Download Slide 1 - Busca Rio

Potenciais aplicações da proteômica à entomologia
Richard Hemmi Valente e José Roberto da Silva
Dogma central
DNA
RNA
PROTEIN
1970 – Francis Crick and James Watson – Linhas sólidas indicam
sentido da transferência de informação em todas as células. Linhas
pontilhadas indicam transferência em casos especiais.
“Dogma” central
DOGMA
“Proposição apresentada como incontestável e
indiscutível.”
Dicionário Michaelis
“… that a dogma was an idea for which there was no
reasonable evidence.”
Francis Crick
The eighth day of creation - Makers of the revolution in biology
Horace Freeland Judson
Riedel, K. (2006)
Fields, S. Science (2001) 291(5507):1221.
Riedel, K. (2006)
Para que proteômica ?
• Anotação do genoma
• “Um gene, uma proteína”
• Função da proteína
• Modificações pós-traducionais
• Localização e compartimentalização
• Interações proteína-proteína
Riedel, K. (2006)
Jensen, O.N. Nature Reviews in Mol Cell Biol (2004) 7:391.
Jensen, O.N. Nature Reviews in Mol Cell Biol (2004) 7:391.
GENOMA - Conjunto de DNA
~ 25.000 genes H. sapiens
Stein, L.D. Nature (2004) 431: 915.
TRANSCRIPTOMA - Conjunto de mRNAs
mRNA - 150.000 representantes (x6)
PROTEOMA - equivalente protéico do genoma
PROTEÍNA - 1.500.000 (x 10)
Marc Wilkins
Siena Itália Setembro 1994
“ all proteins expressed by a genome, cell or tissue”
PROTEINOME
PROTEOME
PROTOME
1o Conceito de Proteoma
Proteômica
Estudo sistemático de muitas e diversas
propriedades das proteínas numa forma
paralela, com o objetivo de fornecer uma
detalhada descrição da estrutura, função
e controle dos sistemas biológicos na
saúde e na doença.
Scott Patterson and Ruedi Aebersold, Nature Genetics, 2003.
Heráclito
“Não podemos entrar duas vezes no mesmo rio, porque, ao
entrarmos pela segunda vez, não serão as mesmas águas que
estarão lá, e a pessoa mesma já será diferente.”
Técnicas Proteômicas
Sensibilidade
Reprodutibilidade
Rapidez
Facilidade
Automação
Baixo custo
Intervalo Dinâmico – Dynamic range
Molecular & Cellular Proteomics (2002), 1:845-867.
O TRABALHO DE O’FARRELL
(estudante de pós-graduação de 25 anos em 1975)
(biologia do desenvolvimento de volvox)
2D-PAGE / PRIMEIRA DIMENSÃO
(focalização isoelétrica)
Proteínas são moléculas anfotéricas
pH < pI
pH = pI
pH > pI
2D-PAGE / PRIMEIRA DIMENSÃO
(focalização isoelétrica)
FITAS DE IPG DISPONÍVEIS COMERCIALMENTE
2.5-12
A. Görg
Géis com 3 mm largura / 0,5 mm espessura (4% T e 3% C)
EQUILÍBRIO DAS FITAS APÓS A 1a DIMENSÃO
Tampão de equilíbrio
Tris-HCl 50 mM pH 8,8
6 M uréia
30 % glicerol
2 % SDS
0,002 % BFB
I.
10 mL de tampão + 100 mg DTT por 15 minutos
II.
10 mL de tampão + 400 mg iodoacetamida por 15 minutos
2D-PAGE / SEGUNDA DIMENSÃO
(SDS-PAGE)
Laemmli, U.K.
Nature (1970) 227: 680-685
Schägger, H. and von Jagow, G.
Anal. Biocehm. (1987) 166: 368-379
Não há necessidade de stacking gel
Condições elétricas (géis 1 mm)
2,5 W / gel por 30 minutos
100 W constantes até o final
(4-5 horas p/ 6 géis)
CURRENT LIMITATIONS FOR 2DE-MS...
200-10 kDa
pH 2,5 - 12
Working range of 2DE
Identificando a proteína contida no spot
Digestão
proteolítica
Espectrometria
Fragmentos proteolíticos
Descoloração
Redução e alquilação
Desidratação do gel
Rehidratação do gel
digestão com tripsina
Digestão
proteolítica
Fragmentos proteolíticos
Extração dos
peptídeos
CROMATOGRAFIA
MULTIDIMENSIONAL (MUDPIT)
Proteoma de Saccharomyces cerevisiae
Por MudPIT – 1.484 proteínas identificadas
Nature Biotechnology 19:242 (2001)
CROMATOGRAFIA
MULTIDIMENSIONAL (MUDPIT)
Espectrometria de Massas
Sensibilidade
picomol (10-12) femtomol (10-15) attomol (10-18) zeptomol (10-21)
10 kDa - 1 picomol são 0,01g
Massa
1 até 106 Da
Espectrometria de Massas
Estudo de ÍONS em fase GASOSA
Abundância x m/z
Espectrometria de Massas
Fonte de ionização
MALDI
ESI
Analisador de massas
TOF
TOF-TOF
Q-TOF
ION TRAP
LINEAR TRAP-ORBITRAP
LINEAR TRAP-FT-ICR
Detector de íons
Ionização por MALDI
Favorece a formação de íons de carga simples (+1)
Hoffmann de, E. & Stroobant, V. (2001) in Mass Spectrometry: Principles and Applications.
Ionização por ESI (ElectroSpray Ionization)
Gaskell, S.J. (1997) J. Mass. Spectrom. 32:677-688.
Ionização por ESI (ElectroSpray Ionization)
Gaskell, S.J. (1997) J. Mass. Spectrom. 32:677-688.
Ionização por ESI (ElectroSpray Ionization)
Favorece a formação de íons de cargas múltiplas (+n)
Analisadores em tandem – MS/MS ou MSn
Aebersold, R. & Mann, M. (2003) Nature, 422:198-207.
Modo de operação MS
Analisador 1
Analisador 2
Peptídeos
trípticos
Câmara de
colisão.
Detector
m/z
Adaptado de CEGB, Havana, Cuba.
Modo de operação MS/MS
Analisador 1
Analisador 2
Peptídeos
trípticos
Câmara de colisão
(sem gás)
Detector
m/z
Adaptado de CEGB, Havana, Cuba.
Modo de operação MS/MS
Analisador 1
Analisador 2
Peptídeos
Gás inerte
trípticos
Câmara de colisão
(com gás)
(precursor)
Detector
m/z
Adaptado de CEGB, Havana, Cuba.
Identificação de proteínas
1 – Peptide mass fingerprinting (PMF)
2 – MS/MS ion search
3 – Peptide sequence tag
4 – Seqüenciamento de novo (manual ou in silico)
5 – Homologia (MS-Blast ; MS-Homology)
Vai que é sua, Beto!!!
Manipulação pelo parasita
Thomas, F. Behavioural Processes (2005) 68:185.
-Estratégia de transmissão – O parasita aumenta suas chances de
transmissão através da alteração do comportamento do hospedeiro.
-“Extended phenotype …” (1982) Richard Dawkins
“Genes de um organismo (parasita) têm efeitos fenotípicos sobre outro
organismo (hospedeiro)”
? Efeito direto x Efeito indireto ?
PROTEÔMICA !
(Contínuo)
(Pontual)
Hemolinfa
Nemobius sylvestris – grilo + Paragordius tricuspidatus – verme
Cópula e desenvolvimento inicial do verme ocorrem em ambiente aquático.
Hospedeiros infectados com vermes “maduros” apresentam comportamento atípico na primeira parte da noite: eles procuram por água e nela
mergulham.
Apenas grilos (cabeças) machos infectados com apenas um verme macho foram
utilizados nos ensaios proteômicos.
Grilos
DM (During Manipulation)
Grilo infectado pronto para pular, entre 10 PM e 1 AM;
CN (Control Night)
Grilo não-infectado que estava na floresta entre 10 PM e 1 AM;
BM (Before Manipulation)
Grilo infectado (DM) e mantido em terrário até dia seguinte quando foi
dissecado entre 1 PM e 3 PM;
CD (Control Day)
Grilo não-infectado que estava na floresta (CN) e foi mantido até dia
seguinte em terrário quando foi dissecado entre 1 PM e 3 PM;
AM (After Manipulation)
Grilo previamente infectado coletado assim que verme sai.
Vermes
DM* (During Manipulation)
Verme de Grilo infectado pronto para pular, entre 10 PM e 1 AM;
BM* (Before Manipulation)
Verme de Grilo infectado (DM) e mantido em terrário até dia seguinte quando foi
dissecado entre 1 PM e 3 PM;
AM* (After Manipulation)
Verme de Grilo previamente infectado 1 h (mantido em água) após sair
do hospedeiro.
DM
DM*
CONCLUSÕES