impide la entrada
de moléculas dañinas, tales como antibióticos o componentes de nuestro sistema inmune.
En el caso de bacterias del género Pseudomonas, esta pared celular está formada por dos
membranas, la interna y la externa, entre las que se encuentra un espacio que se conoce
como periplasma. La membrana interna se cierra alrededor del citosol de la bacteria
sellándolo herméticamente, mientras que la membrana externa está en contacto con el
medio ambiente y funciona como una barrera impermeable que impide la entrada libre
de moléculas del exterior al interior de la bacteria. Aunque estas membranas son muy
importantes para proteger a la bacteria, su presencia complica la obtención de nutrientes
esenciales que la bacteria requiere para su crecimiento y multiplicación, como por ejemplo
el hierro. El hierro es crucial para las bacterias ya que participa como cofactor en muchas
reacciones enzimáticas sin las que la bacteria no puede sobrevivir. Sin embargo, debido a
su baja solubilidad este nutriente sólo está disponible en el medio ambiente y en el cuerpo
humano en cantidades muy pequeñas. Para obtener hierro, las bacterias producen y
secretan unos compuestos llamados sideróforos que son capaces de unir hierro con mucha
afinidad. Además, las bacterias del género Pseudomonas son capaces de utilizar no sólo sus
propios sideróforos sino también muchos de los sideróforos producidos por otras bacterias
con las que convive como fuente de hierro. Una vez que han unido hierro, los sideróforos
son recapturados por la célula bacteriana, y para ello la bacteria utiliza unos receptores
de la membrana externa que se han especializado en el reconocimiento y transporte
de estos compuestos. Estos receptores pueden verse como puertas en la pared celular
bacteriana que sólo se abren con una clave específica. Pseudomonas es capaz de producir
más de cuarenta tipos diferentes de receptores para compuestos quelantes de hierro. Sin
embargo, estas proteínas receptoras son relativamente grandes y su producción supone
un gran gasto energético para la bacteria. Por tanto las bacterias sólo las producen en altas
cantidades cuando la molécula que transportan, es decir, el sideróforo, está presente en
177
&
178
|
Addenda
su entorno. El sistema de transducción de señales que permite la producción específica
de estos receptores se conoce como sistema de señalización de la superficie celular (CSS
por su nombre en inglés ‘cell-surface signaling’). Estos sistemas están formados por tres
componentes principales: el receptor en la membrana externa, un factor anti-sigma en
la membrana interna, y un factor sigma en el citosol. En ausencia de la señal inductora
del sistema el factor anti-sigma une al factor sigma manteniéndolo en estado inactivo.
En presencia de la señal (por ejemplo un sideróforo específico), esta es reconocida por el
receptor de la membrana externa que inicia una cascada de señalización que produce la
liberación y activación del factor sigma en el citosol. Tras su activación, el factor sigma se
une a determinadas zonas del ADN bacteriano (denominadas promotores) activando la
transcripción de genes específicos y por tanto la producción de las proteínas necesarias
para responder a la señal. Entre estas proteínas de respuesta se incluye el receptor CSS
que es necesario tanto para el reconocimiento como para el transporte de la molécula CSS
señal (sideróforo).
En este trabajo de Tesis doctoral hemos investigado cómo se produce la transducción
de la señal desde el exterior hasta el interior de la bacteria a través de los sistemas CSS
con el fin de conocer mejor como son capaces las bacterias de detectar y responder a su
medio ambiente. Para ello nos hemos centrado en el papel del factor anti-sigma en este
proceso ya que es el componente central del sistema CSS, es el que recibe la señal generada
por el receptor y la transmite al factor sigma permitiendo su activación. En el capítulo
2 hemos demostrado que la presencia de la señal produce la escisión de los factores
anti-sigma mediante un proceso conocido en inglés como ‘regulated intramembrane
proteolysis (RIP)’ en el que participan varias proteasas, es decir, proteínas con actividad
enzimática para cortar otras proteínas. Hemos identificado dos proteasas implicadas en
este proceso: Prc, que degrada la parte externa de la proteína y, RseP, que corta en la parte
del factor anti-sigma que se sitúa dentro de la membrana interna (y que se conoce como
dominio transmembrana). Estos cortes en el factor anti-sigma producen la liberación y
activación del factor sigma en el citosol, y por tanto la producción de las funciones de
respuesta a la señal. En el capítulo 3 hemos demostrado que la mayoría de los factores
anti-sigma ya están escindidos en dos dominios antes de que la señal CSS inductora esté
presente en el medio. Aunque la función concreta de este proceso de escisión inicial se
desconoce todavía, nuestro trabajo ha demostrado que es necesario para producir una
correcta respuesta a la ausencia y presencia de la señal. Además, cabe destacar que
hemos demostrado que este proceso de escisión inicial no requiere la acción de proteasas
externas, y que este evento se realiza mediante un proceso de autoescisión del factor
anti-sigma. En el capítulo 4 proponemos que esta autoescisión no se produce a través
de una actividad enzimática (proteasa) sino mediante una reacción química espontanea
conocida como reordenamiento NO acilo. En el capítulo 5 hemos generado multitud de
proteínas anti-sigma mutantes que producen la activación del factor sigma de manera
constitutiva, es decir, incluso en condiciones en las que la señal inductora no está presente.
Este análisis ha permitido un mayor conocimiento del mecanismo molecular que hay
detrás de la activación de los sistemas CSS y del papel que juegan las proteasas Prc y RseP
en este proceso. Por último, en el capítulo 6 hemos analizado un sistema CSS que está
implicado en la regulación de funciones de virulencia en el patógeno P. aeruginosa, y que
no responde a móleculas quelantes de hierro como los otros sistemas CSS estudiados
sino a una molécula señal del hospedador aun no identificada. De hecho, nuestro trabajo
Summary/Samenvatting/Resumen
|
179
muestra que la expresión de este sistema no se produce en condiciones de falta de hierro
sino por falta de fosfato inorgánico.
En resumen, el trabajo descrito en esta Tesis doctoral ha avanzado considerablemente
nuestro conocimiento sobre el mecanismo molecular que conduce a la activación de los
sistemas CSS bacterianos, y por tanto en cómo las bacterias perciben y responden a su
medio ambiente. Nuestro estudio ha abierto nuevas líneas de investigación sobre este
importante sistema de transducción de señales lo que tiene un gran potencial clínico y
biotecnológico.
&