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Universidade Federal de Pelotas
Disciplina de Genômica II
Prof. Dra. Fabiana Seixas
RNA de interferência
Delva Leão
Emily Nunes
Gabriela Debom
Jessica Plaça
Lucas Goedert
01/05/2011
Descoberta
• Prêmio Nobel de 2006
- 1990: Petúnias;
- 1993: C. elegans.
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
O que é o RNA de interferência?
Fita que se pareia ao mRNA
Ligação impede a tradução
Inibição da síntese proteica
RNA de interferência
• Mecanismo regulador da expressão gênica;
• Existe em muitos organismos;
• Classificação: microRNA (miRNA)
SiRNA
miRNA
MicroRNA
• Moléculas de RNA com aproximadamente 22
nucleotídeos;
• Incapazes de codificar proteínas;
• Função na regulação pós-transcricional;
• Degradação ou bloqueio na tradução de RNAs
mensageiros.
Biogênese
- Transcrição por RNA Polimerase II ou III;
- Pri-miRNA (várias nt), ação Drosha (RNase endonuclease III), cofator DGCR8/Pasha;
- Pre-miRNA (60 a 80 nt), auxílio da Exportin 5, cofator Ram-GTP;
Biogênese
- Pre-miRNA, sofre ação da Dicer (RNase III);
- MicroRNA (18-26 nt), associação ao Complexo de Indução de Silenciamento do Rna
(RISC) / Argonauta.
Biogênese
Características
• Ligam-se a região 3’ UTR do mRNA;
Degradação ou inibição?
- Quanto melhor o pareamento, maior a possibilidade de degradação do mRNA.
- Quando o microRNA aciona o mecanismo de clivagem do mRNA, após a clivagem, o
microRNA permacene intacto, podendo reconhecer e degradar outros mRNAs.
Localização Genômica
• Regiões intergênicas (42%)
- Possuem promotores e outros fatores de transcrição próprios.
Localização Genômica
• Regiões intragênicas (58%)
- Podem ser intrônicos ou exônicos;
- Compartilham o promotor do gene;
- São processados em uma rota metabólica diferente da excisão dos íntrons.
Características
• Cerca de 500 genes de microRNA (1-5%);
Na espécie humana
• Estimativa de 1000 genes;
Predição de genes.
Avaliação de sequências conservadas.
Análise de potencial estrutura loop.
Características
• Cada microRNA age em ,aproximadamente, 300
mRNA diferentes.
Características
• Cada mRNA pode sofrer intervenção de
diferentes microRNAs.
Características
.
- Grande parte dos miRNA são encontrados em genes parálogos
- 50% dos genes são encontrados próximos, sendo transcritos por única unidade de transcrição.
- Em casos excepcionais, podem ocorrer por promotores isolados.
Características
• Cerca de 20-30% dos genes codificantes podem
ser alvo de microRNA;
• São regiões altamente conservadas;
• Podem ser exportados para outras células;
siRNA
Small interfering RNA
Short interfering RNA
• de RNA fita dupla de aproximadamente 22 nucleotídeos
• Incapazes de codificar proteínas;
• Função na regulação pós-transcricional;
• Degradação ou bloqueio na tradução de mRNAs
mensageiros.
• Extremidade 3’ com 2 nucleotídeos livres
siRNA assimétrico
Biogênese
Biogênese
Pareamento
• Ligam-se a região 3’ UTR do mRNA
Características
• siRNA são produzidos a partir de dsRNA;
• dsRNA provém da síntese por vírus ou
sequências repetitivas introduzidas;
• Podem funcionar como:
▫ Defesa antiviral
▫ Silenciamento de mRNA
miRNA
siRNA
Origens Diferentes
• Molécula endógena (miRNA)
• Molécula exógena (siRNA)
RNAi
Diferenciação Espacial
Principais diferenças
Características
Principal modo de interação
siRNA
Clivagem do mRNA
miRNA
Inibição da transcrição
Origem Sintetizante
Exógena
Endógena ou Sintética
Conservação filogenética
Não
Sim
Estrutura Grampo
Sim
Sim
Estágio precursor no núcleo
Sim
Sim
Associação com
heterocromatina
Sim
Sim
Comprimento
18-26 nt
18-26 nt
Função em homeostase
Sim
Sim
Impacto na síntese de
proteínas
Indireto
Indireto
Potencial de utilização em
doenças
Desconhecido
Sim
RNAi nos Organismos
RNAi em células animais
Envolvidos em quase todos os processos celulares:
Tempo de desenvolvimento
Diferenciação celular
Silenciamento
Defesa antiviral
Apoptose
Transposon
Proliferação celular
Controle metabólico
RNAi em células animais
O papel biológico de cada RNAi ainda é incerto.
Organismo
Caenorhabditis
elegans
Caenorhabditis
elegans
Caenorhabditis
elegans
Caenorhabditis
elegans
Caenorhabditis
elegans
Caenorhabditis
elegans
Drosophila
melanogaster
Drosophila
melanogaster
Drosophila
melanogaster
Danio rerio
Mamíferos
Mus musculus
Homo sapiens
miRNA
Alvo de ação
regulação pós- transcricional negativo de
lin-14 e lin-28
lin-41, hbl-1 e o fator de transcrição daf-12,
pha-4
Função
Destino das células epidérmicas de L1 para L2
(passagem de fases larvais)
hbl-1
Passagem entre os estágios larvais L2 e L3
lsy-6
lsy-6,
miR-273
regulador negativo do cog-1
Assimetria esquerda- direita
regulador de die-1
Assimetria esquerda- direita
miR-84
miR-2a,
miR-2b,
miR-6,
miR-7
let-60
Desenvolvimento da vulva
E(spl)/bHLH e família Bearded
Sinalização Notch
bantam
hid
Controle do crescimento
miR-14
miR-430
miR-196
miR-375
miR-32
desconhecido
desconhecido
cliva HOXB8
mtpn
pfv-1
Morte celular programada
Neurogênese
Desenvolvimento embrionário
Secreção de insulina
Defesa viral
lin- 4
let-7
miR-48,
miR-84,
miR-241
Passagem do quarto estágio larval para adulto
RNAi em células animais
As sequências de miRNAs em animais geralmente são filogeneticamente
conservadas: cerca de 55% dos miRNAs de C. elegans tem homólogos com
humanos.
Pasquinelli et al., 2000
Isso auxilia na prova da evolução animal.
RNAi em células animais x vegetais
Os miRNAs de plantas e animais exercerem seu controle de formas
fundamentalmente diferentes sugerindo que os dois sistemas originaram-se
de forma independente.
Millar e Waterhouse, 2005
Organismo
Animal
Planta
Tamanho miRNA
miRNA mais curtos (20-22nt)
Ligação
Principal forma de
ação
Local de ação da
Dicer
Complementares ao site UTR 3
miRNA mais longos (21-24 nt)
Complementares as regiões codificadoras de
mRNAs
Repressão de tradução
Degradação do mRNA
Citoplasma
Núcleo
Presente
Ausente
Ausente
Presente
Presença do
complexo Drosha
Presença de Hen-1
Grau de
complexidade da
atuação do miRNA
Complexo - miRNAs tem muitos
alvos
Fácil - miRNAs tem pouco alvos
TargetScan, TargetScanS, miRanda,
Programas utilizados MovingTargets, PicTar e RNAhybrid MIRcheck, findMiRNA, Miru e PatScan
RNAi em células vegetais
Envolvidos nos seguintes processos celulares:
Desenvolvimento de estruturas
Mudança de fase
Estresse ambiental
Transdução
RNAi em células vegetais
O número de miRNA identificados em plantas é menor do que em animais.
Zhang et al., 2007
Organismo
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
Zea mays
miRNA
Alvo de ação
Função
Reprime tradução do AP2
Desenvolvimento da flor e
tempo de cultura
Liga-se ao mRNA que codifica domínio GRAS
ou proteína SCARECROW
Desenvolvimento padrão
radical da raiz, sinalização
de giberelina e sinalização
luminosa
miR 160,
miR 167a
Liga-se ao mRNA que codifica ARFs
Diferenciação e divisão
celular; e alongamento
das células
miR 164a
Liga-se ao mRNA que codifica o domínio NAC
e CUC2
Formação de broto
meristemático apical
Reprime tradução do gossy15
Desenvolvimento da flor e
tempo de cultura
miR 172
miR 170,
miR 171
miR 172
RNAi em células vegetais
As sequências de miRNAs em vegetais também apresentam segmentos
filogeneticamente conservados.
Axtell e Bartel, 2005; Zhang et al, 2006
http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2164-10-558.pdf
RNAi em fungos?
A maioria dos fungos pode passar por dois tipos de silenciamento:
Quelling e MSUD.
Quelling – parecido com o mecanismo de formação de RNAi em plantas
ou animais (dependente de Argonauta e Dicer), entretando se dá pelo
processo de co- supressão.
Maquinaria celular percebe a possibilidade de superexpressão de um gene
(por mRNA) e gera o desligamento desse (por RNAi) evitando caos celular.
Silenciamento Meiótico por DNA Não Pareado (MSUD) – Durante o
processo de meiose fúngica, pode ocorrer a supressão de um gene em
um dos oito cromossomos. Uma vez que há um gene não pareado,
aquele que deveria com ele parear será suprimido também. O curioso
desse processo é que todas as cópias desse gene em todo material
genético disposto serão silenciadas podendo gerar proles extremamente
distinta das originárias.
Cromossomos separam-se na metáfase da meiose para formar células haploides e em
seguida passam por um processo de mitose pós- meiótica gerando 8 cromossomos
haplóides.
RNAi em fungos?
Fungos Neurospora crassa
em diferentes estágios de
desenvolvimentos
expressando o gene de
interesse, histona H1 (hH1GFP, em verde)
Ao passar pelo processo
meiótico seguido da mitose
pós meiótica, ocorre a
supressão dos genes por
MSUD (indicados pela seta).
Fotos: Namboori B. Raju, Stanford University.
RNAi em bactérias e arqueas?
“Descobrimos que existem um homólogo de Hen1 em bactérias, porém
estas não produzem RNA de interferência. Portanto, nós estamos
muito curiosos para descobrir no que o Hen1 bacteriano atua“.
Raven H. Huang, 2009
crRNA
Curtas Repetições Palindrômicas Intercaladas Regularmente em Cluster
(CRISP) que possuem entre 24 a 48 pb.
Streptococcus pyogenes, também chamada de Streptococcus GrupoA (the flesh eating bacterium)
cultivada em meio sólido (picture by Krzysztof Chylinski, Laboratory of Emmanuelle Charpentier)
RNAi e Doenças
RNAi e Doenças
• Desordens genéticas dominantes;
• Baixa especificidade de terapias atuais;
• SNPs geram falta de seletividade;
• Novas abordagens à terapêutica clássica;
• Promessa em resposta ao resfriamento da industria
farmacêutica;
• Alta especificidade e potência atrai grande interesse ao
RNAi:
“RNAi-based therapeutic strategies for metabolic disease.”
•
•
•
•
Lipídeos transportadores de siRNA;
“Self delivery”;
Inflamação do tecido adiposo;
Microesferas de glucano;
“MicroRNA-like antivirals”
•
•
•
•
•
Sequências antivirais expressas em miRNA;
Preocupação com miRNA antiviral mimético;
Desafio no delivery;
Lentivírus recombinantes;
Implicações do uso terapêutico;
“Design of functional small interfering RNAs targeting
amyotrophic lateral sclerosis-associated mutant alleles.”
•
•
•
•
RNAi e esclerose amiotrófica lateral;
Design de siRNA e estratégia de assimetria;
Mismatch da fita antisenso de siRNA;
Silenciamento eficaz dos alelos mutantes SOD1.
“Discrimination of Parkinson-associated LRRK2 alleles by
introduction of a single nucleotide mismatch into siRNA.”
• Proteína rica em leucina quinase2 (LRRK2) e doença de Parkinson
(DP);
• Padrão de mutação G2019S;
• siRNAs artificiais com mismatch;
• ASP-RNAi e alelos associados com DP.
RNAi em câncer
Cerca de 50% dos genes miRNA localizam- se em regiões genômicas frágeis
ou associadas ao câncer, atuando em oncogenes ou genes supressores
tumoral.
Calin et al., 2004
miRNA
let-7
Alvo de ação
Regula negativamente oncogene
RAS
Função
Inibe o crescimento e diferenciação
de células pulmonares tumoral
miR-15a, miR-16
Regula negativamente oncogene
BCLl-2
Inibe a apoptose
mir-17, mir-18,
mir-19a, mir-92-1
Desconhecido
Tumorogênese
miR-17-92 cluster
Regula negativamente E2F1 e Rb
Inibe a proliferação celular
miR-21
Regula negativamente PTEN
Ativa a apoptose
miR- 372, miR-373
Regula negativamente LATS2
Ativa proliferação celular
RNAi em câncer
Cada tecido canceroso apresenta expressão alterada de miRNAs podendose utilizar isso como uma assinatura específica de cada câncer.
Lu et al., 2005
Ryazansky e Gvozdev, 2008
RNAi em câncer
Uso terapêutico- Fármacos
Ativação/Inativação do RNA de interferência:
• Câncer:
• Esquistossomose;
• AIDS;
• Febre amarela;
• Hepatite C e B;
• Doenças neurodegenerativas;
• Senescência...
Inativação de genes
Uso terapêutico- Novas tecnologias
• Empecilho: ausência nas bactérias mais utilizadas;
Fragilidade dos fragmentos;
Criação de moléculas híbridas DNA-RNA;
Nanopartículas transportadoras;
Partículas lipídicas transportadoras.
Uso terapêutico- Empresas
• Escasso resultado nas pesquisas:
Empresas que
continuam fazendo
investimentos em
iRNA
Uso terapêutico- Transgênese em
plantas
Outras aplicações
Bioinformática:
Auxílio na escolha das sequencias de mRNA específicas;
Bancos de dados;
http://www.mirbase.org/
http://www.microrna.org/microrna/home.do
Outras apliacações
Prospecção de novos microRNA´s
Genes homólogos de conhecidos miRNA;
Loops próximos a regiões de miRNA ou não;
http://genes.mit.edu/mirscan/
Outras aplicações
Genômica funcional:
Outras aplicações
Produção de modelos animais (“knock-down”)
Referências
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http://www.microrna.ic.cz/mirna4.html#MicroRNA Genes and Their Transcription
http://www.nature.com/nrd/journal/v6/n6/fig_tab/nrd2310_F1.html
http://www.microrna.ic.cz/
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-84782011000100014
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0004-27302006000600018&script=sci_arttext
Ihttp://www.nature.com/nrg/journal/v5/n8/pdf/nrg1415.pdf
Ittp://www.nature.com/nrm/journal/v6/n5/pdf/nrm1644.pdf
http://www.sabiosciences.com/pathway7.php
ttp://www.sciencenews.org/view/feature/id/62051/title/Cancer%E2%80%99s_little_helpers
http://www.news-medical.net/health/MicroRNA-Cellular-Functions-%28Portuguese%29.aspx
http://www.sabiosciences.com/pathway7.php
http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2164-10-558.pdf
http://protein.bio.msu.su/biokhimiya/contents/v73/full/73050640.html
http://www.wikigenes.org/e/gene/e/827839.html
http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio17/17_docg.pdf
http://www.mims.umu.se/en/news/1379-when-bacteria-get-the-flu-and-sharpen-their-knivesscientists-identify-a-novel-pathway-to-activate-the-bacterial-immune-system-.html
http://www.sciencedaily.com/releases/2009/10/091012225811.htm
http://www.microrna.ic.cz/mirna4.html