Download DAFTAR ISI - STPP Bogor

ISOLASI DAN KARAKTERISASI
SENYAWA ANTIBAKTERI BACILLUS SUBTILIS T4
ISOLAT LAPANGAN
Laporan Penelitian
Oleh
Dr. drh. Endang Endrakasih, MS
PROGRAM STUDI PENYULUHAN PETERNAKAN
JURUSAN PENYULUHAN PETERNAKAN
SEKOLAH TINGGI PENYULUHAN PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ABSTRAK
ENDANG ENDRAKASIH. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Bacillus
subtilis T4 Isolat Lapangan. Dibimbing oleh FACHRIYAN HASMI PASARIBU, I
WAYAN TEGUH WIBAWAN dan BIBIANA W. LAY.
Lebih dari seribu mikroorganisme yang termasuk bakteri, aktinomises,
jamur dan protozoa mempunyai potensi untuk menghasilkan antibiotika. Jamur
Penicillium notatum penghasil penisilin yang mencemari laboratorium Fleming
tahun 1928 yang diduga sebagai pencemar asal udara dan galur-galur tertentu
Bacillus subtilis juga menghasilkan antimikroba. Jamur dan bakteri ini berasal
dari tanah.
Tujuan penelitian ini adalah melakukan pengkajian senyawa antibakteri
yang dihasilkan oleh B. subtilis yang diisolasi dari susu sapi perah penderita
mastitis subklinis. Pengkajian yang dilakukan meliputi produksi, spektrum
hambatan, dan karakteristik senyawa antibakteri. Seleksi bakteri penghasil
senyawa antibakteri dilakukan pada 120 isolat. Seleksi dilakukan dengan metode
hambat langsung (direct inhibition method) dengan cara stab inoculation pada
lernpeng agar darah. Bakteri indikator yang digunakan adalah Micrococcus
luteus.
Produksi senyawa antibakteri dilakukan pada media cair nutrient broth.
Pemanenan dilakukan pada jam ke 18 inkubasi. Suhu inkubasi 37°C. Pemurnian
dilakukan dengan metode presipitasi protein antibakteri dengan garam. Garam
yang digunakan adalah amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 90%. Protein
antibakteri yang diperoleh kemudian difraksinasi dengan metode filtrasi gel
modifikasi menggunakan Sephadex G 75 yang dipasang pada HPLC (High
Performance Liquid Chromatography). Sebagai fase gerak (mobile phase)
digunakan Na2 HP04.
Karakterisasi senyawa antibakteri dilakukan pada supernatan aktif dan
protein murni. Karakterisasi yang dilakukan meliputi spektrum hambatan dengan
metode difusi sumur, ketahanan terhadap suhu dan lama pemanasan, pH, enzim
proteolitik, amilase, lipase, pelarut organik, serta bobot molekul.
Hasil seleksi terhadap 120 isolat menunjukkan 9 isolat mempunyai aktivitas
hambatan terhadap M. luteus dengan potensi yang bervariasi. Aktivitas hambatan
paling tinggi ditunjukkan oleh isolat berkode T4. Setelah dilakukan identifikasi
secara biokimiawi isolat ini adalah Bacillus subtilis, sehingga selanjutnya isolat ini
disebut Bacillus subtilis T4.
Senyawa antibakteri yang diproduksi oleh B. subtilis T4 ini menghambat M.
luteus, Bacillus megaterium dan Salmonella enteritidis. Supernatan aktif yang
berasal dari biakan B. subtilis T4 dengan kepadatan 105/ml mampu menghambat
M luteus dengan kepadatan 106/ml. Daya hambat protein antibakteri terhadap
M luteus dengan konsentrasi 106/ml adalah 30 ug/ml untuk fraksi 1 dan 10 ug/ml
untuk fraksi 2. Produksi protein antibakteri dimulai pada jam ke7 setelah inkubasi
pada 37°C dan mencapai konsentrasi tertinggi pada jam ke 18. Supernatan aktif
dan protein antibakteri murni tetap aktif pada pemanasan 50°C selama 20 menit,
tahan pada pH 5-11, dapat diinaktivasi oleh enzim papain murni dan crude
protease, tidak dapat diinaktivasi oleh enzim lipase, amilase, dan pelarut organik.
Bobot Molekul (BM) protein antibakteri adalah 19,5 kDa untuk fraksi 1 dan 36
kDa untuk fraksi 2.
i
ABSTRACT
ENDANG ENDRAKASIH. Isolation and Characterization of the Antibacterial
Substance Produced by Wild Isolate of Bacillus Subtilis T4. Under the direction of
FACHRIYAN HASMI PASARIBU, I WAYAN TEGUH WIBAWAN and
BIBIANA W. Lay.
More than one thousand microorganisms including bacteria, actynomices,
fungi, and protozoa have the potency to produce antibiotics. Penicillium notatum
that produces penicillin and some strains of Bacillus subtilis are the examples of
soil microorganisms that produced antimicrobe substances.
This research might give a basic information in producing, isolating, and the
characteristic of the antibacterial substance produced by B. subtilis from
subclinical mastitis milk. One of one hundred and twenty isolates collected from
subclinical mastitis milk was selected and studied. Selection method used was
direct inhibition method with stab inoculation in blood agar plate. Micrococcus
luteus was used as indicator bacteria.
Antibacterial substance was produced by cultivating the chosen isolate in
nutrient broth at 37°C for 18 hours. This culture was centrifuged and the
supernatant obtained called as active supernatant.
As the antibacterial substance was considered as protein, the antibacterial
isolation method used was salt precipitation method using ammonium sulphate
90% w/v. The dried precipitate was then purified using modified gel filtration
method set up in HPLC apparatus. Sephadex G 75 was used as stationary phase
and NaH2P04 as mobile phase.
Characterization was performed to study the effect of heat, pH, enzymes,
and organic solvents on bacterial activity, inhibitory spectra, and the molecular
weight of the antibacterial substance. Enzymes used were proteolytic, glucolytic,
and lipolytic enzymes.
Nine of 120 isolates were able to inhibit the growth of M. luteus and one of
them, namely isolate T4 had the greatest potency. This isolate was identified
biochemically as Bacillus subtilis, so the isolate was then called Bacillus subtilis
T4.
The antibacterial substance produced by B. subtilis T4 was able to inhibit
the growth of M. luteus, Bacillus megaterium, and Salmonella enteritidis. The
active supernatant of 105/ml B. subtilis suspension was able to inhibit the growth of
106/ml M. luteus suspension, while 30 μg/ml of fraction 1 and 10 μg/ml of fraction
2 purified protein were able to inhibit the growth of 106/ml M. luteus. The
antibacterial substance was produced 7 hours after incubation at 37°C and
optimum production obtained 18 hours after incubation at the same temperature.
Both active supernatant and antibacterial protein were still active following
heating process at 50°C for 20 minutes. The active supernatant and antibacterial
protein were active at pH 5-11. Purified papain and crude protease were able to
destroy the inhibitory activity. Molecular weight of the antibacterial protein was
19.5 kDa ( fraction 1 ) and 36 kDa (fraction 2).
ii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
kasih dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan penelitian
yang berjudul : “Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Bacillus Subtilis
T4 Isolat Lapangan” ini.
Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ketua Sekolah Tinggi
Penyuluhan Pertanian Bogor, Ir. M. Nazaruddin, MM. dan Kepala Unit Penelitian
dan Pengabdian kepada masyarakat yang telah memberikan kesempatan kepada
penulis untuk melakukan eksplorasi potensi bakteriosin untuk kepentingan
pengobatan.
Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Agus Somantri
S.Pd. (Laboratorium bakteriologi FKH IPB) yang telah banyak membantu penulis
selama penelitian, Bapak Kosasih (Bagian Khromatografi – Laboratorim Kimia
Terpadu IPB) yang telah banyak memberikan kemudahan dan bantuan, Ibu Prof.
Dr. Ir. Maggy T. dan Ibu Ika (Laboratorium Biokimia dan Mikrobiologi – Pusat
Penelitian Bioteknologi IPB) yang telah banyak membantu dan bahkan
menyumbangkan beberapa enzim proteolitik kepada penulis, Ibu Iis dan Ibu Merry
dari Laboratorium Biokimia FMIPA-IPB yang telah membantu sentrifugasi selama
penelitian ini berlangsung.
Ucapan terimakasih penulis sampaikan sampaikan kepada Dr. drh.
Darminto sebagai kepala Balai Besar Penelitian Veteriner yang telah memberikan
ijin dilaksanakannya sebagian penelitian ini di Laboratorium Mikrobiologi dan
Balitvet Culture Collection dan kepada Ibu Sri Poernomo, B.Sc., ibu drh. Tati
Aryanti, MS., ibu Tuti, ibu Emi dkk. Dari bagian perpustakaan Balitvet yang telah
banyak membantu memberikan kemudahan dan bantuan kepada penulis.
Eksplorasi terhadap bakteriosin (senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh
mikroba) penting dilakukan mengingat keunggulan bakteriosin ini diantaranya :
1. Menjanjikan untuk mengatasi infeksi oleh bakteri yang resisten terhadap
antibiotik sintetis,
2. Target bakterisidalnya spesifik,
3. Toksisitasnya rendah
Semoga tulisan ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2013
Endang Endrakasih
iii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL …………………………………………………………….
v
DAFTAR GAMBAR …………………………………………………………
vi
DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………………
vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ..................................... ....................................................
Tujuan .................................................. ....................................................
Manfaat Penelitian ............................... ....................................................
Hipotesis ............................................... ....................................................
1
3
3
4
TINJAUAN PUSTAKA
Sejarah .......................................................................................................
Definisi dan Klasifikasi Bakteriosin .........................................................
Biosintesis Bakteriosin ..............................................................................
Spektrum dan Mekanisme Kerja Bakteriosin ...........................................
Produksi dan Pemurnian Bakteriosin ........................................................
Karakterisasi Bakteriosin ………………………………………………...
Potensi dan Aplikasi Bakteriosin ...............................................................
5
6
7
10
17
20
23
BAHAN DAN METODE
Bahan ..........................................................................................................
Alat ............................................................................................................
Metode .......................................................................................................
25
26
27
HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi Isolat Penghasil Senyawa Antibakteri ..............................................
Identifikasi Isolat ……………………………………………………………
Produksi Senyawa Antibakteri ……………………………………………..
Karakterisasi Senyawa Antibakteri ………………………………………..
33
33
33
35
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan ………………………………………………………………..
Saran ………………………………………………………………………
45
45
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………….
46
LAMPIRAN ……………………………………………………………………
56
iv
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Persentase isolat klinis Streptococcus pneumoniae yang resisten
terhadap penisilin ................ .....................................................................
2
2. Perbedaan bakteriosin dan antibiotik ........................................................
6
3. Efek biokimia bakteriosin Gram positif terhadap sel sensitif ............ . …
12
4. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktifitas senyawa antibakteri
B. subtilis T4 ...................................................................................................... .
37
5. Spektrum hambatan senyawa antibakteri B. subtilis T4 terhadap
beberapa bakteri indikator ................................................................................. .
41
6. Komposisi asam amino protein antibakteri B. subtilis T4 ………………………
43
v
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Model hipotetis biosintesis dan ekskresi molekul pediocin AcH
…………………………………………………………………….. .
9
2. Mekanisme kerja molekul bakteriosin menembus membran sel ... . …..
14
3. Hambatan pertumbuhan supernatan aktif B. subtilis T4
terhadap bakteri indikator M. luteus dari jam ke jam selama 24
Jam ........................................ …………………………………………
34
4. Kurva pertumbuhan dan perubahan pH suspensi B. subtilis T4………..
34
5. Berat molekul fraksi 1 dan 2 protein antibakteri B. subtilis T4
hasil fraksinasi dengan gel filtrasi modifikasi ................................ . …..
36
6. Hambatan pertumbuhan fraksi protein antibakteri B. subtilis T4
terhadap M. luteus ........... ...................... ………………………………
36
7. Aktivitas hambatan supernatan aktif, fraksi 1 dan 2 protein
antibakteri B. subtilis T4 pada pH 1-13 ..........................................……
39
8. Aktivitas hambatan supernatan aktif, fraksi 1 dan 2 protein
antibakteri B. subtilis T4 akibat pengaruh enzim ............................ ……
40
vi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
Jumlah amonium sulfat yang diperlukan untuk pengendapan
protein pada berbagai tingkat kejenuhan ..............................................
57
Kandungan bahan dalam gel pemisah dan gel penahan untuk
elektroforesis dengan SDS-PAGE …………………………………….
58
Hasil identifikasi biokemis isolat T4 …………………………………..
59
Untuk mendapatkan informasi
lebih lengkap, silahkan
menghubungi Sekretariat
Website
Contact Person : 087873183123
vii